石榴組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究進(jìn)展

趙玉潔,譚 彬,李洪濤,胡青霞,季亞萍,司曉麗,趙 乾,陳延惠*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,河南 鄭州 450002； 2.鄭州市城市園林科學(xué)研究所,河南 鄭州 450003)

石榴組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究進(jìn)展

趙玉潔1,譚 彬1,李洪濤2,胡青霞1,季亞萍1,司曉麗1,趙 乾1,陳延惠1*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,河南 鄭州 450002； 2.鄭州市城市園林科學(xué)研究所,河南 鄭州 450003)

石榴為多年生木本植物，且遺傳背景較為復(fù)雜。隨著生物技術(shù)的發(fā)展與運用,組織培養(yǎng)與基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)結(jié)合的方法將成為石榴育種的新途徑。從石榴組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化兩方面分別綜述外植體的選擇、愈傷組織的誘導(dǎo)和分化,以及遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法、所用基因類型和抗生素種類、轉(zhuǎn)化植株的鑒定方法等,并對石榴遺傳轉(zhuǎn)化研究前景進(jìn)行展望。

石榴； 組織培養(yǎng)； 遺傳轉(zhuǎn)化

石榴(PunicagranatumL.)屬桃金娘目石榴科(Punicaceae)石榴屬(PunicaL.)植物，原產(chǎn)伊朗、阿富汗等中亞地區(qū)，現(xiàn)已在中國、印度、突尼斯、美國等30多個國家種植。石榴在我國已有2 000多年的栽培歷史，以山東嶧城區(qū)、四川會理、云南蒙自、河南滎陽為主產(chǎn)區(qū)。石榴因具有較高的生態(tài)價值、經(jīng)濟(jì)價值、營養(yǎng)價值、醫(yī)藥價值和保健功能，日益受到消費者的青睞，其產(chǎn)量、消費量和種植面積逐年增加，國內(nèi)外石榴產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展。目前，各國對石榴相關(guān)產(chǎn)業(yè)的開發(fā)力度也較大，如化妝品中所含石榴提取精華、石榴果汁及各種石榴酒等。無論作為食物或藥材，石榴均有較好的研究價值和廣闊的開發(fā)前景。近年來，國內(nèi)外研究者對石榴的研究報道[1-5]越來越多，但國內(nèi)關(guān)于石榴遺傳轉(zhuǎn)化研究方面的文獻(xiàn)并不多。鑒于此，對石榴組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究進(jìn)行綜述，以期為石榴分子育種的研究發(fā)展提供參考。

1 石榴組織培養(yǎng)研究

1.1 外植體的選擇

最早關(guān)于石榴組織培養(yǎng)的報道可追溯至1987年，Omura等[6]以石榴葉片為外植體獲得再生植株。之后，國內(nèi)外對石榴組織培養(yǎng)技術(shù)以及再生體系的建立相繼進(jìn)行了研究，以莖段、莖尖、葉柄、子葉等[7-12]為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)先后獲得成功。Shao等[13]用石榴花藥培養(yǎng)獲得四倍體植株；Zhu等[14]以玉石籽石榴的成熟葉片為外植體，誘導(dǎo)出愈傷組織并分化出不定芽；劉廣甫等[15]以莖尖、Naik等[16]以莖段為外植體分別建立了石榴的再生體系；王雪婧[17]以黃花石榴當(dāng)年生帶芽莖段、葉片和花萼為外植體，系統(tǒng)地研究了黃花石榴的組織培養(yǎng)及植株再生。

目前，國內(nèi)外有少量關(guān)于以石榴胚軸為外植體建立再生體系的報道。Nehanjali等[18]將石榴品種Kandhari Kabuli胚培苗的下胚軸接種至MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L培養(yǎng)基上，其愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)68.2%，平均不定芽再生率為3.18%，不定芽高度為3.12 cm；隨后將再生不定芽誘導(dǎo)生根，不定根再生率達(dá)85.6%，根長為3.20 cm。Naik等[19]對石榴品種Ganesh的下胚軸進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+10%椰汁培養(yǎng)基有利于外植體直接分化出不定芽，并且培養(yǎng)基中添加3.4 mg/L的AgNO3有助于提高不定芽分化率。

