土家族常用基質(zhì)調(diào)敷接骨膏粉末體外經(jīng)皮吸收藥動學(xué)研究

文德鑒，涂星，胡澤華，黃瓊，朱敏英，劉芬，周國麗

湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院，湖北 恩施 445000

土家族常用基質(zhì)調(diào)敷接骨膏粉末體外經(jīng)皮吸收藥動學(xué)研究

文德鑒，涂星，胡澤華，黃瓊，朱敏英，劉芬，周國麗

湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院，湖北 恩施 445000

目的建立紫丁香苷、異嗪皮啶HPLC同步檢測方法，考察接骨膏粉末用白醋、蜂蜜和凡士林為基質(zhì)調(diào)敷時(shí)的體外透皮吸收特性，探討土家族常用藥膏基質(zhì)的作用。方法以離體大鼠腹部皮膚為透皮屏障，采用改良Franz擴(kuò)散池模擬體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)，用HPLC測定接收液中紫丁香苷、異嗪皮啶的含量，建立經(jīng)皮吸收方程，計(jì)算累積滲透量、滲透速率等相關(guān)參數(shù)。結(jié)果采用Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1％磷酸（20∶80），流速1.0 mL/min，檢測波長265 nm，紫丁香苷回歸方程A＝10 686.454 6C＋1565.778 8（r＝1.000 0），異嗪皮啶回歸方程A＝12 297.305 4C－5913.729 9（r＝0.999 9）。以白醋、蜂蜜和凡士林為基質(zhì)調(diào)敷接骨膏粉末及不添加基質(zhì)時(shí)，紫丁香苷的穩(wěn)態(tài)透皮速率分別為7.549 2、4.580 3、3.890 8、5.378 4 μg?cm-2?h-1，累積透過百分率分別為25.66％、16.11％、13.73％、18.78％；異嗪皮啶的穩(wěn)態(tài)透皮速率分別為2.536 9、1.941 8、1.178 2、2.293 6 μg?cm-2?h-1，累積透過百分率分別為47.04％、35.06％、22.11％、41.11％。結(jié)論以白醋為基質(zhì)，有利于促進(jìn)接骨膏粉末中藥效成分的經(jīng)皮吸收；以蜂蜜和凡士林為基質(zhì)，會阻滯接骨膏粉末中藥效成分的經(jīng)皮吸收，但可作為緩釋基質(zhì)使用。

蜂蜜；白醋；凡士林；接骨膏；紫丁香苷；異嗪皮啶；經(jīng)皮吸收

為橫坐標(biāo)，吸收峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程。結(jié)果紫丁香苷的回歸方程為A＝10 686.454 6C＋1565.778 8，r＝1.000 0；異嗪皮啶的回歸方程為A＝12 297.305 4C－5913.729 9，r＝0.999 9。結(jié)果表明，紫丁香苷在2～200 μg/mL、異嗪皮啶在1～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品溶液50、250、5000 μL，置5 mL容量瓶中，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，于1 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，測定紫丁香苷和異嗪皮啶的峰面積，計(jì)算其日內(nèi)精密度；于5 d內(nèi)每日進(jìn)樣3次，測定紫丁香苷和異嗪皮啶的峰面積，計(jì)算其日間精密度。結(jié)果紫丁香苷、異嗪皮啶日內(nèi)峰面積RSD分別為1.06％、0.98％，日間峰面積RSD分別為2.11％、1.76％，表明儀器的精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品溶液50、250、5000 μL，置5 mL容量瓶中，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣3次，測定紫丁香苷和異嗪皮啶的平均峰面積，結(jié)果RSD分別為1.89％、1.25％，表明溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取不同基質(zhì)24 h的透皮樣品溶液0.25 mL，分別精密加入0.25 mL混合對照品溶液，置5 mL容量瓶中，混合均勻后用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定紫丁香苷和異嗪皮啶的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果無基質(zhì)和以蜂蜜、凡士林、白醋作為基質(zhì)調(diào)敷的接骨膏中紫丁香苷的回收率RSD分別為2.47％、2.64％、4.65％、1.53％，異嗪皮啶的回收率RSD分別為3.40％、1.82％、4.65％、2.13％。各組RSD均低于5％，表明本方法的回收率符合生物樣品的分析要求。

