開導(dǎo)加補(bǔ)益針刺治療對形覺剝奪大鼠F-VEP及神經(jīng)元的影響

齊斌，周丹

為了初步觀察開導(dǎo)加補(bǔ)益針刺治療對單眼形覺剝奪性弱視大鼠的治療作用，本實(shí)驗(yàn)采用閃光視覺誘發(fā)電位（flash visual evoked potential,F-VEP）及尼氏染色的方法觀察了其對弱視大鼠視覺電生理及視皮層神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)、模型建立與分組

出生14 d后的清潔級健康Wistar大鼠36只（購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，排除內(nèi)外眼疾病），體質(zhì)量28～30 g，雌雄不限，隨機(jī)進(jìn)行分組，每組6只，動物房內(nèi)室溫設(shè)置為：18～25℃，相對濕度為：40%～70%。12 h循環(huán)晝夜光照。出生14 d Wistar大鼠左右不限，進(jìn)行隨機(jī)單眼瞼縫合手術(shù)，建立單眼形覺剝奪動物模型。大鼠眼瞼縫合7 d后進(jìn)行治療針刺治療每日1次，共針刺7 d。

分組：（1）正常對照組：健康Wistar大鼠6只，自然光線環(huán)境下飼養(yǎng)，不給予任何處理。（2）陰性對照組（單眼形覺剝奪組）：在確定弱視模型建立成功后不給予任何治療。（3）陽性對照組：在大鼠眼瞼縫合7 d后灌胃給予左旋多巴（20 mg/kg）。（4）開導(dǎo)針刺組：于大鼠太陽穴、上星穴給予針刺治療，捻轉(zhuǎn)角度大，用力重，頻率快，5 s后隨勢將針緩緩提至皮下，靜留片刻，然后出針。（5）補(bǔ)益針刺組：脾俞穴、腎俞穴直刺0.6 cm，手法是捻轉(zhuǎn)角度小，用力輕，頻率慢，留置10 min起針，用棉球按壓片刻；攢竹透睛明，從攢竹穴進(jìn)針后，針體向睛明方向斜刺，不捻轉(zhuǎn)不提插，靜留片刻，然后出針。（6）開導(dǎo)補(bǔ)益針刺組：開導(dǎo)穴太陽穴、上星穴針刺手法同開導(dǎo)針刺組。開導(dǎo)穴出針再進(jìn)行補(bǔ)益穴針刺，選取的穴位及手法同補(bǔ)益針刺組。

大鼠單眼縫合及治療期間有死亡情況發(fā)生，故進(jìn)行結(jié)果檢測時每組取5只進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢查。

1.2 大鼠閃光視覺誘發(fā)電位的檢測

剪開形覺剝奪幼鼠的縫合眼，并隨即將所有大鼠放置于暗室內(nèi)進(jìn)行適應(yīng)。應(yīng)用復(fù)方托吡卡胺滴眼液（美多麗）點(diǎn)雙眼散大瞳孔，暗適應(yīng)30 min。幼鼠稱量體質(zhì)量，用4%水合氯醛按1 ml/100 g的比例腹腔注射，使大鼠全身麻醉。將幼鼠固定在實(shí)驗(yàn)臺上，黑色眼罩遮擋對側(cè)眼，充分暴露檢側(cè)眼。剔除電極所置部位體表毛發(fā)。記錄電極置于幼鼠雙耳前緣連線中點(diǎn)，參考電極置于鼻部，接地電極位于尾部皮下，記錄電極、參考電極和接地電極都由不銹鋼針制成單眼記錄[1]。幼鼠眼睛距離閃光刺激源10 cm，共測量3次，每次間隔5 min，取測量平均值。

視覺電生理系統(tǒng)TEC-350參數(shù)設(shè)定：放大增益20K，高通濾波 0.1 Hz，低通濾波 75 Hz，刺激頻率 1 Hz，疊加次次 13次，閃光強(qiáng)度 3.32 nt·s，單通道檢測，全視野刺激器。