胚培養(yǎng)可以打破種子休眠，縮短育種周期，提前成苗，也可以提高雜交育種中雜種胚的成苗率。Murkute等[20]和Naik等[21]分別用石榴幼胚進(jìn)行培養(yǎng)得到愈傷組織并成功增殖。陳延惠等[22]研究了不同接種時期對突尼斯軟籽石榴幼胚萌芽率及成苗率的影響，結(jié)果表明，最佳的接種時期為8月中下旬至9月初。閔煒等[23]將大花石榴未完全成熟種子接種于MS基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 d后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為33.0%。劉麗[24]認(rèn)為，幼胚萌發(fā)前有短暫的休眠期，接種前用GA3浸泡處理種子有助于打破休眠，提高幼胚的萌發(fā)率。Kanwar等[25]取花后16～20周的石榴果實用于胚培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在MS+6-BA 9 μmol/L+NAA 20 μmol/L培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為36.4%。

1.2 愈傷組織的誘導(dǎo)和分化

在植物組織培養(yǎng)中，植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、質(zhì)量濃度和配比是誘導(dǎo)愈傷組織形成及其分化的最主要的因素之一。石榴外植體愈傷組織誘導(dǎo)常用的植物生長調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞分裂素和生長素，細(xì)胞分裂素有6-BA、KT、ZT等，目前應(yīng)用較為廣泛的是6-BA，其常用的質(zhì)量濃度為1.0～3.0 mg/L；生長素一般選用NAA、IAA、IBA等，NAA質(zhì)量濃度一般為0.1～0.5 mg/L[26-28]。彭麗萍等[29]研究認(rèn)為，培養(yǎng)基MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L對軟籽石榴離體葉片愈傷組織誘導(dǎo)效果最好。程江華[30]研究表明，靠近頂端的成熟葉片更容易誘導(dǎo)出疏松愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。愈傷組織一般分為3種：第1種為質(zhì)地堅硬、塊狀、顏色鮮綠的胚性愈傷組織，是最重要的一類愈傷組織，用于誘導(dǎo)不定芽和不定根；第2種為質(zhì)地疏松、易分散、不分泌黏稠液的顆粒狀胚性愈傷組織，此類愈傷組織適合用于懸浮培養(yǎng)；第3種為柔軟、水漬、性狀不規(guī)則、顏色淡白的非胚性愈傷組織，在培養(yǎng)過程中要淘汰此類愈傷組織。

外植體愈傷組織形成后，要進(jìn)一步誘導(dǎo)愈傷組織分化形成不定芽。陳延惠等[31]研究認(rèn)為，突尼斯軟籽石榴不定芽分化的最佳培養(yǎng)基為MS+IAA 0.3 mg/L+KT (1.5～2.0) mg/L+TDZ 1.5 mg/L。王菲等[32]研究了泰山紅、三白甜、皮亞曼、牡丹4個石榴品種葉片高頻再生體系的建立，結(jié)果表明，葉片愈傷組織分化不定芽的最佳培養(yǎng)基和不定芽增殖最佳培養(yǎng)基分別為B5+6-BA 0.6 mg/L+IBA 0.5 mg/L+椰汁100 mL/L+PVP 2.0 g/L+GA31.0 mg/L和B5+6-BA 0.8 mg/L+IBA 0.5 mg/L+椰汁100 mL/L+PVP 2.0 g/L,其中三白甜增殖系數(shù)最高，為5.5。

1.3 生根培養(yǎng)

