安可膠對BALB/c小鼠的免疫原性影響

司 瑋許辭中劉 晶

1南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院 江蘇省南京市 210000 2南京市餐飲服務(wù)食品安全監(jiān)督所 江蘇省南京市 210000 3江蘇省藥物研究所 江蘇省南京市 210000

安可膠對BALB/c小鼠的免疫原性影響

司 瑋1許辭中2劉 晶3

1南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院 江蘇省南京市 210000 2南京市餐飲服務(wù)食品安全監(jiān)督所 江蘇省南京市 210000 3江蘇省藥物研究所 江蘇省南京市 210000

目的：研究安可膠的免疫原性和免疫效果，為該藥物安全評價(jià)和進(jìn)一步優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：安可膠是模仿凝血機(jī)制的最后共同通路設(shè)計(jì)成的止血制劑，自2015年2月至2015年8月，本研究在江蘇省藥物安評中心進(jìn)行，按臨床等效劑量設(shè)高中低劑量組及空白對照，通過對32例BALB/c小鼠免疫器官質(zhì)量及臟器指數(shù)分析、噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NTB)還原法檢測中性粒細(xì)胞吞噬能力，揭示安可膠對小鼠免疫系統(tǒng)的影響。結(jié)果：小鼠免疫器官質(zhì)量及臟器指數(shù)均未發(fā)生明顯改變；與對照組相比，各組小鼠淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)無明顯差異，試驗(yàn)組中性粒細(xì)胞吞噬功能顯著性增強(qiáng)，粒細(xì)胞吞噬百分率升高，與陰性組相比，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：安可膠可增加脾細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力，并對小鼠免疫器官重量有影響，但在小鼠體內(nèi)未表現(xiàn)出特異性免疫反應(yīng)。

安可膠；免疫原性抗體；抗凝

安可膠是模仿凝血機(jī)制的最后共同通路設(shè)計(jì)成的止血制劑，由兩種成分組成，A液含較高濃度的纖維蛋白原和XIII因子，B液含鈣離子和凝血酶，兩液混合后纖維蛋白原和凝血酶接觸，形成類似外凝血過程的最后階段，產(chǎn)生可溶性多聚體纖維蛋白網(wǎng)，發(fā)揮止血封閉作用，并能有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合[1、2]。但由于本品來源于哺乳動(dòng)物的血清，因此其免疫原性研究對該品種在臨床上的安全應(yīng)用及推廣顯得尤為重要。自2015年2月起，至2015年8月，本研究對安可膠進(jìn)行免疫原性試驗(yàn)，觀察其對32例BALB/c小鼠免疫系統(tǒng)的影響，為臨床用藥安全提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠：SPF級32只18-21g，隨機(jī)分成4組，每組8只，雌雄各半。

1.2 主要試劑

刀豆蛋白A（ConA）：SIGMA公司提供；脂多糖（LPS）：SIGMA公司提供；四甲基偶氮唑蘭（MTT）：Amresco公司提供；氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）：上海靈錦精細(xì)化工有限公司提供；十二烷基磺酸鈉（SDS）：Amresco公司提供；番紅花紅T：上海靈錦精細(xì)化工有限公司提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 給藥方法及檢測

采用安可膠100 mg/kg、 50 mg/kg、25 mg/kg、陰性對照4組，注射給藥后第7天，采抗凝血0.5 ml，加入等量的NBT溶液。番紅花紅T染色，洗滌，干燥，油鏡檢測。血涂片中嗜中性粒細(xì)胞能還原NBT10%以下，為NBT試驗(yàn)陰性，10%以上則為陽性。

2.2 免疫器官重量

給藥第7天稱體重，取胸腺、脾臟稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)[3]。

胸腺或脾臟指數(shù) =

2.3 小鼠T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

給藥第7天，脾臟剪碎后過200目不銹鋼篩網(wǎng)，用PBS預(yù)冷沖洗后收集細(xì)胞懸液，以1000 rpm離心5min，棄上清液，用 NH4Cl 裂解紅細(xì)胞，重復(fù)離心棄上清后，用完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度至1.0×106/ ml， 96孔板內(nèi)每孔加入180ul。每只動(dòng)物設(shè)PBS 對照孔、ConA刺激孔(ConA終濃度10ug/ml)、LPS刺激孔(LPS終濃度10ug/ml)。在37℃下孵育48 h，棄上清100ul，加入10ul MTT工作液，加入100ul 10% SDS裂解結(jié)晶紫顆粒，于570 nm波長紫外測A570值，并計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)（Proliferation index，Prol.）[3、4]。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS12.0軟件中one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果P<0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 安可膠對免疫器官指數(shù)的影響

由表1可以看出，給于安可膠后，小鼠的胸腺和脾臟重量有一定程度的增加，但與陰性對照組相比，差異不很明顯。

3.2 安可膠對脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，給于安可膠后，脾細(xì)胞在ConA誘導(dǎo)下，增殖能力增強(qiáng)，增殖指數(shù)有一定程度的增加，但與陰性對照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見表2）。

3.3 安可膠對嗜中性粒細(xì)胞功能的影響

嗜中性粒細(xì)胞還原NBT試驗(yàn)結(jié)果表明，安可膠能明顯增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞的吞噬功能，與空白組相比，差異極顯著（見表3）。

