唐 乾,李如玉,史珊珊,曹洪玉,王立皓,鄭學(xué)仿
(1. 大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 遼寧 大連 116622;2. 大連大學(xué) 遼寧省生物有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連116622;3. 大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,遼寧 大連 116622)
血紅素類蛋白是生物體內(nèi)一系列含有原卟啉Ⅸ輔基的金屬蛋白質(zhì),在生物體中發(fā)揮著極其重要的生物功能[1]。由于血紅素蛋白含有血紅素輔基結(jié)構(gòu)這一特殊性,因此他們能與不同的生物活性小分子進(jìn)行配位。通過活性小分子配體與血紅素蛋白相互作用的研究,人們能更好地解釋血紅素蛋白的生物功能。近年來血紅素蛋白與各種活性小分子配體的結(jié)合過程、結(jié)合動(dòng)力學(xué)等問題一直是眾多學(xué)科專家研究的熱點(diǎn),而這其中的氣體配體與血紅素蛋白的相互作用研究是其中一項(xiàng)更富挑戰(zhàn)性的研究課題[2,3]。已有研究表明:肌紅蛋白能與一氧化碳(CO)、一氧化氮(NO)等小分子配體可逆地結(jié)合與釋放,從而調(diào)控其它蛋白的生理、生化功能[4],李濤等[5]利用納秒瞬態(tài)拉曼光譜技術(shù)研究了氣體分子配體 NO與肌紅蛋白結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過程。渠敏等[6]利用光聲量熱法通過測量碳氧血紅蛋白光解反應(yīng)的焓變和結(jié)構(gòu)體積變化,研究了血紅蛋白與其配合物的結(jié)合與解離過程中各反應(yīng)分子的結(jié)構(gòu)變化和能量變化的動(dòng)力學(xué)過程以及作用機(jī)理。Karin Nienhaus等[7]采用傅里葉變換紅外-溫度導(dǎo)數(shù)光譜(FTIR-TDS)技術(shù),在較低的溫度下,研究了NO和血紅素蛋白的結(jié)合,Ionascu等[8]人也提出NO和血紅素蛋白的再結(jié)合動(dòng)力學(xué)過程受溫度的影響,外界環(huán)境的改變會(huì)影響血紅素蛋白與NO的結(jié)合。
細(xì)胞色素C(Cytochrome c;Cytc)是一種含血紅素的蛋白,它在呼吸鏈中將電子由復(fù)合物III傳遞給復(fù)合物 IV[9],它由一個(gè)含鐵的血紅素和其周圍 104個(gè)氨基酸殘基肽鏈構(gòu)成的金屬蛋白,血紅素Fe與卟啉環(huán)的四個(gè)吡咯結(jié)構(gòu)上的4個(gè)N形成配位鍵,而血紅素Fe的第5和第6個(gè)位配位鍵的形成則分別與多肽鏈上的Met80和His18形成,同時(shí)借助在血紅素原卟啉環(huán)上的乙烯基側(cè)鏈上的S-H進(jìn)行還原加成反應(yīng),生成的巰基鍵與肽鏈的Cys14和Cys17分別形成共價(jià)鍵[10]。在發(fā)生氧化還原反應(yīng)的過程蛋白的構(gòu)象也發(fā)生相應(yīng)的變化[11]。Cytc在水溶液中以單體、多聚體兩種形式存在,在極性溶劑中以多聚體形式為主,因此當(dāng)溶液極性發(fā)生改變時(shí),Cytc的血紅素構(gòu)象也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化[12],因此Cytc所在溶劑的微環(huán)境發(fā)生改變將會(huì)對(duì)Cytc的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。