大量研究表明，培養(yǎng)基中礦質(zhì)元素濃度較高時有助于植株莖葉生長，較低時有利于生根，所以生根培養(yǎng)基多采用1/2MS培養(yǎng)基[25,33]。石榴生根最佳基本培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基[15,26]。同時，在培養(yǎng)基中加入低濃度蔗糖有利于組培苗的生根，一般為1.0%～3.0%[27]。在組培苗生根階段生長素起至關(guān)重要的作用，常用的是NAA和IBA，其使用質(zhì)量濃度在0.1～1.0 mg/L不等。范春麗[34]研究發(fā)現(xiàn)，河陰石榴最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L,生根率為90.0%。杜澤湘[35]研究表明，石榴新品種九州紅的最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L，生根率可達(dá)到91.2%。王峰[36]認(rèn)為，河陰軟籽石榴最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，生根率達(dá)到96.0%。誘導(dǎo)生根時，叢生芽塊的大小對生根也有一定影響[24]，當(dāng)1～2個叢生芽分割為一體時，其培養(yǎng)天數(shù)較長，增殖系數(shù)低，苗長勢弱、細(xì)長，容易導(dǎo)致生根率低；而3～5個叢生芽為一體時，試管苗生長良好、芽體短粗，增殖系數(shù)是前者的3倍[27]。劉廣甫等[15]研究發(fā)現(xiàn)，生根培養(yǎng)初期進(jìn)行暗培養(yǎng)對組培苗生根具有較大的作用。

2 石榴遺傳轉(zhuǎn)化研究

2.1 石榴遺傳轉(zhuǎn)化主要方法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前果樹遺傳轉(zhuǎn)化研究較為普遍、機(jī)制清楚、技術(shù)方法較成熟的基因轉(zhuǎn)化方法，也是石榴遺傳轉(zhuǎn)化普遍使用的方法，它具有操作簡單、成本低、導(dǎo)入DNA片段較大等優(yōu)點[37-38]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法原理是利用農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒或Ri質(zhì)粒作為基因轉(zhuǎn)化載體，將外源基因?qū)胫参矬w基因組中進(jìn)而完成轉(zhuǎn)化。Terakami等[39]以矮化型石榴的葉片和莖段為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，成功地將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTⅡ)和綠色熒光蛋白基因(GFP)轉(zhuǎn)入石榴基因組。郭曉麗[40]用突尼斯軟籽石榴的愈傷組織作為外植體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化抗寒基因，得到轉(zhuǎn)化植株。Verma等[41]以石榴KandhariKabuli的胚、子葉和莖段為外植體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化抗蟲基因[Cry1A(b)]和NPTⅡ，成功獲得轉(zhuǎn)化植株。

2.2 遺傳轉(zhuǎn)化所用的基因類型

石榴遺傳轉(zhuǎn)化研究開始較晚，早期石榴遺傳轉(zhuǎn)化的目的基因主要是NPTⅡ、Kan和報告基因(GUS)。隨著基因克隆技術(shù)和功能基因組學(xué)的發(fā)展，近年來，改變生長習(xí)性、提高抗病蟲能力等相關(guān)基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究也陸續(xù)報道，如抗寒基因(CBF)、抗蟲基因[Cry1A(b)]等。李躍霞[42]用石榴葉片和葉片愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化材料，將CBF和草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Bar)轉(zhuǎn)入突尼斯軟籽石榴。Verma等[41]成功地將Cry1A(b)和NPTⅡ轉(zhuǎn)入KandhariKabuli石榴基因組。

2.3 遺傳轉(zhuǎn)化受體材料類別

植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的選擇一般要求具有高效穩(wěn)定的再生體系、較高的遺傳穩(wěn)定性、穩(wěn)定的來源，對選擇性抗生素和農(nóng)桿菌侵染有一定的敏感性。由于不同品種、不同類型受體的轉(zhuǎn)化效率和再生能力存在明顯差異，所以實際研究中應(yīng)針對不同受體材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化條件、措施的篩選與優(yōu)化。石榴遺傳轉(zhuǎn)化常用受體材料包括子葉、上胚軸、下胚軸、莖段、胚(胚性細(xì)胞)、愈傷組織、葉片等。李躍霞[42]對石榴遺傳轉(zhuǎn)化最佳侵染材料進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，在試驗條件完全相同的情況下，葉片褐化較嚴(yán)重，而愈傷組織在侵染后無污染現(xiàn)象同時褐化率也較低，生長狀態(tài)良好。郭曉麗[40]以突尼斯軟籽石榴的葉片愈傷組織作為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得抗性愈傷組織并分化出抗性芽。吳亞君[43]研究得出，用石榴胚培苗的子葉、上胚軸、下胚軸為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，共培養(yǎng)3d后部分上胚軸和下胚軸褐化；選擇培養(yǎng)15d后上胚軸全部褐化、死亡，下胚軸大部分褐化，子葉無褐化現(xiàn)象且能培養(yǎng)形成抗性芽。Verma等[41]以石榴品種KandhariKabuli的胚、子葉和莖段為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，子葉外植體的轉(zhuǎn)化效率顯著高于胚和莖段。