觀測指標(biāo)：閃光視覺誘發(fā)電位P2波的振幅(μV)以及潛伏期(ms)。

1.3 石蠟包埋切片及組織染色

各組實(shí)驗(yàn)大鼠均進(jìn)行心臟灌注固定：每組5只，共30只生后28 d的實(shí)驗(yàn)大鼠，用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g體質(zhì)量進(jìn)行麻醉，開胸，剪開右心室，用灌注頭穿刺至升主動脈內(nèi)，快速灌注250 mL生理鹽水沖洗心血管系統(tǒng)，待右心耳流出清亮液體后，再快速灌注預(yù)冷的固定液 （4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液，pH 7.2～7.4）250 mL，再慢灌注，灌注完成后斷頭，開顱，迅速取出大腦，按照《大鼠腦立體定位圖譜》切取大鼠視皮層的腦組織，置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定24～48 h。

將固定好的組織樣品從4℃取出，用自來水沖洗過夜，用PBS沖洗30 min，進(jìn)行乙醇梯度脫水，分別用50%、70%及85%乙醇各脫水30 min，95%乙醇I（100min），95%乙醇 II（30min），100%乙醇 I（100min），100%乙醇 II（30 min）；二甲苯透明（二甲苯 I，30 min，二甲苯 II至透明），浸蠟（60 ℃烤箱，石蠟 I、II、III各60 min），OCT包埋，制成蠟塊，隨后將蠟塊切成6 μm厚，切片分別貼在常規(guī)載玻片和多聚賴氨酸處理過的載玻片上，放于烤箱上烤片12～24 h，2張進(jìn)行HE染色，2張進(jìn)行尼氏染色，2張免疫組化染色處理。

1.4 尼氏染色步驟

脫蠟（二甲苯I 5 min，二甲苯II 5min）；乙醇梯度脫水（100%乙醇I 10 min，100%乙醇II 8 min，95%乙醇 5 min，90%乙醇 3 min，80%乙醇 2 min）； 蒸餾水清洗三次，每次2 min；1%焦油紫溶液染色20 min，蒸餾水清洗三次，乙醇梯度脫水（75%乙醇1 min，95%乙醇5min，100%乙醇I10min，100%乙醇I10min）；二甲苯透明 （二甲苯I、II個30 min）；中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，照相，并對經(jīng)過染色后的視野內(nèi)的大鼠視皮質(zhì)層神經(jīng)元數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，取三次的平均值計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以xˉ±s表示，同一指標(biāo)組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用Duncan法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠形覺剝奪眼及正常眼F-VEP檢測結(jié)果（n=5）

2 結(jié)果

2.1 閃光視覺誘發(fā)電位

陰性對照組P2波振幅較正常對照組明顯降低（P＜0.05），潛伏期較正常對照組明顯延長（P＜0.05），陽性對照組、開導(dǎo)針刺組、補(bǔ)益針刺組及開導(dǎo)加補(bǔ)益針刺組的P2波振幅、潛伏期均明顯好于陰性對照組，其中開導(dǎo)加補(bǔ)益針刺組的波形指標(biāo)最好，其P2波振幅及潛伏期好于陽性對照組（P＜0.05）并與正常對照組接近（P＞0.05）（表 1）。

