Cyt c與NO配位反應(yīng)及環(huán)境因素對(duì)其反應(yīng)的影響

唐 乾，李如玉，史珊珊，曹洪玉，王立皓，鄭學(xué)仿

（1. 大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 遼寧 大連 116622；2. 大連大學(xué) 遼寧省生物有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116622；3. 大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622）

0 引言

血紅素類蛋白是生物體內(nèi)一系列含有原卟啉Ⅸ輔基的金屬蛋白質(zhì)，在生物體中發(fā)揮著極其重要的生物功能[1]。由于血紅素蛋白含有血紅素輔基結(jié)構(gòu)這一特殊性，因此他們能與不同的生物活性小分子進(jìn)行配位。通過活性小分子配體與血紅素蛋白相互作用的研究，人們能更好地解釋血紅素蛋白的生物功能。近年來血紅素蛋白與各種活性小分子配體的結(jié)合過程、結(jié)合動(dòng)力學(xué)等問題一直是眾多學(xué)科專家研究的熱點(diǎn)，而這其中的氣體配體與血紅素蛋白的相互作用研究是其中一項(xiàng)更富挑戰(zhàn)性的研究課題[2,3]。已有研究表明：肌紅蛋白能與一氧化碳(CO)、一氧化氮(NO)等小分子配體可逆地結(jié)合與釋放，從而調(diào)控其它蛋白的生理、生化功能[4]，李濤等[5]利用納秒瞬態(tài)拉曼光譜技術(shù)研究了氣體分子配體 NO與肌紅蛋白結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過程。渠敏等[6]利用光聲量熱法通過測量碳氧血紅蛋白光解反應(yīng)的焓變和結(jié)構(gòu)體積變化，研究了血紅蛋白與其配合物的結(jié)合與解離過程中各反應(yīng)分子的結(jié)構(gòu)變化和能量變化的動(dòng)力學(xué)過程以及作用機(jī)理。Karin Nienhaus等[7]采用傅里葉變換紅外-溫度導(dǎo)數(shù)光譜(FTIR-TDS)技術(shù)，在較低的溫度下，研究了NO和血紅素蛋白的結(jié)合，Ionascu等[8]人也提出NO和血紅素蛋白的再結(jié)合動(dòng)力學(xué)過程受溫度的影響，外界環(huán)境的改變會(huì)影響血紅素蛋白與NO的結(jié)合。

細(xì)胞色素C(Cytochrome c；Cytc)是一種含血紅素的蛋白，它在呼吸鏈中將電子由復(fù)合物III傳遞給復(fù)合物 IV[9]，它由一個(gè)含鐵的血紅素和其周圍 104個(gè)氨基酸殘基肽鏈構(gòu)成的金屬蛋白，血紅素Fe與卟啉環(huán)的四個(gè)吡咯結(jié)構(gòu)上的4個(gè)N形成配位鍵，而血紅素Fe的第5和第6個(gè)位配位鍵的形成則分別與多肽鏈上的Met80和His18形成，同時(shí)借助在血紅素原卟啉環(huán)上的乙烯基側(cè)鏈上的S-H進(jìn)行還原加成反應(yīng)，生成的巰基鍵與肽鏈的Cys14和Cys17分別形成共價(jià)鍵[10]。在發(fā)生氧化還原反應(yīng)的過程蛋白的構(gòu)象也發(fā)生相應(yīng)的變化[11]。Cytc在水溶液中以單體、多聚體兩種形式存在，在極性溶劑中以多聚體形式為主，因此當(dāng)溶液極性發(fā)生改變時(shí)，Cytc的血紅素構(gòu)象也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化[12]，因此Cytc所在溶劑的微環(huán)境發(fā)生改變將會(huì)對(duì)Cytc的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。