2.2 接骨膏經(jīng)皮吸收藥動學(xué)特性研究

2.2.1 樣品的制備 分別取刺五加、刺老苞和獨(dú)正桿粉碎過120目篩，按處方比例混合制成接骨膏粉末。取2 g置于具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過濾，濾液過0.22 μm微孔濾膜，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果其中含紫丁香苷685.640 4 μg/g，異嗪皮啶125.951 5 μg/g。精密稱取3份接骨膏粉末1.00 g，置小燒杯中，分別精密加入蜂蜜、凡士林和白醋3.0 mL，攪拌均勻調(diào)成糊狀，即得供試樣品。

2.2.2 離體大鼠皮膚的制備 參照文獻(xiàn)[8-9]，取SD大鼠，10％水合氯醛0.30 g/kg腹腔注射麻醉，用剃須刀剃去大鼠鎖骨至腹部的毛，再用30 ℃的6％Na2S溶液輕輕擦拭，脫去短絨毛。放回鼠籠正常飼養(yǎng)3 d，脫頸椎處死，剪下腹部皮膚，用載玻片輕輕刮除皮下組織，用生理鹽水漂洗干凈，選擇對光透視無穿孔和皮膚角質(zhì)層完整的皮膚展開并潤濕后置于玻璃板上，覆蓋保鮮膜，置于-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 體外透皮吸收試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[8-9]，剪取合適大小（有效皮膚面積為1 cm2），固定于供體池和接收池之間，使角質(zhì)層面向供體池，接收池中注入20％乙醇-生理鹽水溶液，放入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，排盡接收池中的氣泡，使接收液液面與皮膚層完全接觸。設(shè)定磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為500 r/min，水浴溫度（32±0.25）℃。啟動水泵平衡0.5 h后，分別取以蜂蜜、白醋、凡士林調(diào)和的接骨膏粉末均勻敷于供體池皮膚表面，另取1份接骨膏粉末以1 mL水?dāng)嚢柰ǚ笥诠w池皮膚表面作為對照，于0.5、2、4、6、8、10、12、24 h分別取樣1 mL，并補(bǔ)充32 ℃等量的新鮮接收液。所取樣品液過0.22 μm微孔濾膜，即得透皮吸收液樣品。全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取下皮膚，用新鮮接收液清洗表面殘留物，濾紙吸干水分，剪碎后加入甲醇5 mL超聲提取2次，每次40 min，合并濾液，3000 r/min離心15 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得皮膚滯留樣品。所有樣品均按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣（色譜圖見圖2），每份重復(fù)5次，以紫丁香苷和異嗪皮啶的平均峰面積計(jì)算含量，并得出接骨膏經(jīng)皮吸收藥動學(xué)參數(shù)。

其中，A為有效擴(kuò)散面積（1 cm2），V為接收液總體積（8 mL），Cn為第n次取樣時(shí)接收液中藥物質(zhì)量濃度，Ci為第i次取樣時(shí)接收液中藥物質(zhì)量濃度，Vi為取樣量（1 mL）。以Qn對取樣時(shí)間作曲線，進(jìn)行線性擬合，計(jì)算回歸方程，其直線斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率J，直線與橫軸的交點(diǎn)為時(shí)滯tlag。結(jié)果見表1、圖3、圖4。

可見，不同基質(zhì)調(diào)敷接骨膏粉末中紫丁香苷和異嗪皮啶經(jīng)皮吸收過程的線性規(guī)律較明顯，透皮速率恒定，符合零級模型；且不加基質(zhì)的接骨膏粉末中紫丁香苷和異嗪皮啶的透皮速率和累積透過百分率均較高。無論是以紫丁香苷還是以異嗪皮啶為考察指標(biāo)，其透皮速率和累積滲透百分率均為白醋＞無基質(zhì)＞蜂蜜＞凡士林，提示若以白醋為基質(zhì)可促進(jìn)接骨膏中主要藥效成分紫丁香苷和異嗪皮啶的經(jīng)皮吸收，以蜂蜜或凡士林為基質(zhì)可達(dá)到緩釋藥效成分的目的。

3.2 土家族常用藥膏基質(zhì)及其作用機(jī)制

土家族常用的藥膏基質(zhì)包括蜂蜜、白醋、蜂蠟、面糊、凡士林、松香、桐油等，由于皮膚刺激性和不利于保存等因素，目前最常用的主要是蜂蜜、白醋、凡士林和蜂蠟。

現(xiàn)代研究表明，凡士林流變學(xué)特性屬于膨脹流動，具有一定的觸變性，可起到緩釋藥物的作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，以凡士林作為基質(zhì)調(diào)敷接骨膏時(shí)其有效成分紫丁香苷和異嗪皮啶的透皮速率和累積滲透量均顯著降低，與報(bào)道相符。

