規(guī)范檢測技術(shù)控制發(fā)病率—《裂頭絳蟲幼蟲檢測》標(biāo)準(zhǔn)解讀

隨著人民生活水平的不斷提高，食物來源、飲食方式和飲食習(xí)慣的多樣化，因食源性寄生蟲造成的食品安全問題亦越來越突出，由此引發(fā)的食源性寄生蟲病發(fā)病人數(shù)及發(fā)病率大幅度增加。近年來，隨著生食和半生食方式的引入和推廣,使得食源性寄生蟲的感染率猛增，海洋、淡水魚類（包括深海魚、淺海魚、淡水回游魚、蛙）等水產(chǎn)品的攝入量也較以往大大增加，特別是三文魚、鱒魚、金槍魚、馬哈魚、蛙類等一些水產(chǎn)品的市場占有率大大提升，使裂頭絳蟲病、異尖線蟲病等寄生蟲病的發(fā)病率逐年升高，據(jù)文獻(xiàn)回顧，我國20世紀(jì)50年代以來報道因生食海魚而感染闊節(jié)裂頭絳蟲病12例，主要來自黑龍江省，其中，臺灣省報道2例。近兩年，大量的三文魚、金槍魚、鱒魚等深海魚投放市場，在上海出現(xiàn)了多例闊節(jié)裂頭絳蟲感染患者；自2000年以來，因生吃或半生吃蛙、蛇肉和蛇膽等感染的曼氏裂頭蚴的病例達(dá)104例，由此看出，魚類、蛙類等水產(chǎn)品中的裂頭蚴感染的情況日益嚴(yán)重，但我國至今也沒有關(guān)于水產(chǎn)品中裂頭絳蟲幼蟲的檢測標(biāo)準(zhǔn)，這給食品安全問題敲響了警鐘。因此，規(guī)范水產(chǎn)品中寄生蟲幼蟲的檢測標(biāo)準(zhǔn)十分必要，此標(biāo)準(zhǔn)的實施可為相關(guān)水產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)提供安全質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為疾病控制和檢測機構(gòu)提供檢測規(guī)范。

1 標(biāo)準(zhǔn)編制過程與方法

受國家衛(wèi)生和計劃生育委員會政策法規(guī)司委托，由中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所、上海出入境檢驗檢疫局和上海市疾病預(yù)防控制中心有關(guān)專家組成標(biāo)準(zhǔn)編制工作組。編寫組通過查閱科技文獻(xiàn)及有關(guān)文庫，收集國內(nèi)外有關(guān)裂頭絳蟲幼蟲（裂頭蚴）檢測方法方面的最新研究資料，并進(jìn)行分析和整理；首先對目前國內(nèi)外檢查裂頭蚴最常用的壓片法和消化法進(jìn)行評估和規(guī)范；接著，根據(jù)基因庫中報告的裂頭屬絳蟲幼蟲的基因序列保守片段，參考國內(nèi)外相關(guān)研究資料[1-6]，選擇可用于裂頭屬絳蟲幼蟲擴增的特異性引物，同時用國內(nèi)采集的裂頭屬絳蟲幼蟲、裂頭屬絳蟲成蟲，并同時以迭宮屬絳蟲幼蟲作為對比研究，對PCR方法進(jìn)行了驗證，確定引物和體系的適用性。在此基礎(chǔ)上按照我國有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制修訂的要求和規(guī)范，起草了《裂頭絳蟲幼蟲檢測技術(shù)》征求意見稿。2015年11月11日，第七屆國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)委員會寄生蟲病標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會24位專家對此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了評審，修改完成了《裂頭絳蟲幼蟲檢測技術(shù)》送審稿。

在此基礎(chǔ)上，采用專家咨詢法廣泛征求全國各有關(guān)醫(yī)療機構(gòu)、疾控機構(gòu)、醫(yī)學(xué)院校、科研院所、檢驗檢疫機構(gòu)等單位有關(guān)知名專家學(xué)者意見，對反饋意見進(jìn)行討論、斟酌。并修改相應(yīng)內(nèi)容，完成上報稿通過國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)委員會寄生蟲病標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會會審，認(rèn)為該標(biāo)準(zhǔn)符合科學(xué)性、實用性、完整性和準(zhǔn)確性等制標(biāo)要求，上報國家衛(wèi)生計生委衛(wèi)生和計劃生育監(jiān)督中心審核，并在國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)公示，廣泛征集意見和建議。

2017年國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布通告（國衛(wèi)通[2017]11號）公告《裂頭絳蟲幼蟲檢測技術(shù)》（WS/T571-2017）衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)將于2018年2月1日起施行。這個標(biāo)準(zhǔn)填補了魚類、蛙類等水產(chǎn)品中的裂頭蚴檢測標(biāo)準(zhǔn)的空白，為相關(guān)水產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)提供安全質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為疾病控制和檢測機構(gòu)提供檢測規(guī)范，從源頭上控制了裂頭蚴病的感染，保障了人民的身體健康。

