復(fù)方龍芩草微乳提取液有效成分體外抗H1N1流感病毒的藥效研究

劉曉艷++李妍++劉帥++李衛(wèi)飛++顧立剛++劉曉婷

摘要：目的 研究復(fù)方龍芩草微乳提取液中有效成分體外抗H1N1流感病毒增殖的作用，觀察微乳提取液中有效成分對流感病毒的抑制率。方法 用均勻設(shè)計(jì)法安排實(shí)驗(yàn)，MTT法檢測藥物對H1N1流感病毒致A549細(xì)胞病變的抑制效率（ER），以ER為指標(biāo)，運(yùn)用Minitab17軟件建立數(shù)學(xué)模型得出各因素之間的回歸方程，分析各成分對ER的作用關(guān)系并優(yōu)選出具有最佳抗H1N1流感病毒效果的有效成分比例。結(jié)果 復(fù)方成分中，黃芩苷發(fā)揮最顯著的抗病毒作用，甘草苷對細(xì)胞病變有一定的抑制作用，5種成分對ER存在協(xié)同或制約性的關(guān)系。每毫升藥液含甘草苷、黃芩苷、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸分別為13.94 μg、49.44 μg、0.23 mg、1.25 mg、2.50 mg時ER值最佳，經(jīng)驗(yàn)證ER值為85.34%±4.72%。結(jié)論 復(fù)方龍芩草微乳提取液有效成分的優(yōu)化組合能較好發(fā)揮抗H1N1流感病毒的作用。

關(guān)鍵詞：復(fù)方龍芩草；微乳提取液；均勻設(shè)計(jì)；H1N1流感病毒；A549細(xì)胞

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.013

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）01-0049-06

Study on Anti-influenza Virus H1N1 Activity of Main Ingredients from Microemulsion Extract of Compound Longqincao in Vitro LIU Xiao-yan1， LI Yan1， LIU Shuai1， LI Wei-fei1， GU Li-gang2， LIU Xiao-ting2， DU Hong1 （1.School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China； 2. Educational Ministry Key Laboratory of Preventing and Treating Viral Diseases with Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract： Objective To study the effects of main ingredients from microemulsion extract of Compound Longqincao in vitro on anti-influenza virus H1N1 activity； To analyze effects of main ingredients from microemulsion extract on influenza virus inhibition rate. Methods Uniform design was used to conduct the experiment. MTT method was used to detect the effect rate （ER） of anti-influenza virus H1N1 on A549 cells. Setting ER as the index， Minitab17 software was used to establish mathematical model to come up with regression equations of all factors. The effects of ingredients on ER were analyzed and the efficient composition ratio of the optimum anti-influenza virus H1N1 was chosen. Results In the compound compatibility， baicalin showed the most obvious antivirus activity， and licorice glycosides had certain inhibition effects on pathological changes of cells. Five ingredients had coordinative or controlled relation with ER. When per milliliter liquids containing licorice glycosides， baicalin， leucine， aspartic acid， glutamic acid was 13.94 μg， 49.44 μg， 0.23 mg， 1.25 mg， and 2.50 mg， ER was the best. ER was 85.34%±4.72% after verification. Conclusion The optimized combination of main ingredients from microemulsion extract of Compound Longqincao can better play a role in anti-influenza virus H1N1.

Key words： Compound Longqincao； microemulsion extract； uniform design； H1N1 influenza virus； A549 cells

甲型H1N1流感是由H1N1流感病毒引起的一種

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81102815）；教育部博士點(diǎn)新教師基金（20110013120017）；北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生自主課題（2016-JYB-XS069）endprint

