樺褐孔菌酸性蛋白酶基因的克隆及其生物信息分析

李 健， 張宇婷， 安丹丹， 陳艷秋

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

樺褐孔菌酸性蛋白酶基因的克隆及其生物信息分析

李 健， 張宇婷， 安丹丹， 陳艷秋*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

采用RACE法對(duì)樺褐孔菌JL01菌株的蛋白酶基因的cDNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行克隆，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：本研究中克隆的目的基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1 178 bp，包含990 bp開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼由329個(gè)氨基酸組成的蛋白(IO-AP)；IO-AP屬于胃蛋白酶超級(jí)家族的天冬氨酸蛋白酶家族，具有天冬氨酸類型蛋白內(nèi)切酶活性，是一種酸性蛋白酶。IO-AP與鮑姆桑黃菌(Sanghuangporusbaumii)的酸性蛋白酶(AP)的氨基酸序列一致性為88%，進(jìn)化關(guān)系最近；與地中海嗜藍(lán)孢孔菌(Fomitiporiamediterranea)的氨基酸序列一致性為85%；與其他來(lái)源AP的序列一致性均小于75%。

樺褐孔菌；酸性蛋白酶；RACE；克?。恍蛄蟹治?/p>

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)，是一種非常珍貴的藥用真菌，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；又稱為白樺茸、樺癌褐孔菌和斜生纖孔菌，主要分布在北緯45°～50°地區(qū)[1-4]；其藥用部分為菌核，呈瘤狀，無(wú)柄，直徑為25～40 cm，外表黑灰色，有不規(guī)則的溝痕及深裂，質(zhì)硬且脆[5]。

早在16世紀(jì)，樺褐孔菌就廣泛應(yīng)用于防治各種疑難雜癥，如腸癌、肝癌、胃癌等各種消化系統(tǒng)的癌癥及心臟病等[6]。近年來(lái)，諸多研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌提取物，如多糖、類固醇和三萜類化合物等，能夠防止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，抑制多種腫瘤細(xì)胞，抑制HIV和SARS病毒，具有抗衰老、增強(qiáng)免疫能力等功效[7-11]。樺褐孔菌精粉因其能夠降低血糖，對(duì)糖尿病具有非常高的治愈率[12]。

蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱[13]。按其水解多肽的方式分成內(nèi)肽酶和端肽酶2類；按其催化活性中心的不同，又可分為絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶(又稱酸性蛋白酶)等4種[14]。在國(guó)外，對(duì)酸性蛋白酶研究的比較早，而且對(duì)曲霉酸性蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能等研究已較為透徹。1954年，吉田文彥在黑曲霉中就已發(fā)現(xiàn)酸性蛋白酶[15]。2001年，Togai等從假絲酵母(Candidatropicalis)分離出一種酸性蛋白酶，并對(duì)其進(jìn)行了核苷酸序列和功能分析[16]。我國(guó)對(duì)酸性蛋白酶的研究較晚，而且大多局限于生理、生化活性等方面，如王云等(2008年)通過(guò)質(zhì)譜指紋法對(duì)黑曲霉niger H發(fā)酵液中所產(chǎn)蛋白進(jìn)行了分析和鑒定，并對(duì)酸性蛋白酶進(jìn)行了分子生物學(xué)方面的研究[17]。1991年，鄭海歌等發(fā)現(xiàn)在草菇衰老階段蛋白酶的活性增加[18]，蛋白酶還影響盤基網(wǎng)柄菌蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)、蘑菇幾丁質(zhì)的合成、真菌的自溶，特別是對(duì)裂褶菌、雙孢蘑菇、盤基網(wǎng)柄菌、平菇及香菇的子實(shí)體形成具有非常重要的作用。然而，目前有關(guān)樺褐孔菌酸性蛋白酶的分子生物學(xué)研究還未見(jiàn)報(bào)道。

樺褐孔菌的人工栽培中，雖然能夠產(chǎn)生菌核，但產(chǎn)量過(guò)低，嚴(yán)重限制其規(guī)?；a(chǎn)[19]。據(jù)本課題組趙麗等(2011年)研究，菌核產(chǎn)量的增加伴隨著蛋白酶活性的上升，說(shuō)明菌核的形成可能與蛋白酶有關(guān)[20]，本研究對(duì)樺褐孔菌蛋白酶基因進(jìn)行克隆，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為探明菌核發(fā)育與蛋白酶的關(guān)系、揭示樺褐孔菌菌核發(fā)育的分子機(jī)理奠定理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

樺褐孔菌菌株JL01，由采自吉林省汪清縣的野生樺褐孔菌菌核菌絲體分離而來(lái)，保存于延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院應(yīng)用真菌實(shí)驗(yàn)室。