NO分子一直受到各學(xué)科領(lǐng)域的高度關(guān)注[13-16]，是生物體內(nèi)很多重要反應(yīng)的關(guān)鍵性細(xì)胞信號(hào)分子，可以控制和調(diào)節(jié)各種不同生理過程，例如血壓的控制，引起肌肉松弛，導(dǎo)致血小板聚集，影響神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和免疫反應(yīng)等。關(guān)于Cytc與NO的相互作用研究[17-18]主要利用紫外區(qū) Q帶進(jìn)行分析而得出的，而關(guān)于紫外區(qū)的soret帶的分析卻沒有提及，根據(jù)Gouterman提出的四軌道模型理論可知，Cytc分子的soret帶由血紅素卟啉中的外層電子躍遷產(chǎn)生的，把它歸屬為π-π*躍遷的第二電子激發(fā)單重態(tài)，血紅素卟啉的變化情況可由它的變化來分析，這一區(qū)域的光譜變化與Q帶相比是非常靈敏的，因此利用Soret帶的變化來分析血紅素卟啉的變化情況更全面和具有重要意義。而且，之前的研究也沒有全面地分析外界因素對(duì)Cytc與NO配位反應(yīng)的影響。本文通過光譜法研究Cytc與NO結(jié)合及解離反應(yīng)，以及外界環(huán)境的影響，進(jìn)而找到了其反應(yīng)的最佳條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

馬心肌來源的細(xì)胞色素C(Cytc)樣品，購于美國Sigma公司，純度>99%，測定用 PB緩沖溶液(0.01 mol/L、0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L，pH=5.4、6.4、7.4、8.4、9.4、10.4)配制成濃度為 1×10-5mol/L的溶液，避光于4℃保存，并盡快用于實(shí)驗(yàn)測定；proliNONOate ，或者寫成proliNO/NO，20℃時(shí)，其半衰期為6 s，從Cayman公司購置。Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)；HAc-NaAc緩沖液溶(pH=7.4)；Ficoll70及Dextran70(100 g/L，購于上海生物工程公司)；試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

V-560型 UV光譜儀(日本，Jasco)，F(xiàn)P-6500型熒光/磷光光譜儀(日本，Jasco)，電子順磁共振波譜儀(德國，Bruker)；F-12型制冷和加熱循環(huán)器(德國，Julabo公司)，pH 酸度計(jì)(上海雷磁分析儀器廠，PHSJ-4A)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

Cytc樣品的制備：三價(jià)高鐵形式的細(xì)胞色素C制備：添加過氧化氫；二價(jià)還原形式細(xì)胞色素 C制備：添加連二亞硫酸鈉，現(xiàn)用現(xiàn)配。實(shí)驗(yàn)中所用的Cytc濃度均為1 uM，H2O2以及Na2S2O4試劑濃度分別配制為10 mM、0.5M。

將高濃度的Cytc溶解在不同離子強(qiáng)度、pH、溫度的磷酸鹽緩沖液，及不同緩沖溶液和擁擠試劑中，蛋白的終濃度為1×10-5mol/L；分別將樣品通入一定量的NO，通氣速率為100個(gè)氣泡/分，時(shí)間為2 min；取通NO后的Cytc樣品用氙燈進(jìn)行光照。

紫外光譜的測定：將已處理的Cytc樣品至于1 cm方形比色杯中測定，測定條件為：狹縫寬度：2 nm，掃描范圍：220～700 nm，掃描速率：400 nm/min，響應(yīng)時(shí)間：中等。

時(shí)間過程光譜測定：將細(xì)胞色素 C（未處理的，Cytc(WT)）、高鐵形式細(xì)胞色素C（Cyt c-Fe(III)）和還原態(tài)細(xì)胞色素C（Cyt c-Fe(II)）三種樣品分別置于10 mm光徑的方形石英比色皿中測定，測定條件：波長設(shè)置為416 nm、562 nm，靈敏度調(diào)置為高，響應(yīng)時(shí)間間隔：2 s，其他條件同紫外-可見吸收光譜測定。

電子順磁共振譜測定：液氮條件下，進(jìn)行樣品檢測，儀器測定條件為：功率9.33 GHz，6-G，10.2 mW，掃描速度：83.97 s，掃描范圍：2900～3900 G，時(shí)間常量：40.96 ms，溫度：100 K，最終結(jié)果為掃描次數(shù)20次的平均結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同價(jià)態(tài)的Cyt c與NO之間配位反應(yīng)過程的紫外吸收光譜