2 標(biāo)準(zhǔn)正文內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了裂頭絳蟲幼蟲檢測技術(shù)的操作流程，主要涉及樣本種類、樣本采集、裂頭蚴形態(tài)學(xué)檢測方法、裂頭蚴分子生物學(xué)檢測方法、形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果的判定、PCR結(jié)果的判定、檢測需要試劑的配制等內(nèi)容。

2.1 適用范圍

根據(jù)裂頭絳蟲幼蟲形態(tài)、寄生特點和生活史情況，明確規(guī)定了本標(biāo)準(zhǔn)適用于各級疾病預(yù)防控制機構(gòu)、醫(yī)療機構(gòu)和食品檢測機構(gòu)對魚、蛙和蛇中裂頭絳蟲幼蟲的檢測。

2.2 規(guī)范性引用文件

2.3 術(shù)語和定義

明確了裂頭蚴、曼氏裂頭蚴、闊節(jié)裂頭蚴的定義并作出解釋。

2.3.1 裂頭蚴（plerocercoid larvae）指裂頭絳蟲的幼蟲，是假葉目（Pseudophyllidea）、裂頭科（Diphyllobothriidae）絳蟲第三期幼蟲的總稱。

2.3.2 闊節(jié)裂頭蚴（plerocercoid larvae of Dibothriocephalus latus 或phyllobothrium latum）指寄生在魚體內(nèi)闊節(jié)裂頭絳蟲的第三期幼蟲。

2.3.3 曼氏裂頭蚴（lerocercoid larvae of Spirometra mansoni）指寄生在蛙、蛇或人體內(nèi)曼氏迭宮絳蟲的第三期幼蟲。

2.4 儀器器材

規(guī)定了裂頭蚴幼蟲檢測過程中所有需要的儀器和實驗器材明細(xì)。體視顯微鏡和生物顯微鏡用于裂頭蚴的形態(tài)學(xué)鑒定；PCR擴增儀、凝膠成像儀、電泳儀用于核酸鑒定實驗的必用儀器設(shè)備；超凈工作臺是保證實驗結(jié)果正確性的必須的實驗環(huán)境；離心機和解剖手術(shù)器械是整個實驗用到的器材和設(shè)備。

2.5 試劑材料

對裂頭蚴幼蟲檢測過程中所有涉及的試劑、引物及陽性對照進(jìn)行了規(guī)定，保證實驗結(jié)果的正確性。包括了胃蛋白酶消化液、擴增裂頭蚴核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）引物序列；擴增裂頭蚴細(xì)胞色素C氧化酶（Cox1）引物序列；闊節(jié)裂頭蚴特異性引物序列及曼氏裂頭蚴特異性引物序列；陽性對照為裂頭絳蟲相應(yīng)基因片段的陽性克隆質(zhì)粒或裂頭蚴、裂頭絳蟲全基因組DNA。

2.6 檢測步驟

此為整個標(biāo)準(zhǔn)的核心。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了樣品準(zhǔn)備、檢測具體操作步驟，介紹了壓片檢查法、蛋白酶消化法和核酸檢測法的詳細(xì)操作步驟，在核酸檢測法中細(xì)化規(guī)定了取樣的方法、核酸的提取、PCR反應(yīng)程序，詳細(xì)闡明了裂頭蚴的形態(tài)特征及結(jié)果判斷。

2.6.1 壓片檢查法 用手術(shù)剪對受檢的魚、蛙和蛇逐條/只進(jìn)行解剖。取出內(nèi)臟，將腹腔壁內(nèi)膜刮下，觀察腹腔內(nèi)壁表面，若有可疑白色點狀物，用手術(shù)剪或手術(shù)刀分離皮肉，用兩把小鑷子將肌肉撕開，取含有白色點狀物的組織用載玻片壓片，用生物顯微鏡鏡檢判定結(jié)果。

2.6.2 蛋白酶消化法 稱取樣品250 g并剪成小塊，按樣品與胃蛋白酶消化液1：5 的比例加入消化液，37℃消化至無肉眼可見的肉組織為止。消化后用0.8 mm×0.8 mm（10目）網(wǎng)篩過濾，濾液置于尖底量筒內(nèi)，加水（用水參照 GB/T 66828）至最大刻度處，沉淀洗滌至水清，全部沉渣置平皿，用體視顯微鏡鏡檢判定結(jié)果。