1.2 克隆菌株及試驗(yàn)試劑

克隆菌株E.coliDH5α、TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(RNase H-)、RNase Inhibitor、Oligo(dT)18、LATaq、DL 2 000 Marker、DL 5 000 Marker、氨芐青霉素和pMD18-T Simple Vector等購(gòu)自大連寶生物有限公司；凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)購(gòu)自O(shè)MEGA公司；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒采購(gòu)于Clontech公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖、溴化乙錠(EB)等其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 總RNA提取

采用TRIzol法提取樺褐孔菌菌絲體的總RNA。利用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)提取的總RNA的純度。

1.4 簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)

在NCBI上下載與樺褐孔菌同屬的嗜藍(lán)孢孔菌和相近種屬菌株的酸性蛋白酶和金屬蛋白酶的氨基酸序列，利用Primer5軟件分別設(shè)計(jì)酸性蛋白酶的1對(duì)簡(jiǎn)并引物(AP1和AP2)和金屬蛋白酶的1對(duì)簡(jiǎn)并引物(MP1和MP2)(表1)。

表1 基因克隆使用的引物

1.5 目的基因的PCR擴(kuò)增

以總RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用所設(shè)計(jì)的酸性蛋白酶基因和金屬蛋白酶基因的簡(jiǎn)并引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到目的基因的cDNA片段。再根據(jù)此片段設(shè)計(jì)2對(duì)特異性巢式引物(GSP1、GSP2和NGSP1、NGSP2)，采用3′-RACE和5′-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)法擴(kuò)增，具體步驟按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。將獲得的3′-RACE片段和5′-RACE片段在瓊脂糖凝膠上確認(rèn)后，送交測(cè)序公司測(cè)序；根據(jù)測(cè)序結(jié)果，針對(duì)目標(biāo)DNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)1對(duì)全序克隆引物(APQC1和APQC2)，通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)DNA全長(zhǎng)序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后，回收和純化目標(biāo)DNA片段、連接到pMD-18T克隆載體上、轉(zhuǎn)化DH 5ɑ，經(jīng)平板培養(yǎng)、挑取陽(yáng)性單克隆、經(jīng)搖菌擴(kuò)增培養(yǎng)后，將菌液送交測(cè)序公司測(cè)序。

1.6 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用DNAMAN軟件對(duì)目標(biāo)DNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析；利用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；使用InterProScan5在線工具分析目的蛋白的結(jié)構(gòu)域和功能域[21-25]；目的蛋白的理化特性利用ProtParam tool在線工具分析；目的蛋白信號(hào)肽利用SignalP 4.1 Server在線工具進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用NCBI在線分析工具Conserved Domain Search Service (CD Search)對(duì)模塊進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶基因全長(zhǎng)的克隆

以菌絲體的cDNA為模板，用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，金屬蛋白酶未能獲得片段(圖1，第1泳道)，酸性蛋白酶獲得1條390 bp的中間片段(圖1，第2泳道)。5′-端獲得1條長(zhǎng)度為861 bp的基因片段(圖1，第4泳道)，3′-端獲得1條長(zhǎng)度為375 bp的基因片段(圖1，第3泳道)。cDNA全長(zhǎng)測(cè)序結(jié)果表明，所得酸性蛋白酶基因的cDNA序列全長(zhǎng)1 178 bp(圖1，第5泳道)。

M-DL2000 marker；1-金屬蛋白酶cDNA片段(未能擴(kuò)增出目標(biāo)片段)；2-酸性蛋白酶基因cDNA片段；3-3′-RACE產(chǎn)物；4-5′-RACE產(chǎn)物；5-酸性蛋白酶基因cDNA全長(zhǎng)

圖1 蛋白酶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.1 Amplified product of protease gene fromInonotusobliquus

2.2 序列分析

利用全序克隆引物擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段獲得的產(chǎn)物(圖1，第5泳道)，回收、純化后連接到pMD-18T克隆載體上，再轉(zhuǎn)化DH 5ɑ并擴(kuò)增培養(yǎng)后，送菌測(cè)序(圖2)。結(jié)果表明，試驗(yàn)從樺褐孔菌菌絲體中獲得的酸性蛋白酶基因的cDNA序列全長(zhǎng)1 178 bp，其序列中第25個(gè)堿基至第1 014個(gè)堿基之間，包含990 bp開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼由329個(gè)氨基酸所組成的蛋白(該試驗(yàn)中，命名為InonotusobliquusAcid protease，簡(jiǎn)稱IO-AP)；該cDNA序列的NCBI GenBank登錄號(hào)為KT724964.1，其ORF編碼的蛋白質(zhì)的NCBI GenBank登錄號(hào)為AOO94936.1。