Cytc與NO相互作用的紫外吸收光譜如圖1所示，圖1A為Fe(III)-Cytc與NO相互作用的UV-Vis吸收光譜，由圖1A可知Fe(III)-CytcSoret帶的409 nm處吸收峰紅移且吸收強(qiáng)度增大，Q帶530 nm處的吸收峰強(qiáng)度增大，同時(shí)在562 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，F(xiàn)e(III)-Cytc與NO配位結(jié)合生成Cytc-NO配合物。圖1B為亞鐵細(xì)胞色素C(Fe(II)-Cytc)與NO相互作用的UV-Vis吸收光譜，由圖1B可知隨著NO通入量的增加，其soret帶的吸收峰由415 nm藍(lán)移到409 nm，Q帶520 nm與550 nm處吸收峰消失，在530 nm處出現(xiàn)新的單一小峰，隨著NO的繼續(xù)增加Soret帶的吸收峰由409 nm紅移到416 nm，同時(shí)Q帶在562 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，逐漸生成細(xì)胞色素C-NO配合物(Cytc-NO)。因此，不同價(jià)態(tài)的Cytc與NO反應(yīng)的過程為：Fe(II)-Cytc先被氧化為高鐵細(xì)胞色素C(Fe(III)-Cytc)，后者與NO配位形成Cytc-NO配合物[19]。根據(jù)Gouterman 四軌道模型理論，Cytc分子的 Soret帶是由其卟啉中的外層電子躍遷所產(chǎn)生的，其歸屬為π-π*躍遷的第二電子激發(fā)單重態(tài)。當(dāng)NO與Fe(III)-Cytc分子進(jìn)行配位反應(yīng)時(shí)，由于NO分子具有較強(qiáng)的親核性，其電荷通過 Fe3+轉(zhuǎn)移到卟啉環(huán)上，從而使得卟啉環(huán)上電子云密度增大，導(dǎo)致π軌道能量增加，與π*間的能級(jí)差減小，即π→π*能級(jí)差降低，從而造成 Soret帶的紅移[20]。根據(jù)之前的研究結(jié)果，推斷出其配位反應(yīng)機(jī)制為：NO氣體在溶液中以NO·形式存在，促使Cytc分子微環(huán)境發(fā)生改變，同時(shí)，NO進(jìn)入到Heme腔中使其極性改變，使Met80與Heme之間作用力減弱，導(dǎo)致Met與Heme之間的配位鍵斷裂，經(jīng)過分子間重排，血紅素中心Fe與NO之間形成新的Fe-N配位鍵，但新形成的配位鍵不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生斷裂，解離再次生成五配位的 Fe，與溶液中的H2O分子結(jié)合，最終達(dá)到一個(gè)平衡。

圖1 Cyt c與NO相互作用的紫外吸收光譜

2.2 Cyt c與proliNONOate 相互作用的電子順磁共振光譜

電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）是由不配對(duì)電子的磁矩發(fā)源的一種磁共振技術(shù)，可用于從定性和定量方面檢測物質(zhì)原子或分子中所含的不配對(duì)電子，并探索其周圍環(huán)境的結(jié)構(gòu)特性。研究生物組織中的順磁金屬離子，包括過渡族金屬離子，對(duì)一些動(dòng)物組織、植物材料和微生物都能見到銅（Ⅱ）、錳（Ⅱ）或鐵的EPR信號(hào)。

圖2 細(xì)胞色素c與NO相互作用的電子順磁光譜

圖2A中顯示單獨(dú)存在的Cytc沒有順磁信號(hào)，但是在樣品中添加了少量的proliNO/NO后，出現(xiàn)弱的順磁信號(hào)，隨著proliNO/NO添加量的增加，信號(hào)更加明顯，見圖 2B。但是生成的六配位的亞硝酰血紅素鐵不穩(wěn)定，因此，隨著時(shí)間的推移發(fā)生了解離，見圖 2C，與 2.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。圖 2D顯示，proliNO/NO直接加到緩沖液中也沒有順磁信號(hào)。