2.4 抗生素種類

石榴遺傳轉(zhuǎn)化研究中常用的抗生素有卡那霉素(Kan)、草銨膦(Glu)等。Terakami等[39]研究了矮化型nana石榴葉片對Kan的敏感性，認(rèn)為選擇培養(yǎng)時Kan最適篩選質(zhì)量濃度是50mg/L。李躍霞[42]研究表明，用突尼斯軟籽石榴的葉片愈傷組織為受體材料，Kan的質(zhì)量濃度為50mg/L或Glu的質(zhì)量濃度為20mg/L時愈傷組織增長受到明顯抑制；頭孢霉素(Cef)質(zhì)量濃度為500mg/L時，能有效抑制侵染材料上殘余菌體的生長。該結(jié)果與連紅可[44]的研究結(jié)果一致，可以作為石榴遺傳轉(zhuǎn)化時抗生素使用濃度參考值。Verma等[41]在篩選培養(yǎng)基中添加30mg/LKan、500mg/LCef，成功誘導(dǎo)出不定芽。

2.5 遺傳轉(zhuǎn)化植株的鑒定

2.5.1 選擇標(biāo)記基因的篩選 選擇標(biāo)記基因方便對非轉(zhuǎn)化材料進(jìn)行選擇，即在培養(yǎng)基中添加一定濃度的選擇壓，抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長。選擇標(biāo)記基因是已知功能或已知序列的基因，具有明顯區(qū)別于受體細(xì)胞遺傳背景的特點，以利于外源基因?qū)胫参锛?xì)胞后的篩選工作。石榴遺傳轉(zhuǎn)化常用選擇標(biāo)記基因有NPTⅡ[39]、Bar[42]等。Terakami等[39]以矮化觀賞石榴的離體葉片為外植體，將帶有NPTⅡ和GFP的pBin19-sgfp表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以NPTⅡ為選擇基因進(jìn)行篩選，在愈傷組織分化出的不定芽和小苗中均能檢測到目的基因，且在果實中也得到表達(dá)。連紅可[44]以突尼斯軟籽石榴的愈傷組織為外植體進(jìn)行GFP報告基因遺傳轉(zhuǎn)化研究，以NPTⅡ作為選擇標(biāo)記基因，初步建立GFP報告基因的瞬時表達(dá)體系。Verma等[41]以KandhariKabuli子葉為外植體轉(zhuǎn)化Cry1A(b)基因，所用表達(dá)載體上帶有NPTⅡ基因，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加一定濃度的Kan對抗性愈傷組織和不定芽進(jìn)行了有效篩選。

2.5.2 分子水平的鑒定 石榴遺傳轉(zhuǎn)化植株分子水平的檢測主要是在DNA水平上進(jìn)行，如PCR快速檢測、PCR-Southern雜交等方法。目前，國外文獻(xiàn)鮮見石榴遺傳轉(zhuǎn)化植株分子水平鑒定的報道，國內(nèi)未見相關(guān)文獻(xiàn)。Terakami等[39]在以矮化石榴nana為受體材料的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，運用PCR和PCR-Southern雜交的方法檢測到目的基因整合到石榴基因組中。Verma等[41]在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Cry1A(b)基因轉(zhuǎn)化石榴KandhariKabuli的研究中對所得轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測，檢測結(jié)果顯陽性，初步認(rèn)定為轉(zhuǎn)基因植株。綜合目前國內(nèi)的遺傳轉(zhuǎn)化檢測手段，雖然已經(jīng)建立了大豆、油菜、玉米、蔬菜、煙草等遺傳轉(zhuǎn)化植株檢測體系[45]，但尚未見較權(quán)威的石榴遺傳轉(zhuǎn)化檢測體系，因此，建立高效遺傳轉(zhuǎn)化檢測體系將更有助于石榴轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展。