圖2 酸性蛋白酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列及其ORF編碼的氨基酸序列

2.3 目的蛋白的理化特性及信號(hào)肽

利用在線分析工具ProtParam(http://web.expasy.org/)和SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)目的蛋白的理化特性和信號(hào)肽進(jìn)行分析(圖3)，結(jié)果表明，該蛋白分子量為34.6 k Da、理論等電點(diǎn)(pI)為4.23，無(wú)信號(hào)肽；其不穩(wěn)定系數(shù)Instability index (II)為20.91，小于40.0，屬于穩(wěn)定蛋白，以自由態(tài)存在。

2.4 目的基因的功能

利用NCBI在線分析工具Conserved Domain Search Service (CD Search)模塊進(jìn)行分析(圖4)，結(jié)果表明，本研究中克隆的目的基因編碼的蛋白是一種類胃蛋白酶超級(jí)家族的天冬氨酸蛋白酶(即，羧基蛋白酶)，屬于酸性蛋白酶(圖4A)。

圖3 目的蛋白(IO-AP)的理化特性及其信號(hào)肽

InterProScan5在線工具分析結(jié)果表明，該蛋白歸屬胃蛋白酶超級(jí)家族的天冬氨酸蛋白酶A1家族(圖4B)，含有天冬氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域、蛋白酶A1家族結(jié)構(gòu)域和天冬氨酸蛋白酶活性中心(第14～25和第198～209氨基酸殘基之間)，其生物學(xué)功能是參與蛋白質(zhì)水解、天冬氨酸類型蛋白內(nèi)切酶活性。

GO term prediction:1) Biological Process: GO:0006508 proteolysis；2) Molecular Function: GO:0004190 aspartic-type endopeptidase activity；3) Cellular Component: Non predicted

圖4 目的蛋白(IO-AP)的結(jié)構(gòu)域及其功能分析

Fig.4 Structural domain and biological function of the target protein (IO-AP)

2.5 目的蛋白的親緣關(guān)系

在NCBI上通過(guò)BLAST，對(duì)目的基因編碼的蛋白(IO-AP)的氨基酸序列進(jìn)行一致性搜索。。

由表2可知，IO-AP與來(lái)自其它真菌的酸性蛋白酶(acid protease, 簡(jiǎn)稱AP)的氨基酸序列具有一致性；其中，IO-AP與來(lái)自鮑姆桑黃菌(Sanghuangporusbaumii)和地中海嗜藍(lán)孢孔菌(Fomitiporiamediterranea)的AP氨基酸序列一致性最高，分別為88%和85%；與來(lái)自Gloeophyllumtrabeum(密褐褶孔菌)、Stereumhirsutum(毛韌革菌)、Daedalea quercina(櫟迷孔菌)、Coniophora puteana(粉孢革菌)、Neolentinuslepideus(豹皮香菇)、Trametesversicolor(變色栓菌)和Peniophorasp.(隔孢伏革菌)的AP氨基酸序列一致性為68%～72%，均低于80%。

從利用13種不同來(lái)源的酸性蛋白酶(AP)所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)可知，來(lái)自13種不同真菌的AP蛋白，在進(jìn)化上分為2個(gè)大分枝，來(lái)自樺褐孔菌的IO-AP與來(lái)自鮑姆桑黃菌(Sanghuangporusbaumii)、地中海嗜藍(lán)孢孔菌(Fomitiporiamediterranea)和Coniophoraputeana(粉孢革菌)的AP位于同一分枝中，屬于傘菌綱真菌AP分枝(類群)；而來(lái)自其他9種傘菌綱真菌的AP則位于另一個(gè)不同的分枝中。相對(duì)而言，樺褐孔菌的IO-AP與鮑姆桑黃菌(Sanghuangporusbaumii)的AP在進(jìn)化上關(guān)系最近，其次是地中海嗜藍(lán)孢孔菌(Fomitiporiamediterranea)的AP，Coniophoraputeana(粉孢革菌)的AP在進(jìn)化上與樺褐孔菌的IO-AP關(guān)系較遠(yuǎn)。從圖5上看，圖中所涉及的13種不同真菌來(lái)源的AP中，除以上3種傘菌綱真菌的AP外，其他同屬傘菌綱的9種真菌的AP在進(jìn)化上關(guān)系很遠(yuǎn)。

表2 IO-AP與其他來(lái)源AP的氨基酸序列一致性

樺褐孔菌(AOO94936.1)；嗜藍(lán)孢孔菌(XP_007270786.1)；鮑姆桑黃菌(OCB89084.1)；粉孢革菌(XP_007769668.1)；密褐褶菌(XP_007866714.1)；密褐褶菌(XP_007866715.1)；韌黑傘(KJA23239.1)；裂褶菌(XP_003037073.1)；毛韌革菌(XP_007309157.1)；干朽菌(XP_007319879.1)；皺波褶尾菌(KII86690.1)；灰樹花(OBZ71216.1).