本文在此基礎(chǔ)上研究不同環(huán)境因素對(duì) Cytc與NO結(jié)合及解離的影響。由于Fe(II)-Cytc要先被氧化為Fe(III)-Cytc再與NO反應(yīng)，因此實(shí)驗(yàn)過程中均以Fe(III)-Cytc進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 不同外界條件對(duì)Cyt c與NO結(jié)合反應(yīng)的影響

Cytc在生物體內(nèi)與NO的結(jié)合受到環(huán)境中多種因素的影響，因此我們分別考察了氧氣、離子強(qiáng)度、酸堿度、溫度、不同緩沖體系、擁擠環(huán)境等因素對(duì)二者結(jié)合反應(yīng)的影響。

2.3.1 O2對(duì)Cyt c與NO結(jié)合反應(yīng)的影響

O2是需氧生物生存的必需條件，在呼吸鏈中必不可少，Cytc是呼吸鏈的主要成分之一，因此在研究Cytc與NO相互作用的過程中，O2是一個(gè)重要因素，可能會(huì)對(duì)其反應(yīng)產(chǎn)生影響。圖3A為通NO前，Cytc通入N230 min排除O2后與未排O2的UV-Vis吸收光譜，由圖3A可知Cytc去O2前后光譜沒有發(fā)生任何變化，說明O2對(duì)Cytc溶液本身沒有影響。圖3B為Cytc排O2前后與NO反應(yīng)的UV-Vis吸收光譜，由圖3B可知通入相同量的NO，排O2后Cytc與NO相互作用的UV-Vis吸收光譜的Soret帶的特征峰在416 nm而含O2的Cytc在413 nm，Q帶特征峰都在530 nm和562 nm，但前者吸收強(qiáng)度大于后者，說明生成的Cytc-NO更多，即O2對(duì)Cytc與NO之間的配位反應(yīng)產(chǎn)生一定的阻力，但并不參與其反應(yīng)。這與本實(shí)驗(yàn)室之前所做的metMb與NO反應(yīng)時(shí)，少量的O2能夠促進(jìn)其反應(yīng)的結(jié)果相反，其原因主要是兩種蛋白的結(jié)構(gòu)不同，metMb中血紅素鐵是五配位，而Cytc是六配位，同時(shí)在肌紅蛋白的血紅素中存在一個(gè)口袋結(jié)構(gòu)而在細(xì)胞色素c中沒有，因此在Cytc與NO反應(yīng)的過程中O2無法進(jìn)入到其內(nèi)部，而是消耗一部分 NO，使其生成產(chǎn)物減少，反應(yīng)速率減慢。實(shí)驗(yàn)中向Cytc中通入過量的O2，發(fā)現(xiàn)對(duì)其紫外吸收沒有影響(結(jié)果與圖3A相同，此處未列出)。

2.3.2 離子強(qiáng)度對(duì)Cyt c與NO結(jié)合的影響

在不同離子強(qiáng)度的緩沖溶液中，Cytc與NO反應(yīng)時(shí)Soret帶(416 nm)與Q帶(562 nm)處峰面積變化如圖4所示。由圖4可知，隨離子強(qiáng)度的增大反應(yīng)速率逐漸降低，Soret帶(416 nm)與Q帶(562 nm)處的峰面積都逐漸減少，離子強(qiáng)度由 0.01 mol/L到 0.05 mol/L變化最明顯，隨離子強(qiáng)度的繼續(xù)增加，變化逐漸減小，但仍有微弱的變化。在離子強(qiáng)度低的溶液中，Cytc易發(fā)生去折疊，形成伸展結(jié)構(gòu)[21]，所以NO進(jìn)入到其Heme中受到的阻力小，但隨離子強(qiáng)度的增大，Cyt c易發(fā)生折疊反應(yīng)，血紅素周圍的結(jié)構(gòu)更緊湊，NO進(jìn)入CytcHeme中的阻力增大，以至Cytc與NO反應(yīng)受阻，因此隨著離子強(qiáng)度的增大，反應(yīng)生成的Cytc-NO配合物逐漸減少。隨緩沖溶液濃度的增強(qiáng)，其緩沖能力增大，但當(dāng)溶液溶度過低時(shí)，緩沖溶液受外界離子的干擾過大，因此綜合以上原因，實(shí)驗(yàn)過程選取0.05 mol/L的緩沖溶液。