2.6 石榴遺傳轉(zhuǎn)化存在的問題和展望

從目前石榴上所轉(zhuǎn)化的目的基因看,主要是選擇標(biāo)記基因、報告基因,而轉(zhuǎn)入具有實用價值的農(nóng)藝性狀的基因非常少，因此，加強(qiáng)對調(diào)節(jié)果實品質(zhì)、改善植株生長習(xí)性等相關(guān)基因的研究,將更有利于石榴產(chǎn)業(yè)的研究與發(fā)展。石榴遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)雖已獲得一定的進(jìn)展，但仍存在遺傳轉(zhuǎn)化效率低等問題，主要原因是缺乏完善穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系以高頻率的再生體系為基礎(chǔ),同時，轉(zhuǎn)化過程中外值體基因型、農(nóng)桿菌菌液濃度、乙酰丁香酮濃度、抗生素濃度等都是高效轉(zhuǎn)化體系的重要影響因子。

展望石榴遺傳轉(zhuǎn)化工程，除利用模式植物中已轉(zhuǎn)化成功的目的基因外，加快石榴本身基因的分離和功能研究已成當(dāng)務(wù)之急，未來石榴品質(zhì)、性狀相關(guān)基因的分離與克隆將成為研究領(lǐng)域的主流。組織培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化、分子標(biāo)記等技術(shù)為石榴育種提供了更為廣闊的途徑，是石榴產(chǎn)業(yè)未來研究的重要方向[46-49]。轉(zhuǎn)基因生物，包括石榴在內(nèi)，還面臨著一些問題和挑戰(zhàn)，如轉(zhuǎn)基因生物的政策制定和調(diào)控、轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)簽制度等[50]。但轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為未來農(nóng)業(yè)生物技術(shù)發(fā)展的必然趨勢，具有廣闊的前景和價值。

[1]ChauhanRD,KanwarK.Biotechnologicaladvancesinpomegranate(Punica granatumL.)[J].PlantInVitroCellularDevelopmentalBiology,2012,48(6):579-594.

[2]JaimeAT,TikamSR,DiganataN,et al.Pomegranatebiologyandbiotechnology:Areview[J].ScientiaHorticulture,2013,160:85-107.

[3]NaikSK,ChandPK.Tissueculture-mediatedbiotechnologicalinterventioninpomegranate:Areview[J].PlantCellReports,2011,30(15):707-721.

[4] 李佳娣,張愛民,薛建平,等.石榴組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志,2011,28(5):73-76.

[5]NiuJ,TanHH,CaoSY,et al.ProgressonsoftseedpomegranateofChina[J].ActaHorticulturae,2015,1089:379-383.

[6]OmuraM,MatsutaN,MoriguchiT,et al.Adventitiousshootandplantletformationfromculturedpomegranateleafexplants[J].HorticulturalScienceandBiotechnology,1987,22:133-134.

[7]MurkuteAA,PatilS,SinghSK.In vitroregenerationinpomegranatecv.Ganeshfrommaturetrees[J].IndianJournalofHorticulture,2004,61(3):206-208.

[8]DeepikaR,KanwarK.In vitroregenerationofPunica granatumL.plantsfromdifferentjuvenileexplants[J].FruitOrnamentalPlantReserch,2010,18(1):5-22.

[9]KanwarK,JosephJ,DeepikaR.Comparisonofin vitroregenerationpathwaysinPunica granatumL.[J].PlantCellTissueOrganCulture,2010,100(2):199-207.