圖5 IO-AP蛋白與其他真菌AP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.5 Phylogenetic tree of IO-AP and other fungus AP proteins

3 討論

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)作為一種藥用真菌[5]，在市場(chǎng)上需求量很大，但其野生來(lái)源非常有限，而且人工栽培受到其子實(shí)體產(chǎn)量不足的限制。在實(shí)踐中，如何提高樺褐孔菌子實(shí)體的產(chǎn)量，以滿足樺褐孔菌生產(chǎn)的需要，是亟待解決的問(wèn)題。蛋白酶是一類水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶[13]，它不僅通過(guò)蛋白質(zhì)的水解為生物體提供能量，而且為生物體的生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。蛋白酶活性的消長(zhǎng)與草菇衰老有關(guān)，而且與裂褶菌、雙孢蘑菇、盤基網(wǎng)柄菌、平菇及香菇的子實(shí)體形成有關(guān)[18]。另外，在樺褐孔菌中，也已被證實(shí)其子實(shí)體產(chǎn)量與蛋白酶活性也有關(guān)[20]。

酸性蛋白酶是4種蛋白酶之一，其生理、生化及分子生物學(xué)方面，在其他真菌中廣泛被研究[15-17]；但在樺褐孔菌中，迄今未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為闡明蛋白酶與樺褐孔菌子實(shí)體形成的關(guān)系，該研究以其他真菌來(lái)源的酸性蛋白酶基因及其酶蛋白氨基酸序列為基礎(chǔ)，采用RACE法，嘗試從樺褐孔菌子實(shí)體中克隆出酸性蛋白酶基因。結(jié)果表明：從樺褐孔菌JL01菌株中分離的目的基因cDNA全長(zhǎng)序列長(zhǎng)度為1 178 bp，包含由990個(gè)堿基所組成的開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼由329個(gè)氨基酸所組成的蛋白(被命名為IO-AP)；該cDNA序列的NCBI GenBank登錄號(hào)為KT724964.1，其IO-AP的NCBI GenBank登錄號(hào)為AOO94936.1。IO-AP分子量為 34.6k Da、理論等電點(diǎn)(pI)為4.23，無(wú)信號(hào)肽，是一種穩(wěn)定蛋白，在細(xì)胞質(zhì)中以自由態(tài)形式存在；對(duì)IO-AP的生物信息學(xué)分析表明，IO-AP屬于類胃蛋白酶超級(jí)家族的天冬氨酸蛋白酶(即，羧基蛋白酶)A1家族，是一種酸性蛋白酶，其生物學(xué)功能是參與蛋白質(zhì)水解，具有天冬氨酸類型蛋白內(nèi)切酶活性。IO-AP在進(jìn)化上與傘菌綱真菌的鮑姆桑黃菌(Sanghuangporusbaumii)AP關(guān)系最近，其次為傘菌綱真菌地中海嗜藍(lán)孢孔菌(Fomitiporiamediterranea)AP和粉孢革菌(Coniophoraputeana)AP，在進(jìn)化樹中位于同一分枝中；而其他同屬于傘菌綱的9種AP則位于完全不同的另一個(gè)分枝中，與IO-AP進(jìn)化關(guān)系很遠(yuǎn)。

總之，該研究采用RACE法，從樺褐孔菌JL01菌株子實(shí)體中克隆出了樺褐孔菌子實(shí)體酸性蛋白酶基因cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析[26-28]，為揭示樺褐孔菌子實(shí)體發(fā)育與酸性蛋白酶的關(guān)系及其菌核發(fā)育的分子機(jī)理奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Cloning and its bioinformatics analysis of acid protease gene from Inonotus obliquus

LI Jian, ZHANG Yuting, AN Dandan, CHEN Yanqiu*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

In this study, the full-length cDNA sequence of the protease gene fromInonotusobliquusJL01 was cloned and its bioinformatics analysis was conducted. The results showed that the full-length cDNA sequence of the target gene was 1 178 bp containing a 990 bp-ORF encoding a protein (IO-AP) comprising of 329 amino acids. IO-AP was an acid protease involving aspartic-type endopeptidase activity, belonged to aspartic peptidase A1 family of pepsin-retropepsin-like superfamily. IO-AP fromInonotusobliquusrevealed a 88% identity in amino acid sequence with the AP fromSanghuangporusbaumii, a 85% identity with the AP fromFomitiporiamediterranea, whereas the identities of IO-AP fromInonotusobliquuswith the other APs were all less than 75%.

Inonotusobliquus; acid protease; RACE; cloning; sequence analysis

2016-09-27 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160408和31460536)

李健(1990—)，男，吉林長(zhǎng)春人，在讀碩士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)在食藥用真菌中的應(yīng)用。 陳艷秋為通信作者，

E-mail:cyq326@126.com

1004-7999(2016)04-0292-08

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.04.003

S567.39

A