NO分子一直受到各學(xué)科領(lǐng)域的高度關(guān)注[13-16],是生物體內(nèi)很多重要反應(yīng)的關(guān)鍵性細(xì)胞信號(hào)分子,可以控制和調(diào)節(jié)各種不同生理過程,例如血壓的控制,引起肌肉松弛,導(dǎo)致血小板聚集,影響神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和免疫反應(yīng)等。關(guān)于Cytc與NO的相互作用研究[17-18]主要利用紫外區(qū) Q帶進(jìn)行分析而得出的,而關(guān)于紫外區(qū)的soret帶的分析卻沒有提及,根據(jù)Gouterman提出的四軌道模型理論可知,Cytc分子的soret帶由血紅素卟啉中的外層電子躍遷產(chǎn)生的,把它歸屬為π-π*躍遷的第二電子激發(fā)單重態(tài),血紅素卟啉的變化情況可由它的變化來分析,這一區(qū)域的光譜變化與Q帶相比是非常靈敏的,因此利用Soret帶的變化來分析血紅素卟啉的變化情況更全面和具有重要意義。而且,之前的研究也沒有全面地分析外界因素對(duì)Cytc與NO配位反應(yīng)的影響。本文通過光譜法研究Cytc與NO結(jié)合及解離反應(yīng),以及外界環(huán)境的影響,進(jìn)而找到了其反應(yīng)的最佳條件。
馬心肌來源的細(xì)胞色素C(Cytc)樣品,購于美國Sigma公司,純度>99%,測定用 PB緩沖溶液(0.01 mol/L、0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L,pH=5.4、6.4、7.4、8.4、9.4、10.4)配制成濃度為 1×10-5mol/L的溶液,避光于4℃保存,并盡快用于實(shí)驗(yàn)測定;proliNONOate ,或者寫成proliNO/NO,20℃時(shí),其半衰期為6 s,從Cayman公司購置。Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4);HAc-NaAc緩沖液溶(pH=7.4);Ficoll70及Dextran70(100 g/L,購于上海生物工程公司);試劑均為國產(chǎn)分析純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
V-560型 UV光譜儀(日本,Jasco),F(xiàn)P-6500型熒光/磷光光譜儀(日本,Jasco),電子順磁共振波譜儀(德國,Bruker);F-12型制冷和加熱循環(huán)器(德國,Julabo公司),pH 酸度計(jì)(上海雷磁分析儀器廠,PHSJ-4A)。
Cytc樣品的制備:三價(jià)高鐵形式的細(xì)胞色素C制備:添加過氧化氫;二價(jià)還原形式細(xì)胞色素 C制備:添加連二亞硫酸鈉,現(xiàn)用現(xiàn)配。實(shí)驗(yàn)中所用的Cytc濃度均為1 uM,H2O2以及Na2S2O4試劑濃度分別配制為10 mM、0.5M。
將高濃度的Cytc溶解在不同離子強(qiáng)度、pH、溫度的磷酸鹽緩沖液,及不同緩沖溶液和擁擠試劑中,蛋白的終濃度為1×10-5mol/L;分別將樣品通入一定量的NO,通氣速率為100個(gè)氣泡/分,時(shí)間為2 min;取通NO后的Cytc樣品用氙燈進(jìn)行光照。
紫外光譜的測定:將已處理的Cytc樣品至于1 cm方形比色杯中測定,測定條件為:狹縫寬度:2 nm,掃描范圍:220~700 nm,掃描速率:400 nm/min,響應(yīng)時(shí)間:中等。
時(shí)間過程光譜測定:將細(xì)胞色素 C(未處理的,Cytc(WT))、高鐵形式細(xì)胞色素C(Cyt c-Fe(III))和還原態(tài)細(xì)胞色素C(Cyt c-Fe(II))三種樣品分別置于10 mm光徑的方形石英比色皿中測定,測定條件:波長設(shè)置為416 nm、562 nm,靈敏度調(diào)置為高,響應(yīng)時(shí)間間隔:2 s,其他條件同紫外-可見吸收光譜測定。
電子順磁共振譜測定:液氮條件下,進(jìn)行樣品檢測,儀器測定條件為:功率9.33 GHz,6-G,10.2 mW,掃描速度:83.97 s,掃描范圍:2900~3900 G,時(shí)間常量:40.96 ms,溫度:100 K,最終結(jié)果為掃描次數(shù)20次的平均結(jié)果。