通訊作者：杜紅，E-mail：duhong@vip.163.com

傳染迅速、死亡率高的呼吸道傳染病[1]。復(fù)方龍芩草由黃芩、甘草和地龍3味中藥組成，具有清肺利咽、解毒瀉熱之功效[2-3]，對甲型H1N1流感具有較好的抵抗效果[4]。復(fù)方龍芩草微乳提取液是以生物相容性微乳為溶劑，運(yùn)用滲漉法對復(fù)方龍芩草進(jìn)行提取而得，能較好地抑制H1N1流感病毒增殖[5]。近年來，中藥有效組分或成分配伍研究逐漸受到青睞，復(fù)方中有效成分配伍往往可提高療效，改善復(fù)方成分復(fù)雜、作用機(jī)制不明確的缺陷[6]，均勻設(shè)計(jì)法在復(fù)方有效成分或組方配伍的藥效篩選中具有明顯的優(yōu)勢[7-8]。本實(shí)驗(yàn)以復(fù)方龍芩草微乳提取液中含量較高的成分黃芩苷、甘草苷及地龍中的氨基酸為基礎(chǔ)，從細(xì)胞水平探討其對H1N1流感病毒致細(xì)胞病變的抑制作用，擬設(shè)計(jì)出藥效物質(zhì)基礎(chǔ)明確、安全有效的抗H1N1流感病毒的有效成分組方，為后續(xù)研究提供思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 病毒和細(xì)胞

甲型H1N1流感病毒，A1/黔防/166/85株，中國中醫(yī)科學(xué)院提供，-75 ℃冷藏，血凝滴度為2～7。人肺腺癌細(xì)胞（A549），中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。

1.2 藥物

甘草苷（批號111610-201106，40 mg/支）、黃芩苷（批號110715-201318，100 mg/支）、谷氨酸（批號140690-201203，100 mg/支）、天冬氨酸（批號140691-200401，100 mg/支）、亮氨酸（批號140687- 201102，100 mg/支），中國食品藥品檢定研究院；磷酸奧司他韋膠囊（達(dá)菲，75 mg/粒），瑞士巴塞爾豪夫邁羅氏公司，批號H20044397。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清、McCoy's 5A培養(yǎng)基，美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲亞砜（DMSO），Sigma公司；0.25%胰酶-0.02%EDTA，北京普博欣生物科技有限公司；三聯(lián)溶解液（含SDS 10 g、異丁醇5 mL、10 mol/L HCl 0.1mL）；細(xì)胞培養(yǎng)液：McCoy's 5A培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素）；細(xì)胞維持液：McCoy's 5A培養(yǎng)基（含2%胎牛血清和1%青-鏈霉素）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（BINDER WMK-02型），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），超凈工作臺（北京碧都凈化設(shè)備有限公司），酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司），水浴箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠），Astell全自動高壓滅菌器（北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

從-75 ℃冰箱取出A549細(xì)胞復(fù)蘇，傳代3～4次，細(xì)胞生長良好時以0.25%胰酶-0.02%EDTA消化細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×108個/L，充分混勻后將該細(xì)胞液以每孔100 μL加入96孔板中，35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)數(shù)小時使細(xì)胞以單層狀態(tài)鋪滿培養(yǎng)瓶底層。用細(xì)胞維持液將黃芩苷、甘草苷、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和達(dá)菲分別連續(xù)對倍遞次稀釋至不同濃度，加入96孔板中，每孔100 μL，每個濃度平行設(shè)6個復(fù)孔，同時設(shè)正常細(xì)胞對照組。35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，加入MTT（終濃度為0.5 mg/mL），培養(yǎng)4 h后每孔加100 μL SDS，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，于酶標(biāo)儀波長570 nm處測定細(xì)胞吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率（實(shí)驗(yàn)組A值÷正常細(xì)胞對照組A值×100%）。

2.2 病毒致細(xì)胞病變實(shí)驗(yàn)