4 結(jié)論

在臨床上安可膠可與凝血酶混合使用形成纖維蛋白，在臨床外科止血、組織創(chuàng)傷修復(fù)等都有非常好的作用。因有生物相容性好，緩釋作用強(qiáng)和無毒性等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用[5]。安可膠作為類似生物制品發(fā)展前景樂觀，但尚有許多問題待解決：其中最重要是對其有效性和安全性的研究。本試驗(yàn)采用了BALB/C小鼠動(dòng)物模型來評價(jià)其對免疫原性和免疫系統(tǒng)的刺激情況。

雷靜等研究表明，小鼠體內(nèi)的纖維蛋白膠主要影響凝血系統(tǒng)，對免疫系統(tǒng)的脾臟也有影響，可能存在潛在的免疫毒性[6]。本研究為了有效的考量安可膠的安全性，設(shè)計(jì)通過小鼠腹腔局部注射安可膠并測定免疫后動(dòng)物臟器指數(shù)，以了解相應(yīng)免疫原性及免疫毒性強(qiáng)弱。給藥后小鼠主要免疫器官臟器增重及指數(shù)與陰性對照組相比變化不明顯，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明在小鼠體內(nèi)該制劑對其免疫器官的影響程度不髙，且與劑量無關(guān)。

在前期的研究中有結(jié)果提示，纖維蛋白可主要通過淋巴細(xì)胞介導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)[7]，纖維蛋白原對小鼠成纖維細(xì)胞以及兔皮膚可能有一定的毒性作用[8]。但在本研究中，ConA作為一種有絲分裂原，可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。再通過MTT試驗(yàn)進(jìn)行檢測其增殖轉(zhuǎn)化程度，用酶標(biāo)儀測定ConA和LPS等指標(biāo)，其光吸收值即可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，也可以反應(yīng)與該細(xì)胞的增殖程度成正比。在本實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果中，各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力和陰性對照組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增值能力基本相當(dāng)。與陰性對照組相比，對脾臟器官重量及脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化均稍有升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明安可膠刺激小鼠免疫應(yīng)答不明顯，對其特異性免疫影響很小，且與用藥具體劑量無關(guān)性，從而也說明了其具有一定的安全性。

表1：安可膠對小鼠免疫器官的影響(n=8,)

表1：安可膠對小鼠免疫器官的影響(n=8,)

組 別劑 量(mg/kg)胸腺重(mg)脾臟重（mg）胸 腺 指 數(shù)(mg/g)脾臟指數(shù) (mg/g)陰性對照組-37.625±9.96789.875±10.1481.737±0.5024.155±0.770低劑量組25.042.563±13.58991.250±10.9641.970±0.6744.193±0.456中劑量組50.039.063±8.65797.875±15.0941.753±0.4194.400±0.826高劑量組100.045.000±9.815101.500±13.8872.060±0.5054.643±0.768

表2：安可膠對脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響(n=8,)

表2：安可膠對脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響(n=8,)

組 別劑 量(mg/kg)A570(ConA)A570(LPS)增殖指數(shù)(ConA)增殖指數(shù)(LPS)陰性對照組-0.415±0.1510.308±0.058169.6±88.0100.3±27.3低劑量組25.00.478±0.1270.305±0.096230.9±82.1111.6±69.8中劑量組50.00.576±0.2330.360±0.063254.3±88.2130.1±38.2高劑量組100.00.601±0.4410.342±0.163246.9±171.0109.4±65.6

表3：安可膠對嗜中性粒細(xì)胞功能的影響(n=8,)

表3：安可膠對嗜中性粒細(xì)胞功能的影響(n=8,)

與陰性對照組比：*** p<0.001

組 別劑 量(mg/kg) 吞噬百分率（%）陰性對照組-8.33±4.69低劑量組25.032.50±12.56***中劑量組50.035.82±6.11***高劑量組100.037.50±17.44***

中性粒細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)揮吞噬病菌的功能，小鼠體內(nèi)的中性粒細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)，在本研究的結(jié)果中，安可膠對可使嗜中性粒細(xì)胞功能明顯增強(qiáng)，各給藥組粒細(xì)胞吞噬百分率與陰性對照組相比顯著增加，統(tǒng)計(jì)結(jié)果有極顯著差異。這也提示安可膠是異源蛋白，在小鼠體內(nèi)可引起非特異性免疫作用。小鼠試驗(yàn)安可膠在體內(nèi)所表現(xiàn)的特異性免疫反應(yīng)不明顯。

綜上所述，本研究在小鼠體內(nèi)未表現(xiàn)出特異性免疫反應(yīng)，但可部分預(yù)測安可膠對人的免疫原性反應(yīng)，對于臨床應(yīng)用亦可作為參考和提示。

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司瑋（1981-），女，江蘇省南京市人。碩士學(xué)位?，F(xiàn)為南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院工程師，主要從事食品藥品安全研究工作。

劉晶（1973-），男，江蘇省鹽城市人。碩士學(xué)位?，F(xiàn)為南京市餐飲服務(wù)食品安全監(jiān)督所研究員，主要從事食品藥品安全研究工作。