Cytc與NO相互作用的紫外吸收光譜如圖1所示,圖1A為Fe(III)-Cytc與NO相互作用的UV-Vis吸收光譜,由圖1A可知Fe(III)-CytcSoret帶的409 nm處吸收峰紅移且吸收強(qiáng)度增大,Q帶530 nm處的吸收峰強(qiáng)度增大,同時(shí)在562 nm處出現(xiàn)新的吸收峰,F(xiàn)e(III)-Cytc與NO配位結(jié)合生成Cytc-NO配合物。圖1B為亞鐵細(xì)胞色素C(Fe(II)-Cytc)與NO相互作用的UV-Vis吸收光譜,由圖1B可知隨著NO通入量的增加,其soret帶的吸收峰由415 nm藍(lán)移到409 nm,Q帶520 nm與550 nm處吸收峰消失,在530 nm處出現(xiàn)新的單一小峰,隨著NO的繼續(xù)增加Soret帶的吸收峰由409 nm紅移到416 nm,同時(shí)Q帶在562 nm處出現(xiàn)新的吸收峰,逐漸生成細(xì)胞色素C-NO配合物(Cytc-NO)。因此,不同價(jià)態(tài)的Cytc與NO反應(yīng)的過程為:Fe(II)-Cytc先被氧化為高鐵細(xì)胞色素C(Fe(III)-Cytc),后者與NO配位形成Cytc-NO配合物[19]。根據(jù)Gouterman 四軌道模型理論,Cytc分子的 Soret帶是由其卟啉中的外層電子躍遷所產(chǎn)生的,其歸屬為π-π*躍遷的第二電子激發(fā)單重態(tài)。當(dāng)NO與Fe(III)-Cytc分子進(jìn)行配位反應(yīng)時(shí),由于NO分子具有較強(qiáng)的親核性,其電荷通過 Fe3+轉(zhuǎn)移到卟啉環(huán)上,從而使得卟啉環(huán)上電子云密度增大,導(dǎo)致π軌道能量增加,與π*間的能級(jí)差減小,即π→π*能級(jí)差降低,從而造成 Soret帶的紅移[20]。根據(jù)之前的研究結(jié)果,推斷出其配位反應(yīng)機(jī)制為:NO氣體在溶液中以NO·形式存在,促使Cytc分子微環(huán)境發(fā)生改變,同時(shí),NO進(jìn)入到Heme腔中使其極性改變,使Met80與Heme之間作用力減弱,導(dǎo)致Met與Heme之間的配位鍵斷裂,經(jīng)過分子間重排,血紅素中心Fe與NO之間形成新的Fe-N配位鍵,但新形成的配位鍵不穩(wěn)定,會(huì)發(fā)生斷裂,解離再次生成五配位的 Fe,與溶液中的H2O分子結(jié)合,最終達(dá)到一個(gè)平衡。
圖1 Cyt c與NO相互作用的紫外吸收光譜
電子順磁共振(electron paramagnetic resonance,EPR)是由不配對(duì)電子的磁矩發(fā)源的一種磁共振技術(shù),可用于從定性和定量方面檢測物質(zhì)原子或分子中所含的不配對(duì)電子,并探索其周圍環(huán)境的結(jié)構(gòu)特性。研究生物組織中的順磁金屬離子,包括過渡族金屬離子,對(duì)一些動(dòng)物組織、植物材料和微生物都能見到銅(Ⅱ)、錳(Ⅱ)或鐵的EPR信號(hào)。
圖2 細(xì)胞色素c與NO相互作用的電子順磁光譜
圖2A中顯示單獨(dú)存在的Cytc沒有順磁信號(hào),但是在樣品中添加了少量的proliNO/NO后,出現(xiàn)弱的順磁信號(hào),隨著proliNO/NO添加量的增加,信號(hào)更加明顯,見圖 2B。但是生成的六配位的亞硝酰血紅素鐵不穩(wěn)定,因此,隨著時(shí)間的推移發(fā)生了解離,見圖 2C,與 2.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。圖 2D顯示,proliNO/NO直接加到緩沖液中也沒有順磁信號(hào)。
本文在此基礎(chǔ)上研究不同環(huán)境因素對(duì) Cytc與NO結(jié)合及解離的影響。由于Fe(II)-Cytc要先被氧化為Fe(III)-Cytc再與NO反應(yīng),因此實(shí)驗(yàn)過程中均以Fe(III)-Cytc進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
Cytc在生物體內(nèi)與NO的結(jié)合受到環(huán)境中多種因素的影響,因此我們分別考察了氧氣、離子強(qiáng)度、酸堿度、溫度、不同緩沖體系、擁擠環(huán)境等因素對(duì)二者結(jié)合反應(yīng)的影響。
