高山紅景天雌株特異性SRAP標(biāo)記發(fā)掘及其關(guān)聯(lián)基因功能分析

王延禹， 周雅卓， 鄭大浩， 劉福鵬， 吳委林， 李美善

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

高山紅景天雌株特異性SRAP標(biāo)記發(fā)掘及其關(guān)聯(lián)基因功能分析

王延禹， 周雅卓， 鄭大浩， 劉福鵬， 吳委林*， 李美善

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

以長(zhǎng)白山高山紅景天雌株、雄株和兩性株構(gòu)建的不同性別植株的DNA集團(tuán)混池(BSA池)，利用相關(guān)序列多態(tài)性(SRAP)標(biāo)記技術(shù)，發(fā)掘雌雄植株特異性SRAP標(biāo)記，并通過生物信息學(xué)分析，闡明與其相關(guān)聯(lián)基因的功能。結(jié)果表明：用228個(gè)SRAP引物組合在7個(gè)BSA池中所檢出的1 044條SRAP條帶中，僅Me03-Em02 SRAP引物組合在雌株BSA池中獲得1條DNA序列長(zhǎng)度為678 bp的雌株特異性Me03-Em02 SRAP-DNA片段；該片段屬于葉綠體基因組的核骨架scaffold-ZJUL-2062946。Me03-Em02,SRAP-DNA片段作為高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記與葉綠體基因組上光合代謝途徑中的psbE基因相關(guān)聯(lián)；該基因編碼的蛋白為細(xì)胞色素b559蛋白的α亞基，是一種葉綠體跨膜蛋白。

高山紅景天;不同性別植株;SRAP;BSA;基因功能

高山紅景天，又名庫(kù)頁(yè)紅景天(RhodiolasachalinensisA. Bor)，為景天科(Crassulaceae)紅景天屬(RhodiolaL.)多年生草本植物，與林蛙和不老草并稱東北新三寶，為東北地區(qū)珍稀藥用植物之一。高山紅景天在其干燥根及根莖中含有紅景天苷等18種有效成分[1]，具有抗疲勞、抗缺氧、抗衰老、抗輻射、抗病毒、抗腫瘤、提高腦力和體力等多種功效[2]。

據(jù)研究，高山紅景天不同性別植株的藥用成份紅景天甙含量存在顯著差異，雄性植株顯著高于兩性植株及雌性植株[3]；若能在早期區(qū)分雌雄植株，選擇富含有效成分的雄性植株，將有利于提高高山紅景天的開發(fā)利用率。目前，關(guān)于高山紅景天早期性別鑒定方面的研究非常有限。吳委林等(2005)和李美善等(2009)曾對(duì)不同高山紅景天性別植株形態(tài)和過氧化物酶進(jìn)行了比較分析，認(rèn)為雖然不同性別植株的葉長(zhǎng)和葉寬在成株期存在極顯著差異，但依然不足以有效區(qū)分雄株和雌株；而且，不同性別植株在花芽分化、開花期過氧化物酶酶帶數(shù)及酶量上存在的一定差異，也難以用于早期區(qū)分雌雄植株[4-5]。卜媛媛等(2011)利用RAPD與AFLP分子標(biāo)記在高山紅景天不同性別BSA池之間進(jìn)行擴(kuò)增，不僅只有1對(duì)RAPD引物組合在雄株和兩性株上分別擴(kuò)增出1條約1 200 bp的特異性條，而且重復(fù)性不足，穩(wěn)定性較差；而AFLP引物擴(kuò)增出的差異條帶雖然較多，64對(duì)AFLP引物組合共擴(kuò)增出18條差異條帶[6]，但依然未能檢出雌雄特異的條帶?？傮w上，形態(tài)標(biāo)記與同工酶標(biāo)記受環(huán)境因素影響較大，RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性較差，而AFLP標(biāo)記操作繁鎖、耗時(shí)費(fèi)力且費(fèi)用昂貴，故都未能在高山紅景天性別早期鑒定中普及應(yīng)用。

SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)標(biāo)記是一種基于相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性的新型標(biāo)記，具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、分離的目標(biāo)片段便于測(cè)序和克隆、共顯性標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。該標(biāo)記技術(shù)自2001年開發(fā)以來，廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建[7-11]、遺傳多樣性研究[12-18]、功能基因的標(biāo)記及其克隆等方面[19-25]。由于自然界不同物種、不同個(gè)體、控制不同性狀的不同基因的內(nèi)含子變異大、啟動(dòng)子與ORF的間隔區(qū)間的長(zhǎng)度變化大而存在廣泛的多態(tài)性，SRAP標(biāo)記通過獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)對(duì)基因的ORF(Open Reading Frames，開放閱讀框)的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，即上游引物位于結(jié)構(gòu)基因的外顯子區(qū)域，而下游引物位于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)含子區(qū)域和/或啟動(dòng)子區(qū)域，故SRAP標(biāo)記錨定區(qū)段與相應(yīng)的功能基因相關(guān)聯(lián)，屬于特定的功能性標(biāo)記。

迄今為止， SRAP標(biāo)記在植物性別鑒定方面的應(yīng)用還比較少，尤其是SRAP標(biāo)記用于高山紅景天雌雄植株鑒定方面的研究未見報(bào)道。本研究采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，在高山紅景天不同性別植株中分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過目標(biāo)DNA序列的生物信息學(xué)分析，發(fā)掘高山紅景天雌、雄株相關(guān)聯(lián)的特異性SRAP標(biāo)記，為高山紅景天性別的早期鑒定、性別分化、克隆性別決定基因及單性栽培與育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