取已長成單層細(xì)胞的96孔板，吸出培養(yǎng)液，每孔加PBS清洗2次，每孔接種100 ?L 100TCID50病毒液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h后吸出病毒液，加入最大無毒濃度下6個相應(yīng)稀釋度的黃芩苷、甘草苷、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸溶液，以達(dá)菲為陽性對照組，同時設(shè)正常細(xì)胞對照組和病毒對照組，每孔100 ?L，每濃度設(shè)4個復(fù)孔。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果，細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）用0%～25%（+）、25%～50%（++）、50%～75%（+++）、75%～100%（++++）表示，當(dāng)病毒對照組CPE為++++時記錄結(jié)果。隨后加入MTT（終濃度為0.5 mg/mL），每孔10 ?L，4 h后加100 ?L/孔SDS，培養(yǎng)8 h，于酶標(biāo)儀波長570 nm處測定A值。計(jì)算藥物抗病毒效率（ER）。ER（%）=（藥物組平均A值-病毒對照組平均A值）÷（正常細(xì)胞對照組平均A值-病毒對照組平均A值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2.3 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)每個有效成分對流感病毒的ER及對細(xì)胞形態(tài)的影響情況設(shè)置均勻試驗(yàn)的上下限，根據(jù)均勻設(shè)計(jì)水平數(shù)不得少于2倍因素?cái)?shù)的原則，本試驗(yàn)采用5因素10水平[U10*（105 ）]設(shè)計(jì)試驗(yàn)，D=0.241 4，指標(biāo)數(shù)為1，見表1。

2.4 細(xì)胞病變抑制率測定

根據(jù)表1安排的試驗(yàn)進(jìn)行藥物組分對細(xì)胞病變抑制率檢測，取已長成單層細(xì)胞的96孔板，吸出培養(yǎng)液，每孔加入100 ?L 100TCID50病毒液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱吸附2 h后，吸出病毒液，加入表1中的10組藥液，每孔100 ?L，以達(dá)菲為陽性藥物對照組，同時設(shè)正常細(xì)胞對照組和病毒對照組，每濃度設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入MTT（終濃度為0.5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加SDS，12 h后于酶標(biāo)儀波長570 nm處測定A值，計(jì)算ER。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2.5 組分配比的優(yōu)選

根據(jù)均勻試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Minitab17軟件對結(jié)果進(jìn)行分析處理，探討各成分對抗病毒效率的影響及相互關(guān)系，并優(yōu)選出具有最佳抗H1N1流感病毒效果的5種有效成分的配比。endprint

2.6 最佳抗病毒效果的驗(yàn)證

取已長成單層細(xì)胞的96孔板，吸出培養(yǎng)液，加入PBS清洗細(xì)胞2次，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，驗(yàn)證有效成分配比的ER。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 有效成分的細(xì)胞毒性

較高濃度黃芩苷可使A549細(xì)胞變圓、破碎、折光率增加，當(dāng)濃度為50 μg/mL時細(xì)胞存活率變化不明顯，細(xì)胞形態(tài)、折光率、數(shù)量與正常細(xì)胞對照組無明顯差異，25 μg/mL時與空白對照組比較，細(xì)胞形態(tài)幾乎無變化。甘草苷對細(xì)胞形態(tài)的影響與黃芩苷相似，濃度為25 μg/mL時細(xì)胞形態(tài)、貼壁狀態(tài)等與空白對照組比較無顯著差異。天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸濃度均為5 mg/mL時，對細(xì)胞基本無毒性，與空白對照組比較無明顯差異。

4.2 有效成分對病毒致細(xì)胞病變抑制率的影響

當(dāng)黃芩苷濃度為50 μg/mL，ER值為87.810%± 1.905%時，對病毒致細(xì)胞病變的抑制作用最明顯，隨黃芩苷濃度降低，ER值逐漸變小。甘草苷濃度在25 μg/mL時能部分抑制細(xì)胞的病變，ER值也隨濃度的降低而下降，二者ER均呈一定的量效關(guān)系，見表2。天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸抗病毒效果不明顯，但在2.5～0.625 mg/mL濃度范圍內(nèi)，ER值大于空白對照組。

4.3 藥物不同配比對細(xì)胞病變抑制率的影響

根據(jù)“4.2”項(xiàng)中5個成分在細(xì)胞安全的劑量范圍內(nèi)ER值的大小，將每毫升藥液中黃芩苷、甘草苷的用量范圍分別設(shè)為50～12.5 μg和25～12.5 μg，結(jié)合氨基酸對細(xì)胞形態(tài)變化的影響，設(shè)亮氨酸用量范圍為2.5～0.625 mg，天冬氨酸為1.25～0.625 mg，谷氨酸為2.5～1.25 mg。均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