O2是需氧生物生存的必需條件,在呼吸鏈中必不可少,Cytc是呼吸鏈的主要成分之一,因此在研究Cytc與NO相互作用的過程中,O2是一個(gè)重要因素,可能會(huì)對(duì)其反應(yīng)產(chǎn)生影響。圖3A為通NO前,Cytc通入N230 min排除O2后與未排O2的UV-Vis吸收光譜,由圖3A可知Cytc去O2前后光譜沒有發(fā)生任何變化,說明O2對(duì)Cytc溶液本身沒有影響。圖3B為Cytc排O2前后與NO反應(yīng)的UV-Vis吸收光譜,由圖3B可知通入相同量的NO,排O2后Cytc與NO相互作用的UV-Vis吸收光譜的Soret帶的特征峰在416 nm而含O2的Cytc在413 nm,Q帶特征峰都在530 nm和562 nm,但前者吸收強(qiáng)度大于后者,說明生成的Cytc-NO更多,即O2對(duì)Cytc與NO之間的配位反應(yīng)產(chǎn)生一定的阻力,但并不參與其反應(yīng)。這與本實(shí)驗(yàn)室之前所做的metMb與NO反應(yīng)時(shí),少量的O2能夠促進(jìn)其反應(yīng)的結(jié)果相反,其原因主要是兩種蛋白的結(jié)構(gòu)不同,metMb中血紅素鐵是五配位,而Cytc是六配位,同時(shí)在肌紅蛋白的血紅素中存在一個(gè)口袋結(jié)構(gòu)而在細(xì)胞色素c中沒有,因此在Cytc與NO反應(yīng)的過程中O2無法進(jìn)入到其內(nèi)部,而是消耗一部分 NO,使其生成產(chǎn)物減少,反應(yīng)速率減慢。實(shí)驗(yàn)中向Cytc中通入過量的O2,發(fā)現(xiàn)對(duì)其紫外吸收沒有影響(結(jié)果與圖3A相同,此處未列出)。
在不同離子強(qiáng)度的緩沖溶液中,Cytc與NO反應(yīng)時(shí)Soret帶(416 nm)與Q帶(562 nm)處峰面積變化如圖4所示。由圖4可知,隨離子強(qiáng)度的增大反應(yīng)速率逐漸降低,Soret帶(416 nm)與Q帶(562 nm)處的峰面積都逐漸減少,離子強(qiáng)度由 0.01 mol/L到 0.05 mol/L變化最明顯,隨離子強(qiáng)度的繼續(xù)增加,變化逐漸減小,但仍有微弱的變化。在離子強(qiáng)度低的溶液中,Cytc易發(fā)生去折疊,形成伸展結(jié)構(gòu)[21],所以NO進(jìn)入到其Heme中受到的阻力小,但隨離子強(qiáng)度的增大,Cyt c易發(fā)生折疊反應(yīng),血紅素周圍的結(jié)構(gòu)更緊湊,NO進(jìn)入CytcHeme中的阻力增大,以至Cytc與NO反應(yīng)受阻,因此隨著離子強(qiáng)度的增大,反應(yīng)生成的Cytc-NO配合物逐漸減少。隨緩沖溶液濃度的增強(qiáng),其緩沖能力增大,但當(dāng)溶液溶度過低時(shí),緩沖溶液受外界離子的干擾過大,因此綜合以上原因,實(shí)驗(yàn)過程選取0.05 mol/L的緩沖溶液。
圖3 O2對(duì)cyt c與NO相互作用的影響的紫外-可見吸收光譜
圖5為不同pH溶液中Cytc通NO前后Soret 帶(416 nm)與Q帶(562 nm)峰面積變化。由圖5可知,在低于生理pH時(shí),隨pH的增大,Soret帶(416 nm)與Q帶(562 nm)峰面積通氣前后變化逐漸減小,而當(dāng)pH>8后,其變化基本不變。Cytc在低pH溶液中,其二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化,α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角會(huì)向β-折疊轉(zhuǎn)變[22],溶液的pH越低對(duì)Cytc結(jié)構(gòu)的影響越大,促使氧化態(tài)Cytc的生成,而氧化態(tài)的Cytc易與NO結(jié)合,因此其在Soret 帶(416 nm)與Q帶(562 nm)的吸收峰面積的變化越大,Cytc與NO結(jié)合的越多,隨pH增大變化峰面積逐漸減小,結(jié)合速率減慢;但當(dāng)pH由酸性變?yōu)閴A性時(shí),Cytc自身會(huì)向還原態(tài)轉(zhuǎn)變,而還原態(tài)的Cytc不易與NO結(jié)合,因此Cytc與NO結(jié)合的反應(yīng)速率下降。因?yàn)樯韕H為7.4,所以實(shí)驗(yàn)過程中選取pH為7.4進(jìn)行,所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有參考價(jià)值。