[10] 閆志佩.軟籽石榴莖尖組培快繁技術(shù)研究[J].棗莊師范?？茖W(xué)校學(xué)報,2003,20(2):72-73,78.

[11] Amin M N,Islam M N,Azad M A K.Regeneration of plantletsinvitrofrom the seedling explants of pomegranate(PunicagranatumL.) [J].Plant Tissue Culture,1999,9(1):53-61.

[12] Sharon M,Sinha S.Plant regeneration from cotyledonary node ofPunicagranatumL.[J].Indian Plant Physiology,2000,5(4):344-348.

[13] Shao J,Chen C,Deng X.Invitroinduction of tetraploid in pomegranate(PunicagranatumL.)[J].Plant Cell Tissue Organ Culture,2003,75:241-246.

[14] Zhu L W,Zhang S M,Song F S,etal.Regeneration system of pomegranate byinvitroculture[J].Acta Horticulture Sinica,2003,30(2):207-208.

[15] 劉廣甫,李洪濤,陳延惠,等.牡丹花石榴的莖尖組織培養(yǎng)再生體系研究[J].河南林業(yè)科技,2007,27(3):17-19.

[16] Naik S K,Pattnaik S,Chand P K.Invitropropagation of pomegranate(PunicagranatumL.cv.Ganesh) through axillary shoot proliferation from nodal segments of mature tree[J].Scientia Horticulture,1999,79:175-183.

[17] 王雪婧.黃花石榴組織培養(yǎng)及植株再生研究[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[18] Nehanjali P,Kanwar K,Thakur A K.Direct organogenesis inPunicagranatumL.cv.Kandhari Kabuli from hypocotyl explants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2013,83(4):569-574.

[19] Naik S K,Chand P K.Silver nitrate and aminoethoxyvinylglycine promoteinvitroadventitious shoot regeneration of pomegranate(PunicagranatumL.) [J].Journal of Plant Physiology,2003,160(4):423-430.

[20] Murkute A,Patil S,Patil B N,etal.Micropropagation in pomegranate, callus induction and differentiation [J].South Indian Horticulture,2002,50:49-55.

[21] Naik S K,Pattnaik S,Chand P K.High frequency axillary shoot proliferation and plant regeneration from cotyledonary nodes of pomegranate(PunicagranatumL.)[J].Scientia Horticulture,2000,85:261-270.

[22] 陳延惠,劉麗,胡青霞,等.‘突尼斯軟籽’石榴幼胚培養(yǎng)條件的研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(7):84-86.

[23] 閔煒,陳志萍.大花石榴胚培養(yǎng)再生植株[J].江西科學(xué),2010,28(2):194-196.

[24] 劉麗.石榴胚培養(yǎng)、莖段快繁體系及倍性育種研究初報[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

[25] Kanwar K,Joseph J,Deepika R.Comparison ofinvitroregeneration pathways inPunicagranaumL.[J].Plant Cell Tissue Organ Culture,2010,100:199-207.

[26] 朱立武,張水明,宋豐順,等.石榴離體培養(yǎng)再生體系的研究[J].園藝學(xué)報,2003,30(2):207-208.

[27] 陶秀冬,楊文忠,王玉蘭,等.石榴組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,39(3):155-156.

[28] 閆志佩.瀕臨品種軟籽石榴的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊,2004,40(3):331.

[29] 彭麗萍,鄭雷.軟籽石榴離體葉片愈傷組織誘導(dǎo)條件的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(7):3835-3838.

[30] 程江華.石榴愈傷組織的誘導(dǎo)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立[D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

[31] 陳延惠,胡青霞,譚彬,等.‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織再生體系的建立[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2012,30(2):83-87.

[32] 王菲,陶吉寒,尹燕雷,等.4個優(yōu)良石榴品種葉片高頻再生體系的建立[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2015,31(13):100-107.

[33] 張紅曉,經(jīng)劍穎.木本植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J].河南科技大學(xué)學(xué)報(農(nóng)學(xué)版),2003,23(3):66-69.

[34] 范春麗.河陰石榴莖尖脫毒快繁技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報,2012,18(17):52-53.