4.4 數(shù)學(xué)模型的建立

4.4.1 回歸方程的建立 運(yùn)用Minitab17.0軟件處理均勻試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用逐步回歸分析法，引入對ER顯著變量，剔除不顯著變量，擬合得到回歸方程Y=0.357 700-0.003 248X2+0.025 440X1+0.000 525X22+0.001 958X52-0.001 213X1X2-0.086 280X3X4-0.000 418X2X3X5，其系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)和方差分析見表4、表5。從表4可以看出，在回歸方程模型中，除X52項(xiàng)外，其他各項(xiàng)系數(shù)均P<0.05，表5中回歸方程P<0.001，說明該模型表示的指標(biāo)與各變量間的關(guān)系具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，方程擬合良好?；貧w方程殘差圖見圖1。

回歸方程的實(shí)測相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8，近似于預(yù)測相關(guān)系數(shù)0.999 5。圖1顯示，正態(tài)概率分布擬合良好，各組實(shí)驗(yàn)值圍繞殘差等于0的直線上下隨機(jī)分布，從另一個角度說明回歸方程對原觀測值的擬合情況良好，復(fù)方龍芩草微乳提取液中有效成分與指標(biāo)ER之間存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系，運(yùn)用此方程能夠預(yù)算變量范圍內(nèi)的指標(biāo)效應(yīng)值。

4.4.2 各成分與抗病毒效率間的關(guān)系分析 從回歸方程及方差分析表可以看出，對ER值影響最顯著的項(xiàng)為X22，可使抗病毒效率顯著增加；其次是X1，在一定程度上也可增加ER值。對ER值影響最顯著的交互項(xiàng)是X1X2，其次是X3X4，表3中X1、X2及二者乘積項(xiàng)系數(shù)的方差膨脹因子均大于10，具有較強(qiáng)的多重共線性關(guān)系，也可以說明二者存在一定的交互作用，而X52和其他幾個自變量的交互作用不強(qiáng)。通過等值線圖可以較為直觀地反映出各變量之間的關(guān)系，見圖2～圖6。

圖2中，X1值為12.50～22.22時，隨著X2值的增加，ER值也隨之增加，當(dāng)X1值為12.50～16.66時，隨著X2值的增加，ER值增加最明顯；當(dāng)X2值為29.00～33.33時，隨著X1值的增加，ER值無明顯變化。

圖3中，當(dāng)X3值<1.665時，ER值隨著X2濃度的增大而增加；當(dāng)X2取任意值時，ER隨著X3濃度的增加而降低，X2值>40時變化最明顯。說明X2濃度較大時，X3的濃度對ER值影響較明顯。

圖4中，當(dāng)X4值在0.625～0.972時，ER值隨X2濃度的增大而增加，而其他濃度范圍對ER值和X2的關(guān)系無明顯影響；當(dāng)X2值較小時，X4濃度對ER值無規(guī)律性的影響。

圖5中，X5值在1.666～2.083時，ER值隨X2濃度的增大而增加，反之X2值固定，X5濃度對ER值也無規(guī)律性的影響?？梢奨4、X5與X2在抗病毒效率方面僅略有交互作用。

圖6中，X4值為0.834時，ER值隨著X3濃度的增加而降低，并且在二者濃度較低的情況下對ER的影響較大。

4.5 組分配比的優(yōu)選

Minitab17軟件中的Response Optimizer響應(yīng)優(yōu)化器在單指標(biāo)和多指標(biāo)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中可起到較好的效果[9]。本實(shí)驗(yàn)對影響病毒致細(xì)胞病變抑制率較為顯著的幾個變量進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)設(shè)定ER的擬合值為95%時，回歸方程中各項(xiàng)優(yōu)化值見圖7?？紤]到實(shí)際藥物的最大無毒濃度及操作需要，經(jīng)計(jì)算5個成分在每毫升藥液中的比例X1∶X2∶X3∶X4∶X5為13.94 μg∶49.44 μg∶0.23 mg∶1.25mg∶2.50 mg，此比例優(yōu)化得到的ER理論值在89.78%～100.22%之間。