圖3 O2對(duì)cyt c與NO相互作用的影響的紫外-可見吸收光譜

2.3.3 pH對(duì)Cyt c與NO結(jié)合的影響

圖5為不同pH溶液中Cytc通NO前后Soret 帶(416 nm)與Q帶(562 nm)峰面積變化。由圖5可知，在低于生理pH時(shí)，隨pH的增大，Soret帶(416 nm)與Q帶(562 nm)峰面積通氣前后變化逐漸減小，而當(dāng)pH＞8后，其變化基本不變。Cytc在低pH溶液中，其二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角會(huì)向β-折疊轉(zhuǎn)變[22]，溶液的pH越低對(duì)Cytc結(jié)構(gòu)的影響越大，促使氧化態(tài)Cytc的生成，而氧化態(tài)的Cytc易與NO結(jié)合，因此其在Soret 帶(416 nm)與Q帶(562 nm)的吸收峰面積的變化越大，Cytc與NO結(jié)合的越多，隨pH增大變化峰面積逐漸減小，結(jié)合速率減慢；但當(dāng)pH由酸性變?yōu)閴A性時(shí)，Cytc自身會(huì)向還原態(tài)轉(zhuǎn)變，而還原態(tài)的Cytc不易與NO結(jié)合，因此Cytc與NO結(jié)合的反應(yīng)速率下降。因?yàn)樯韕H為7.4，所以實(shí)驗(yàn)過程中選取pH為7.4進(jìn)行，所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有參考價(jià)值。

圖4 不同離子強(qiáng)度中Cyt c與NO反應(yīng)吸收峰面積變化

圖5 不同 pH溶液中Cyt c通NO前后峰面積變化

2.3.4 溫度對(duì)Cyt c與NO結(jié)合的影響

在不同的溫度下，Cytc與NO的反應(yīng)如圖6所示。由圖6可知隨溫度的升高，Soret帶(416 nm)與Q帶(530 nm和560 nm)的峰面積都是先上升后下降的趨勢，Soret帶在293 K時(shí)面積達(dá)到最大，Q帶在283 K時(shí)峰面積最大，說明在283～293 K溫度范圍內(nèi)為溶液反應(yīng)的適合溫度，反應(yīng)完全。溫度的改變引起Cytc蛋白構(gòu)象的變化，而Cytc蛋白構(gòu)象的變化會(huì)直接影響其血紅素卟啉環(huán)與NO的結(jié)合速率，當(dāng)溫度較低時(shí)，Cytc自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，處于低能狀態(tài)，NO進(jìn)入溶液后受到的阻力較大，不易與之結(jié)合，使得反應(yīng)生成的配合物較少，但隨著溫度的升高，Cytc自身的能量升高，分子變得活潑，易與NO反應(yīng)，生成的配合物增多，使其相應(yīng)位置的吸收峰面積也增大，而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，可能會(huì)破壞一部分Cytc的結(jié)構(gòu)，使其構(gòu)象發(fā)生改變，無法與NO反應(yīng)，同時(shí)溫度過高時(shí)NO在溶液中的溶解度降低，使得溶液中的NO量減少，因此Cytc與NO結(jié)合生成的配合物會(huì)迅速減少，吸收峰的面積也大量降低。因此Cytc與NO反應(yīng)的溫度應(yīng)該控制在283～293 K之間，過高過低都會(huì)使得反應(yīng)現(xiàn)象不明顯。