圖4 不同離子強(qiáng)度中Cyt c與NO反應(yīng)吸收峰面積變化
圖5 不同 pH溶液中Cyt c通NO前后峰面積變化
在不同的溫度下,Cytc與NO的反應(yīng)如圖6所示。由圖6可知隨溫度的升高,Soret帶(416 nm)與Q帶(530 nm和560 nm)的峰面積都是先上升后下降的趨勢,Soret帶在293 K時(shí)面積達(dá)到最大,Q帶在283 K時(shí)峰面積最大,說明在283~293 K溫度范圍內(nèi)為溶液反應(yīng)的適合溫度,反應(yīng)完全。溫度的改變引起Cytc蛋白構(gòu)象的變化,而Cytc蛋白構(gòu)象的變化會(huì)直接影響其血紅素卟啉環(huán)與NO的結(jié)合速率,當(dāng)溫度較低時(shí),Cytc自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,處于低能狀態(tài),NO進(jìn)入溶液后受到的阻力較大,不易與之結(jié)合,使得反應(yīng)生成的配合物較少,但隨著溫度的升高,Cytc自身的能量升高,分子變得活潑,易與NO反應(yīng),生成的配合物增多,使其相應(yīng)位置的吸收峰面積也增大,而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí),可能會(huì)破壞一部分Cytc的結(jié)構(gòu),使其構(gòu)象發(fā)生改變,無法與NO反應(yīng),同時(shí)溫度過高時(shí)NO在溶液中的溶解度降低,使得溶液中的NO量減少,因此Cytc與NO結(jié)合生成的配合物會(huì)迅速減少,吸收峰的面積也大量降低。因此Cytc與NO反應(yīng)的溫度應(yīng)該控制在283~293 K之間,過高過低都會(huì)使得反應(yīng)現(xiàn)象不明顯。
圖6 Cyt c與NO反應(yīng)的峰面積隨溫度變化圖
Cytc通NO前在不同緩沖溶液中的紫外吸收光譜如圖7A所示,由于Cytc在酸性環(huán)境中以氧化態(tài)存在,在堿性環(huán)境中以還原態(tài)存在,因此實(shí)驗(yàn)中分別選取pH=7.4的酸性緩沖溶液(HAc-NaAc)、堿性緩沖溶液(Tris-Hcl)以及中性緩沖溶液(PB),由圖7A可知在不同的緩沖溶液中,Cytc在soret帶409 nm處的特征吸收峰的位置沒有變化,只是其吸收峰的強(qiáng)度發(fā)生了微弱的變化;而 Q帶變化明顯,在 Tris-Hcl中Cytc部分被還原,HAc-NaAc中沒有變化。不同緩沖溶液中Cytc中通入NO后,其soret帶與Q帶的峰面積變化如圖7B所示,由圖7B可知HAc-NaAc緩沖溶液的變化是最明顯的,而Tris-Hcl 較PB緩沖溶液其面積變化減少,因?yàn)樵贖Ac-NaAc溶液中有利于Fe(III)-Cytc的存在,而Fe(III)-Cytc易與NO結(jié)合,因此利于反應(yīng)的進(jìn)行,而堿性環(huán)境中Cytc主要以還原態(tài)存在,由于Fe(II)-Cytc在與NO結(jié)合的過程中要先生成Fe(III)-Cytc,因此在堿性緩沖溶液中,Cytc-NO配合物生成速率下降。為使實(shí)驗(yàn)條件更接近生理環(huán)境,因此實(shí)驗(yàn)中選取pH=7.4磷酸緩沖溶液更合適,得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也更接近于生理?xiàng)l件。
圖7 不同緩沖液中Cyt c的紫外吸收光譜及其與NO相互作用后的峰面積的變化