4.6 抗病毒效率的驗(yàn)證

為驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)的可靠性，采用優(yōu)選出的比例對復(fù)方龍芩草微乳提取液中黃芩苷、甘草苷、亮氨酸、天冬氨酸和谷氨酸進(jìn)行抗H1N1流感病毒效率的驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，得到的ER值為85.34%±4.72%，基本與模型預(yù)測值一致，驗(yàn)證結(jié)果表明優(yōu)化結(jié)果可信度高。

5 討論endprint

流感病毒是流行性感冒的主要致病因素，甲型H1N1流感病毒是主要的一種。黃芩、板藍(lán)根等單味中藥[10-11]以及復(fù)方制劑[12-13]具有良好的抗病毒效果。

微乳是近年來藥物新劑型的研究熱點(diǎn)，作為藥物載體可以顯著增溶不同極性的藥物成分[14]，用微乳提取蛋白質(zhì)可有效縮短提取時間，維持蛋白質(zhì)的活性[15-16]。生物相容性微乳是本實(shí)驗(yàn)室自行研發(fā)的，在盡量遵守人體內(nèi)的膽固醇、卵磷脂、膽鹽含量比例的前提下制備的澄清透明的熱力學(xué)穩(wěn)定體系，該微乳不僅能提取黃芩、甘草中的植物化學(xué)成分，還能提取地龍中的游離氨基酸、部分蛋白質(zhì)類成分，充分發(fā)揮對動、植物中藥化學(xué)成分的捕集作用。前期實(shí)驗(yàn)測定該微乳液中黃芩苷、甘草苷及天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸的含量高，加之黃芩苷具有顯著的抗H1N1流感病毒作用[17-18]，本研究在測定各成分對細(xì)胞的毒性及ER的基礎(chǔ)上篩選出發(fā)揮最佳抗病毒作用的配方。

本實(shí)驗(yàn)選擇了對呼吸系統(tǒng)疾病造模效果優(yōu)于MDCK細(xì)胞模型的A549細(xì)胞進(jìn)行病毒致細(xì)胞病變作用的研究，與正常細(xì)胞比較，A549細(xì)胞對病毒的毒力耐受性更強(qiáng)，更適合流感病毒的感染，更貼近呼吸系統(tǒng)模型的研究需要，可大大降低實(shí)驗(yàn)失敗率，A549細(xì)胞已成為流感病毒體外實(shí)驗(yàn)研究所用的主要細(xì)胞之一[19]。

對中藥復(fù)方或有效成分配伍的研究，運(yùn)用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)能夠避免多因素產(chǎn)生較多的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，在較少的實(shí)驗(yàn)組別上獲得藥效理想的組方或組分配比[20]。Minitab17軟件為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒑头治鎏峁┝藦?qiáng)大的可信度和準(zhǔn)確性，利用Response Optimize優(yōu)化器優(yōu)化的復(fù)方龍芩草微乳提取液中主要成分黃芩苷、甘草苷、亮氨酸、天冬氨酸和谷氨酸比例的ER值可達(dá)到85.34%±4.72%，可能是由其他不可控因素引起的誤差，使該值略低于理論值。從回歸方程及等值線圖可知，發(fā)揮抗病毒作用最顯著的變量為X2（黃芩苷），能夠顯著增加對病毒致細(xì)胞病變的抑制率，其次是X1（甘草苷），對細(xì)胞病變也有一定的抑制作用，X2與X1、X4、X5之間和X3、X4之間均存在交互作用，5種成分之間存在協(xié)同或制約性的關(guān)系，X3、X4、X5未被引入方程，即三者對抗病毒致細(xì)胞病變抑制率無明顯影響，但在一定程度上影響其他成分對ER的貢獻(xiàn)大小。由此可見，復(fù)方龍芩草微乳提取液中有效成分發(fā)揮抗H1N1流感病毒的作用并非由單一成分決定，而是多種成分綜合作用的結(jié)果。本研究為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)明確、安全有效的有效成分組方的研究以及復(fù)方龍芩草微乳提取液的抗病毒作用機(jī)制研究提供了一定的參考。

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（收稿日期：2016-03-29）

（修回日期：2016-04-25；編輯：華強(qiáng)）endprint