圖6 Cyt c與NO反應(yīng)的峰面積隨溫度變化圖

2.3.5 不同緩沖溶液對(duì)Cyt c與NO反應(yīng)的影響

Cytc通NO前在不同緩沖溶液中的紫外吸收光譜如圖7A所示，由于Cytc在酸性環(huán)境中以氧化態(tài)存在，在堿性環(huán)境中以還原態(tài)存在，因此實(shí)驗(yàn)中分別選取pH=7.4的酸性緩沖溶液（HAc-NaAc)、堿性緩沖溶液(Tris-Hcl)以及中性緩沖溶液(PB)，由圖7A可知在不同的緩沖溶液中，Cytc在soret帶409 nm處的特征吸收峰的位置沒有變化，只是其吸收峰的強(qiáng)度發(fā)生了微弱的變化；而 Q帶變化明顯，在 Tris-Hcl中Cytc部分被還原，HAc-NaAc中沒有變化。不同緩沖溶液中Cytc中通入NO后，其soret帶與Q帶的峰面積變化如圖7B所示，由圖7B可知HAc-NaAc緩沖溶液的變化是最明顯的，而Tris-Hcl 較PB緩沖溶液其面積變化減少，因?yàn)樵贖Ac-NaAc溶液中有利于Fe(III)-Cytc的存在，而Fe(III)-Cytc易與NO結(jié)合，因此利于反應(yīng)的進(jìn)行，而堿性環(huán)境中Cytc主要以還原態(tài)存在，由于Fe(II)-Cytc在與NO結(jié)合的過程中要先生成Fe(III)-Cytc，因此在堿性緩沖溶液中，Cytc-NO配合物生成速率下降。為使實(shí)驗(yàn)條件更接近生理環(huán)境，因此實(shí)驗(yàn)中選取pH=7.4磷酸緩沖溶液更合適，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也更接近于生理?xiàng)l件。

圖7 不同緩沖液中Cyt c的紫外吸收光譜及其與NO相互作用后的峰面積的變化

2.3.6 擁擠試劑對(duì)Cyt c與NO結(jié)合的影響

通常所進(jìn)行的蛋白質(zhì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)均以稀溶液作為緩沖體系完成的，但真實(shí)的細(xì)胞環(huán)境是非常復(fù)雜的，存在各種大分子，處在一個(gè)擁擠的環(huán)境中，Sasahara等[23]發(fā)現(xiàn)擁擠試劑可以促進(jìn)折疊的蛋白質(zhì)折疊為更為緊致的結(jié)構(gòu)，此外McPhie等[24]也發(fā)現(xiàn)增加大分子擁擠試劑的濃度能促進(jìn)折疊的脫輔基血紅素蛋白向熔球態(tài)轉(zhuǎn)變。本實(shí)驗(yàn)研究了不同擁擠環(huán)境中Cytc與NO相互作用，其soret帶與Q帶峰面積如圖8所示，圖8可知Dextran70與PB緩沖溶液中soret帶與Q帶的面積基本相同，而Ficoll 70其面積明顯減少。Dextran 70是一種長度約為0.4 nm，無交聯(lián)線性的，相對(duì)靈活的大分子聚合物，其在溶液中易形成準(zhǔn)隨機(jī)螺旋，排阻體積效應(yīng)小[25]，可以容納更多的間隙空間，對(duì)Cytc的束縛能力較弱，而Ficoll 70是高度交聯(lián)構(gòu)成的剛性共聚體[26]，造成溶液中可移動(dòng)的空間減少，對(duì)Cytc的束縛能力較強(qiáng)，同時(shí)擁擠試劑形成的擁擠環(huán)境降低了NO的擴(kuò)散系數(shù)，因此減弱了NO與Cytc的相互作用，且Ficoll 70對(duì)其影響較明顯，說明其能夠穩(wěn)定了蛋白中血紅素的結(jié)構(gòu)，延遲了與溶液中NO分子的反應(yīng)。

圖8 不同的擁擠試劑中Cyt c與NO結(jié)合的峰面積變化

2.4 光照對(duì)亞硝酰細(xì)胞色素C解離的影響

光是生物有機(jī)體生活環(huán)境中必然存在的，而Cytc中含有一個(gè)血紅素輔基結(jié)構(gòu)，其能吸收特定波長的光，劉艷偉[27]等研究發(fā)現(xiàn)其在280 nm處的吸收最大，因此本文選取280 nm的波長進(jìn)行光照，發(fā)現(xiàn)光照對(duì)Cytc-NO的解離具有促進(jìn)作用。圖9為Cytc-NO光照前后解離的面積變化圖，其中曲線2為光照后的解離曲線。由圖9可知光照與未光照Cytc-NO的解離都遵循方程(1)如下：