2.2 尼氏染色結(jié)果

尼氏染色后各組大鼠視皮質(zhì)神經(jīng)元呈空泡狀，尼氏小體呈現(xiàn)深藍(lán)色，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色（圖1）。陰性對照組視皮層神經(jīng)元數(shù)量較正常組明顯減少 （P＜0.05），陽性對照組視皮層神經(jīng)元數(shù)量較陰性對照組明顯增加 （P＜0.05）， 與正常對照組接近 （P＞0.05）；開導(dǎo)針刺組和補(bǔ)益針刺組視皮層神經(jīng)元數(shù)量較陰性對照組明顯增加（P＜0.05），但低于陽性對照組（P＜0.05）；而開導(dǎo)加補(bǔ)益針刺組視皮層神經(jīng)元數(shù)量明顯多于陰性對照組（P＜0.05），與正常對照組和陽性治療組無明顯差別 （P＞0.05）（圖2）。說明開導(dǎo)針刺組和補(bǔ)益針刺組對單眼形覺剝奪弱視具有治療作用，而開導(dǎo)加補(bǔ)益針刺組的治療作用更明顯，并與陽性藥物左旋多巴效果相當(dāng)。

圖2 各組大鼠視皮質(zhì)層神經(jīng)元數(shù)量 a∶與正常組比較，P＜0.05；b∶與陰性對照組比較，P＜0.05；c∶與陽性對照組比較， P＜0.05（n=5）

圖1 各組大鼠視皮質(zhì)尼氏染色（光鏡，×200）A：正常對照組，可見視皮質(zhì)神經(jīng)元大小一致，有明顯的胞漿突起；B：陰性對照組，視皮質(zhì)層神經(jīng)元數(shù)量較正常組明顯減少；C：陽性對照組，視皮質(zhì)層神經(jīng)元數(shù)量較陰性對照組明顯增加；D：開導(dǎo)針刺組，E：補(bǔ)益針刺組，D及E組視皮質(zhì)層神經(jīng)元數(shù)量較陰性對照組明顯增加，但低于陽性對照組；F：開導(dǎo)加補(bǔ)益組神經(jīng)元數(shù)量與正常對照組和陽性對照組無明顯差別

3 討論

古代中醫(yī)對弱視的論述，散見于“小兒通睛癥”“能遠(yuǎn)怯近”“遠(yuǎn)視”“小兒青盲”中。其中，形覺剝奪性弱視歸屬于“小兒青盲”。《醫(yī)宗金鑒》謂“青盲，因胎受風(fēng)邪，生后瞳仁端好，黑白分明，唯視物不見”?！洱埬菊摗吩弧靶呵嗝?，此眼初患之時，是腹中受驚邪之氣，今生后五、七歲以來便多患眼”。根據(jù)《醫(yī)宗金鑒》與《龍木論》所云，先天發(fā)育不良應(yīng)為胎中受邪所致?？梢?，本病的病因病機(jī)為：先天稟賦不足（胎中受邪的先天發(fā)育不良），元陽不足，神光發(fā)越無能或陰陽俱虛而致精血虧損，不能上榮于目。根據(jù)歷代醫(yī)家的認(rèn)識，形覺剝奪性弱視病因病機(jī)有虛有郁，符合開導(dǎo)補(bǔ)益的治療原則?！伴_導(dǎo)之后宜補(bǔ)論”源于明代傅仁宇的《審視瑤函》，傅仁宇在該篇中指出：“夫目之有血，為養(yǎng)目之源，充和則有發(fā)生長養(yǎng)之功，而目不病，少有虧滯，目病生矣?！敝赋鲅獮轲B(yǎng)目之源，血虧則目失濡養(yǎng)，血瘀則目病，描述了血和眼的密切關(guān)系。本課題組在多年臨床研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合兒童弱視的發(fā)病機(jī)制的特點(diǎn)，提出了基于“開導(dǎo)之后宜補(bǔ)論”，即采用開導(dǎo)補(bǔ)益的針刺方法治療弱視，開導(dǎo)加補(bǔ)益組針刺取穴為雙側(cè)取穴，開導(dǎo)穴為太陽、上星；補(bǔ)益穴采用肝俞、脾俞、攢竹透晴明。對照組采用補(bǔ)益方法即單純應(yīng)用補(bǔ)益穴治療，記錄視力、視覺誘發(fā)電位的變化以及治療時間進(jìn)行療效對比，結(jié)果顯示，以“開導(dǎo)之后宜補(bǔ)論”為理論基礎(chǔ)，針刺治療弱視的總有效率為100%，而補(bǔ)益治療組的總有效率為75%，臨床研究結(jié)果證明，采用“開導(dǎo)之后宜補(bǔ)論”針刺治療方法能夠明顯改善患者的視力、視覺誘發(fā)電位振幅和潛伏期，且治療效果優(yōu)于補(bǔ)益治療法[2]。