目前尚無研究表明白醋有促進(jìn)藥物經(jīng)皮滲透的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，以白醋作為基質(zhì)調(diào)敷接骨膏粉末時(shí)可顯著增加紫丁香苷和異嗪皮啶的透皮速率和累積滲透量，其原因可能是接骨膏粉末中紫丁香苷和異嗪皮啶與醋酸形成鹽類，使藥物易于透過皮膚[13]。

現(xiàn)代研究表明，蜂蜜作為一種高度復(fù)雜的糖類飽和溶液，還富含蛋白質(zhì)、酸類化合物、酶類化合物、維生素和礦物質(zhì)，具有保肝、緩瀉、抗菌、加速創(chuàng)面修復(fù)、滋補(bǔ)強(qiáng)壯和促進(jìn)組織再生的作用[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，以蜂蜜作為基質(zhì)調(diào)敷接骨膏時(shí)，其有效成分紫丁香苷和異嗪皮啶的經(jīng)皮吸收速率和累積滲透量均顯著降低，其原因可能與蜂蜜的黏性導(dǎo)致藥物在皮膚的滯留時(shí)間延長有關(guān)。該結(jié)果與羅躍龍等[16]報(bào)道的蜂蜜可促進(jìn)藥物經(jīng)角膜滲透不一致，可能與給藥部位不一致及蜂蜜來源不同有關(guān)。

此外，刺五加具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神功效，用于脾肺氣虛、體虛乏力、食欲不振、肺腎兩虛、久咳虛喘，腎虛腰膝酸痛，心脾不足、失眠多夢等，通常內(nèi)服使用。土家族醫(yī)藥中稱刺五加為刺拐棒、坎拐棒子、一百針等，多外用治療筋骨損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，刺五加中主要藥效成分紫丁香苷和異嗪皮啶可經(jīng)過皮膚吸收，為其外用給藥途經(jīng)的合理性提供了參考。

土家常用藥膏基質(zhì)蜂蜜、白醋和凡士林如何影響接骨膏的經(jīng)皮吸收，其作用機(jī)制與哪些因素有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

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Percutaneous Absorption in Vitro of Jiegugao Blended and Pasted by Commonly Used Ointment Matrices in Tujia Minority

WEN De-jian, TU Xing, HU Ze-hua, HUANG Qiong, ZHU Min-ying,LIU Fen, ZHOU Guo-li
(TCM School of Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)

ObjectiveTo establish a method to simultaneously determine syringing and isofraxidin by HPLC; To investigate the features of percutaneous absorption in vitro of Jiegugao blended and pasted by white vinegar, honey and vaseline; To discuss the mechanism of commonly used ointment matrices in Tujia Minority.MethodsRat abdomen skin in vitro was as transdermal barrier; the modified Franz diffusion pool was used to simulate human skin medication; the content of syringin and isoprofen was determined by HPLC; the percutaneous absorption equation was established and the related parameters, such as cumulative permeation rate and permeation rate, were calculated.ResultsWhen using Syncronis C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) as chromatographic column, acetonitrile-0.1％ phosphoric acid as mobile phase, 1.0 mL/min as perfusion speed and 265 nm as determine wavelength, regression equation of syringingwas A=10 686.454 6C+1565.778 8 (r=1.000 0), regression equation of isofraxidin was A=12 297.305 4C-5913.729 9 (r=0.999 9). Cumulative permeation quantity of syringing in Jiegugao blended and pasted by white vinegar, honey, vaseline and blank were 7.549 2, 4.580 3, 3.890 8 and 5.378 4 μg?cm-2?h-1respectively and permeation rate were 25.66％, 16.11％, 13.73％ and 18.78％. Meanwhile, cumulative permeation quantity of isofraxidin were 2.536 9, 1.941 8, 1.178 2 and 2.293 6 μg?cm-2?h-1respectively and permeation rate were 47.04％, 35.06％, 22.11％ and 41.11％.ConclusionUsing white vinegar as the ointment matrix can promote the percutaneous absorption of effective composition in Jiegugao blended. However, it will retard the percutaneous absorption of effective composition in Jiegugao when using honey and vaseline as the ointment matrices, but honey and vaseline can be used as a slow-release matrix.

honey; white vinegar; vaseline; Jiegugao; syringing; isofraxidin; percutaneous absorption

R283.5

A

1005-5304(2017)02-0079-05

2016-03-16）

（

2016-04-20；編輯：陳靜）

國家自然科學(xué)基金（81360570）；國家民委科研項(xiàng)目（14HBZ001）

涂星，E-mail：kuangsheng1234@126.com

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.020