其中Y是面積，A是振幅，k是解離速率常數(shù)，y0是截距(表1)，由表1可知，光照前后其反應(yīng)速率k1/k2=0.5，光照后 Cytc-NO的解離速率是原來的 2倍，光照后血紅素基團(tuán)吸收能量，因此使得整個(gè)Cytc-NO分子的能量增高，血紅素周圍的電子分布發(fā)生改變，導(dǎo)致整個(gè)分子的穩(wěn)定性降低，生成的Fe-N變?nèi)?，更易發(fā)生斷裂，因此光照會(huì)促進(jìn)Cytc-NO的解離。

表1 Cyt c-NO光照和未光照下解離速率常數(shù)和相關(guān)參數(shù)值

圖9 光照前后Cyt c與NO反應(yīng)配合物解離面積變化

3 結(jié) 論

本文采用光譜法證實(shí)了Cytc與NO能發(fā)生配位反應(yīng)，并且研究了不同的外界條件，如離子強(qiáng)度、pH、溫度、緩沖溶液、及擁擠試劑對(duì)Cytc與NO配位反應(yīng)和光照對(duì)Cytc-NO解離反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨離子強(qiáng)度的增大反應(yīng)速率逐漸降低，酸性pH下有利于Cytc與NO配位，而堿性pH則會(huì)抑制其反應(yīng)的進(jìn)行，溫度過高過低都不利于Cytc與NO配位反應(yīng)的進(jìn)行，控制溫度在283～293 K之間，有利于反應(yīng)的進(jìn)行，酸性緩沖溶液較堿性緩沖溶液更有利于配位反應(yīng)的進(jìn)行，而擁擠試劑Ficoll 70對(duì)于穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)效果更好，使Cytc不易與NO反應(yīng)，光照會(huì)促進(jìn)Cytc-NO的解離，因此控制溫度在283～293 K之間，pH=7.4的0.05 mol/L的PB緩沖溶液的近生理?xiàng)l件是Cytc與NO配位結(jié)合反應(yīng)的最佳條件。本研究對(duì)于進(jìn)一步研究Cytc與NO配位反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以及結(jié)合中間態(tài)的研究提供了最佳的反應(yīng)條件。

[1]BURMESTER T, WEICH B, REINHARDT S, et al. A vertebrate globin expressed in the brain[J]. Nature, 2000,407(6803): 520-523.

[2]唐乾, 張?jiān)? 曹洪玉, 等. 光譜法研究高鐵肌紅蛋白活性中心與一氧化氮的配位反應(yīng)[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2015,5(7): 1967-1972.

[3]Ma J Y, ZHENG X fF, TANG Q, et al. Investigation on the photo-induced de-oxygenation process of myoglobin in aqueous solution by use of fluorescence spectroscopy[J].Science in China B, 2008, 51(5): 141-419.

[4]趙慧卿, 汪顯陽. 一氧化氮、一氧化碳與血紅素的配位化學(xué)及其生理作用[J]. 化學(xué)教育, 2004(03): 4-6.

[5]李濤, 呂榮, 于安池. 時(shí)間分辨拉曼光譜研究一氧化氮與肌紅蛋白的結(jié)合過程[J]. 物理化學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 26(01): 18-22.

[6]渠敏, 李家璜, 張淑儀, 等. 時(shí)間分辨光聲量熱法研究碳氧血紅蛋白的光解反應(yīng)[J]. 聲學(xué)學(xué)報(bào): 中文版, 2008, 33(05): 425-429.

[7]NIENHAUS K, PALLADINO P, NIENHAUS G U. Structural Dynamics of Myoglobin: FTIR-TDS Study of NO Migration and Binding [J]. Biochemistry, 2007, 47(3): 935- 948.

[8]IONASCU D, GRUIA F, YE X, et al. Temperature-Dependent Studies of NO Recombination to Heme and Heme Proteins[J].Journal of the American Chemical Society, 2005, 127(48):16921-16934.