[35] 杜澤湘.石榴新品種‘九州紅’組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(9):3770-3771.

[36] 王峰.河陰‘軟籽石榴’組培快繁技術(shù)研究[J].北方果樹,2012(5):14-15.

[37] Oliveria M L P,Febres V J,Costa M G C,etal.High-efficencyAgrobacterium-mediated transformation of citrus via sonication and vacuum infiltration[J].Plant Cell Reports,2009,28:387-395.

[38] Tong Z,Tan B,Zhang J C,etal.Using precocious trifoliate orange to establish a short juvenile transformation platform for citrus[J].Scientia Horticulture,2009,119:335-338.

[39] Terakami S,Matsuta N,Yamamoto T,etal.Agrobacterium-mediated transformation of the dwarf pomegranate (PunicagranatumL.var.nana) [J].Plant Cell Reports,2007,26:1243-1251.

[40] 郭曉麗.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗寒基因轉(zhuǎn)化‘突尼斯軟籽’石榴研究[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[41] Verma V,Kanwar K,Tufchi M,etal.Agrobacterium-mediatedCry1A(b) gene transfer inPunicagranatumL.cv.Kandhari Kabuli using differentinvitroregeneration pathways[J].Crop Science and Biotechnology,2014,17(1):1-10.

[42] 李躍霞.‘突尼斯軟籽’石榴遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建和ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[43] 吳亞君.石榴不同外植體再生體系建立及遺傳轉(zhuǎn)化體系初探[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[44] 連紅可.‘突尼斯軟籽’石榴再生體系和GFP報告基因的瞬時表達(dá)研究初報[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[45] 李海燕.大豆轉(zhuǎn)基因的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù),2007,17(6):83-86.

[46] 李佳娣.軟籽石榴組織培養(yǎng)再生體系的研究[D].淮北:淮北師范大學(xué),2011.

[47] Gowda P H R.Biotechnological intervention for the improvement of pomegranate and minor fruits[J].Acta Horticulturae,2011,890:79-81.

[48] Bar-Ya'akov I,Hatib K,Nadler-Hassar T,etal.Breeding for improved cultivars using molecular knowledge on diversity in pomegranate[J].Acta Horticulturae,2011,890:87-90.

[49] Harel-Beja R,Bar-Ya’akov I,Hatib K,etal.Pomegranate breeding:Utilization of molecular and genetic data for improvement of fruit quality and adaptation to different climatic conditions[J].Acta Horticulturae，2015,1089:249-252.

[50] Bawa A S,Anilakumar K R.Genetically modified foods:Safety,risks and public concerns a review[J].Food Science and Technology Research,2013,50(6):1035-1046.

Progress of Tissue Culture and Transgenic Research in Pomegranate

ZHAO Yujie1,TAN Bin1,LI Hongtao2,HU Qingxia1,JI Yaping1,SI Xiaoli1,ZHAO Qian1,CHEN Yanhui1*

(1.College of Horticulture,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;2.Zhengzhou Science Institute of Urban Landscape and Architecture,Zhengzhou 450003,China)

Pomegranate is a perennial woody plant,and has complex genetic background.With the development and application of biological technology,the combination of tissue culture and genetic transformation would be a new way for pomegranate breeding.The tissue culture and genetic transformation of pomegranate are the main contents of present study.The selection of implants,callus induction and differentiation,genetic transformation method,types of genes and antibiotics,identification method of transformed plants and so on were summarized.The development prospect and problems of pomegranate genetic transformation were also presented in this paper.

pomegranate; tissue culture; genetic transformation

2016-10-15

鄭州市都市生態(tài)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)項目(30601207)

趙玉潔(1988-)，女，河南開封人,在讀碩士研究生,研究方向：果樹育種。E-mail：z1184985369@163.com

*通訊作者：陳延惠(1963-)，女，河南南陽人，教授，碩士，主要從事園藝遺傳育種方面研究。 E-mail：chenyanhui188@163.com

S665.4

A

1004-3268(2017)04-0001-05