有研究表明，針刺防治弱視可能與以下幾方面相關(guān)：保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、糾正視網(wǎng)膜功能及改善視網(wǎng)膜的血液供應(yīng)、增強(qiáng)視覺神經(jīng)細(xì)胞生物電活動、調(diào)節(jié)視環(huán)境紊亂、改善視神經(jīng)傳導(dǎo)、激活視覺皮質(zhì)相應(yīng)區(qū)域[3]、影響神經(jīng)元營養(yǎng)因子及其受體的合成和分泌[4]。雖然針灸治療弱視的臨床研究資料較多，并且大多顯示了良好的治療效果，但是目前針對針灸治療弱視的作用機(jī)理還有待深入研究與探討。

本研究采用單眼形覺剝奪誘導(dǎo)弱視的動物模型，研究基于“開導(dǎo)之后宜補(bǔ)論”針刺療法治療弱視的作用機(jī)理，并同時比較其與左旋多巴胺、開導(dǎo)針刺及補(bǔ)益針刺治療單眼形覺剝奪弱視的效果。有研究顯示，大鼠的視覺可塑性關(guān)鍵期是從出生后14 d睜眼開始，至出生后45 d結(jié)束[5]。故本研究采用了大鼠出生14 d后進(jìn)行單眼瞼縫合手術(shù)，建立了大鼠單眼形覺剝奪誘導(dǎo)弱視的動物模型并觀察左旋多巴胺治療弱視及開導(dǎo)針刺、補(bǔ)益針刺及開導(dǎo)加補(bǔ)益針刺治療的作用。視覺誘發(fā)電位是大腦皮質(zhì)枕葉區(qū)對視刺激發(fā)生的電反應(yīng)，代表視網(wǎng)膜接受刺激經(jīng)視路傳導(dǎo)至枕葉皮層而引起的電位變化。本研究通過F-VEP對接受不同干預(yù)的形覺剝奪性弱視幼鼠以及正常發(fā)育幼鼠的整個視覺通路功能完整性進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，與正常組大鼠相比，陰性對照組大鼠剝奪眼F-VEP的波幅明顯降低，潛伏期明顯延長，而正常眼未受影響。各治療組間進(jìn)行比較，開導(dǎo)加補(bǔ)益針刺治療組明顯優(yōu)于左旋多巴治療組、開導(dǎo)治療組和補(bǔ)益治療組。說明開導(dǎo)加補(bǔ)益治療對單眼形覺剝奪誘導(dǎo)的弱視具有顯著的治療效果，可能改善了視覺通路功能的完整性。

形態(tài)學(xué)觀察是弱視研究的熱點(diǎn)內(nèi)容，故本實(shí)驗(yàn)采用尼氏染色觀察視皮層神經(jīng)元形態(tài)的改變。結(jié)果提示，開導(dǎo)針刺組和補(bǔ)益針刺組對單眼形覺剝奪弱視視皮層的形態(tài)具有一定的改善作用，而開導(dǎo)加補(bǔ)益針刺組的作用優(yōu)于開導(dǎo)組和補(bǔ)益組，并與陽性藥物左旋多巴的效果相當(dāng)。

綜上，開導(dǎo)針刺、補(bǔ)益針刺和開導(dǎo)加補(bǔ)益針刺治療對單眼形覺剝奪性弱視大鼠F-VEP波形及神經(jīng)元損傷具有明顯的改善作用，但開導(dǎo)加補(bǔ)益針刺組的作用優(yōu)于開導(dǎo)組和補(bǔ)益組。