[9]LARSON S K, DWYER D S, LO H H, et al. Mitochondrial cytochrome c reacts with nitric oxide via S-nitrosation[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2006, 342(3): 991-995.

[10]CASSINA A M, HODARA R, SOUZA J M, et al.Cytochrome c nitration by peroxynitrite[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(28): 21409-21415.

[11]SIMONE M J, KREISHMAN G P. Determination of the formal reduction potential, the electron stoichiometry, and the magnitude of the conformational change upon reduction for cytochrome c from potential-dependent fluorescence spectra[J]. Analytical Biochemistry, 1983, 132(1): 142-146.

[12]楊昌英, 李敏, 付靜,等. 脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞色素 C 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 26(02): 153-156.

[13]Bruhwyler J, Chleide E, Liegeois J F, et al. Nitric oxide: a new messenger in the brain[J]. Neurosci Biobehav Rev, 1993,17(4): 373-384.

[14]AJJURI R R, O'Donnell J M. Novel whole-tissue quantitative assay of nitric oxide levels in Drosophila neuroinflammatory response [J]. J. Vis. Exp., 2013, (82):50892.

[15]RATHNASIRI BANDARA S M. Migraine and psychiatric disorders comorbidity explained by sinus hypoxic nitric oxide theory ---a new hypothesis on the Sino rhinogenic theory [J].Medical Hypotheses, 2014, 82(3): 257-265.

[16]INAMDAR A A, BENNETT J W. A common fungal volatile organic compound induces a nitric oxide mediated inflammatory response in Drosophila melanogaster[J]. Scientific Reports, 2014(4): 3833.

[17]ORII Y, SHIMADA H. Reaction of Cytochrome c with Nitrite and Nitric Oxide: A Model of Dissimilatory Nitrite Reductase. Journal of Biochemistry, 1978, 84(6): 1543-1552.

[18]SHARPE M A, COOPER C E. Reactions of nitric oxide with mitochondrial cytochrome c: a novel mechanism for the formation of nitroxyl anion and peroxynitrite. Biochem. J.,1998, 332(1): 9-19.

[19]唐乾, 史珊珊, 曹洪玉, 等. 細(xì)胞色素c與NO反應(yīng)機(jī)制[J].無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 31(8): 1511-1519.

[20]王樹軍.光譜法研究硝基苯基卟啉鋅與咪唑類的軸向配位反應(yīng)[J].應(yīng)用化學(xué), 2010, 27(06): 721-726.

[21]GOTO Y, HAGIHARA Y, HAMADA D, et al. Acid-induced unfolding and refolding transitions of cytochrome c: A three-state mechanism in water and deuterium oxide[J].Biochemistry, 1993, 32(44): 11878-11885.

[22]BALAKRISHNAN G, HU Y, OYERINDE O F, et al. A conformational switch to beta-sheet structure in cytochrome c leads to heme exposure. Implications for cardiolipin peroxidation and apoptosis[J]. Journal of the American Chemical Society, 2007, 129(3): 504-505.

[23]SASAHARA K, MCPHI P, MINTON A P. Effect of Dextran on Protein Stability and Conformation Attributed to Macromolecular Crowding[J]. Journal of molecular biology,2003, 326(4): 1227-1237.

[24]MCPHIE P, NI Y S, MINTON A P. Macromolecular Crowding Stabilizes the Molten Globule Form of Apomyoglobin with Respect to Both Cold and Heat Unfolding[J]. Journal of molecular biology, 2006, 361(1):7-10.

[25]MUKHERJEE S, WAEGELE M M, CHOWDHURY P, et al.Effect of macromolecular crowding on protein folding dynamics at the secondary structure level[J]. J Mol Biol, 2009,393(1): 227-236.

[26]VENTUROLI D, RIPPE B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity:effects of molecular size, shape, charge, and deformability y[J]. American Journal of Physiology - Renal Physiology, 2005,288(4): 605-613.

[27]劉艷偉, 曹洪玉, 唐乾, 等. 大分子擁擠條件下光誘導(dǎo)細(xì)胞色素C還原的光譜研究[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào), 2014,72: 246-252.