通常所進(jìn)行的蛋白質(zhì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)均以稀溶液作為緩沖體系完成的,但真實(shí)的細(xì)胞環(huán)境是非常復(fù)雜的,存在各種大分子,處在一個(gè)擁擠的環(huán)境中,Sasahara等[23]發(fā)現(xiàn)擁擠試劑可以促進(jìn)折疊的蛋白質(zhì)折疊為更為緊致的結(jié)構(gòu),此外McPhie等[24]也發(fā)現(xiàn)增加大分子擁擠試劑的濃度能促進(jìn)折疊的脫輔基血紅素蛋白向熔球態(tài)轉(zhuǎn)變。本實(shí)驗(yàn)研究了不同擁擠環(huán)境中Cytc與NO相互作用,其soret帶與Q帶峰面積如圖8所示,圖8可知Dextran70與PB緩沖溶液中soret帶與Q帶的面積基本相同,而Ficoll 70其面積明顯減少。Dextran 70是一種長度約為0.4 nm,無交聯(lián)線性的,相對(duì)靈活的大分子聚合物,其在溶液中易形成準(zhǔn)隨機(jī)螺旋,排阻體積效應(yīng)小[25],可以容納更多的間隙空間,對(duì)Cytc的束縛能力較弱,而Ficoll 70是高度交聯(lián)構(gòu)成的剛性共聚體[26],造成溶液中可移動(dòng)的空間減少,對(duì)Cytc的束縛能力較強(qiáng),同時(shí)擁擠試劑形成的擁擠環(huán)境降低了NO的擴(kuò)散系數(shù),因此減弱了NO與Cytc的相互作用,且Ficoll 70對(duì)其影響較明顯,說明其能夠穩(wěn)定了蛋白中血紅素的結(jié)構(gòu),延遲了與溶液中NO分子的反應(yīng)。
圖8 不同的擁擠試劑中Cyt c與NO結(jié)合的峰面積變化
光是生物有機(jī)體生活環(huán)境中必然存在的,而Cytc中含有一個(gè)血紅素輔基結(jié)構(gòu),其能吸收特定波長的光,劉艷偉[27]等研究發(fā)現(xiàn)其在280 nm處的吸收最大,因此本文選取280 nm的波長進(jìn)行光照,發(fā)現(xiàn)光照對(duì)Cytc-NO的解離具有促進(jìn)作用。圖9為Cytc-NO光照前后解離的面積變化圖,其中曲線2為光照后的解離曲線。由圖9可知光照與未光照Cytc-NO的解離都遵循方程(1)如下:
其中Y是面積,A是振幅,k是解離速率常數(shù),y0是截距(表1),由表1可知,光照前后其反應(yīng)速率k1/k2=0.5,光照后 Cytc-NO的解離速率是原來的 2倍,光照后血紅素基團(tuán)吸收能量,因此使得整個(gè)Cytc-NO分子的能量增高,血紅素周圍的電子分布發(fā)生改變,導(dǎo)致整個(gè)分子的穩(wěn)定性降低,生成的Fe-N變?nèi)?,更易發(fā)生斷裂,因此光照會(huì)促進(jìn)Cytc-NO的解離。
表1 Cyt c-NO光照和未光照下解離速率常數(shù)和相關(guān)參數(shù)值
圖9 光照前后Cyt c與NO反應(yīng)配合物解離面積變化
本文采用光譜法證實(shí)了Cytc與NO能發(fā)生配位反應(yīng),并且研究了不同的外界條件,如離子強(qiáng)度、pH、溫度、緩沖溶液、及擁擠試劑對(duì)Cytc與NO配位反應(yīng)和光照對(duì)Cytc-NO解離反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨離子強(qiáng)度的增大反應(yīng)速率逐漸降低,酸性pH下有利于Cytc與NO配位,而堿性pH則會(huì)抑制其反應(yīng)的進(jìn)行,溫度過高過低都不利于Cytc與NO配位反應(yīng)的進(jìn)行,控制溫度在283~293 K之間,有利于反應(yīng)的進(jìn)行,酸性緩沖溶液較堿性緩沖溶液更有利于配位反應(yīng)的進(jìn)行,而擁擠試劑Ficoll 70對(duì)于穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)效果更好,使Cytc不易與NO反應(yīng),光照會(huì)促進(jìn)Cytc-NO的解離,因此控制溫度在283~293 K之間,pH=7.4的0.05 mol/L的PB緩沖溶液的近生理?xiàng)l件是Cytc與NO配位結(jié)合反應(yīng)的最佳條件。本研究對(duì)于進(jìn)一步研究Cytc與NO配位反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以及結(jié)合中間態(tài)的研究提供了最佳的反應(yīng)條件。
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