2.6.3 核酸檢測法 首先對取樣進(jìn)行了詳細(xì)規(guī)定，第一步，在體視顯微鏡下挑取蟲體，初步鑒定后備用。第二步，按照總體積25 μl, 模板 DNA2 μl，上下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μl，dNTPs 2 μl，MgCl22.5 μl，10× 緩沖液 2.5 μl，Taq 酶 （5 U/μl） 0.2 μl，補 充ddH2O至25 μl的反應(yīng)體系，第三步，按照94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min ，35個循環(huán)；72℃延伸7 min的PCR反應(yīng)程序，第四步，進(jìn)行電泳取10 μl產(chǎn)物與2 μl的6×加樣緩沖液混合，加樣于含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中。在1×TAE緩沖液中，3～4 V/cm電泳約30 min，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時停止電泳，用凝膠成像系統(tǒng)分析。

2.6.4 結(jié)果判定 （1）裂頭屬的裂頭蚴判定 若從魚體內(nèi)檢出的幼蟲大小長 2～20 mm，寬 2～3 mm，乳白色，頭節(jié)呈匙形，其背腹面各有一條窄而深凹的吸槽，體前端有凹陷且稍大，體不分節(jié)但具有橫皺褶，尾部細(xì)，呈棍棒狀，具有與成蟲相似的頭節(jié)，可初步判定裂頭屬的裂頭蚴。（2）迭宮屬的裂頭蚴形態(tài)判定 若從蛙或蛇體內(nèi)檢出的幼蟲大小長 0.5～80 cm，寬 0.3～1 cm，長帶形，乳白色或淡黃色，蟲體前端無吸槽，頂端中央有一孔向內(nèi)凹陷成隧道狀，并向后延伸形成盲管，蟲體不分節(jié)，具有不規(guī)則的皺褶，可初步判定為迭宮屬的裂頭蚴。（3）核酸擴增結(jié)果判定目的基因擴增片段出現(xiàn)條帶而空白對照未出現(xiàn)條帶，實驗結(jié)果成立；闊節(jié)裂頭蚴特異引物擴增，出現(xiàn)428 bp的特征條帶，初步判定該蟲種為闊節(jié)裂頭蚴；曼氏裂頭蚴特異引物擴增，出現(xiàn)156 bp的特征條帶，初步判定該蟲種為曼氏裂頭蚴；若要進(jìn)一步對幼蟲定種，需將引物擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序，將其序列與GenBank上序列進(jìn)行比對后定種。

3 標(biāo)準(zhǔn)附錄內(nèi)容

標(biāo)準(zhǔn)有2個資料性附錄（A、C）和一個規(guī)范性附錄（B）組成。

3.1 附錄 A

附錄A 為關(guān)于裂頭蚴的病原學(xué)資料，主要介紹了闊節(jié)裂頭蚴和曼氏裂頭蚴的形態(tài)特征，闡述了闊節(jié)裂頭絳蟲和曼氏迭宮絳蟲的生活史[1]。

3.2 附錄 B

附錄B 為與檢測相關(guān)的技術(shù)方法的技術(shù)性資料，主要把檢測相關(guān)的試劑配制、裂頭絳蟲引物的模板、DNA的提取方法及相關(guān)試劑代碼的解釋，都細(xì)化列出，保證檢測過程的完整、正確、有效。

3.3 附錄 C

附錄C 為資料性附錄，附上了在魚肉中闊節(jié)裂頭蚴的彩色圖片，及來自蛙、蛇體中取出的曼氏裂頭蚴的圖片，以方便檢測人員在檢測過程中的比對辨認(rèn)。

4 標(biāo)準(zhǔn)實施和宣貫重點

近年來，各種海產(chǎn)品大量投放市場，食用生魚片人數(shù)劇增，食用生三文魚、鱒魚等海魚感染裂頭絳蟲的人數(shù)也逐年增多。飲食習(xí)慣的改變，使得人們食用食品的種類百花齊放，涼拌蛇皮、快炒蛙肉等，也造成了曼氏裂頭蚴病劇增。如何從源頭上杜絕或減少裂頭蚴病的發(fā)生，《裂頭絳蟲幼蟲檢測》標(biāo)準(zhǔn)為檢驗檢疫、食品檢測機構(gòu)提供了標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法，保證水產(chǎn)品的安全。在標(biāo)準(zhǔn)實施和宣貫中要注意幾個重點：一是加強對裂頭蚴感染率高的國家周圍海域進(jìn)口的海魚的檢驗檢疫，如，日本；以及對在海魚洄游產(chǎn)卵的江河捕獲的魚加強檢測，如，我國東北松花江的鱒魚；二是嚴(yán)管市場捕獲的野生蛙、蛇在市場的流放，加強農(nóng)業(yè)部門檢測機構(gòu)對這些兩棲類動物的檢疫；三是加強檢驗檢疫部門及食品加工企業(yè)的宣傳與培訓(xùn)，使之能及時發(fā)現(xiàn)檢出裂頭蚴；四是加強人群的健康教育，不生吃或半生食魚類、蛙等水產(chǎn)品，改變不良的飲食習(xí)慣，提高自我保護意識。五是加強疾控醫(yī)療機構(gòu)的宣傳培訓(xùn)，及時發(fā)現(xiàn)患者，及時得到治療。