2015年6月，在吉林省和龍市福洞鎮(zhèn)高山紅景天栽培基地(42°30′29.1″N、129°03′19.7″E，海拔811 m)，通過花器觀察，選取30株高山紅景天雌性(Female，縮寫為F)植株、30株雄性(Male，縮寫為M)和10株兩性(Bisex，縮寫為BS)植株，以單株為單位分別截取等量干凈嫩葉；每10株等量混合，構(gòu)建雄性和雌性植株各3個(gè)BSA池、兩性植株1個(gè)BSA池，共7個(gè)BSA池。

1.1.2 克隆菌株與載體及主要試劑

克隆用菌株為E. coli DH5α；pMD19-T simple vector(T/A克隆載體)；所用PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)?；厥赵噭┖械仍噭┚?gòu)自O(shè)mega公司，其它主要試劑均為進(jìn)口試劑。

1.2 基因組DNA的提取與檢測(cè)

所取池材料，以BSA池為單位，在液氮中迅速研磨，分裝于2 mL離心管中；樣品DNA的提取采用Zheng等(2008)的改良尿素法[26]。所提取的DNA，溶解于pH值為8.0的TE緩沖液中，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠上檢測(cè)DNA質(zhì)量后，利用Quawell Q500檢測(cè)DNA濃度，然后用TE緩沖液稀釋成濃度100 ng/L。

1.3 SRAP引物及PCR擴(kuò)增

SRAP引物序列選自Li和Quiros(2001)[19]、Ferriol等(2003)[20]和Li等(2003)[21]開發(fā)的SRAP引物庫(kù)(表1)，包括12條正向引物和19條反向引物，共組成228對(duì)引物組合；所選SRAP引物由Invitrogen公司合成。

表1 SRAP引物列表及其序列

SRAP-PCR擴(kuò)增，采用體積為20 μL的反應(yīng)體系，包含200 ng BSA池DNA、10 μL天根2×PCR Mix、正反向引物各0.5 μM。PCR反應(yīng)循環(huán)為94 ℃預(yù)變性3 min，接著94 ℃變性30 s、35 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min、5個(gè)循環(huán)，之后是94 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min、35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)在Eppendorf基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，用ZF-258全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.4 目標(biāo)DNA片段的回收、克隆與測(cè)序分析

經(jīng)瓊脂糖凝膠分離和鑒定后，在凝膠成像儀上從凝膠中分離性別特異的目標(biāo)DNA片段(PCR產(chǎn)物電泳譜帶)，按PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書進(jìn)行操作和回收，然后連接到pMD19-T上獲得重組質(zhì)粒，采用熱激法導(dǎo)入到E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，再經(jīng)過藍(lán)白斑選擇，挑選含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆子，送至上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，用DNAStar7.1和GeneDoc3.2軟件進(jìn)行序列分析。

1.5 特異性片段的測(cè)序與生物信息學(xué)分析

測(cè)序所得DNA序列，利用在線工具BLAST for 1 000 plants (https://www. bioinfodata.org/Blast4OneKP/home)中的mega blast模塊進(jìn)行分析；通過序列比對(duì)，搜索同源序列。利用NCBI網(wǎng)站上的在線工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ gorf.html)以及CCD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和EMBL-EBI網(wǎng)站的在線工具InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search;jsessionid =C340FBABA89429E901946DBF61C31CBF)對(duì)所獲得同源序列進(jìn)行開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)及相關(guān)基因及由其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列分析。目的蛋白的理化特性利用在線工具ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)分析；目的蛋白信號(hào)肽利用在線工具SignalP 4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)親疏水、跨膜屬性等利用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP擴(kuò)增分析

利用228對(duì)SRAP引物組合，對(duì)7個(gè)BSA池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出1 044條帶，DNA片段大小為100～1 000 bp；其中，在3個(gè)雄株BSA池中擴(kuò)增出943條帶，兩性株BSA池中擴(kuò)增出944條帶，雌株BSA池中擴(kuò)增出907條帶。由不同的SRAP引物組合擴(kuò)增出的條帶數(shù)為0～13條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出4.58條帶。其中，引物組合Me09-Em08擴(kuò)增出的條帶最多，共擴(kuò)增出13條帶；而Me03-Em01、Me03-Em19和Me06-Em17組合未能擴(kuò)增出清晰條帶。

在228對(duì)SRAP引物組合中，僅Me03-Em02引物組合在3個(gè)雌株BSA池中都擴(kuò)增出1條雄株和兩性株中所缺乏的條帶(圖1)；而Me06-Em02等107個(gè)相組合在不同的BSA池中擴(kuò)增出不同的條帶，但在同性別的不同BSA池之間存在差異，缺乏性別特異性(圖1)。由于Me03-Em02引物組合在雄株BSA池和兩性BSA池中都未能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，該引物組合在雌株BSA池中擴(kuò)增出的條帶(即SRAP-DNA片段)可作為高山紅景天雌株特異性SRAP標(biāo)記。

M1～M3分別表示不同雄株BSA池，BS表示兩性株BSA池，F(xiàn)1～F3分別表示不同雌株BSA池。箭頭表示雌株BSA池中擴(kuò)增出的特異性DNA條帶

圖1 Me03-Em02和Me06-Em02引物組合在不同BSA池中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

Fig.1 PCR products amplified in different BSA pools with Me03-Em02 and Me06-Em02 primer pairs

2.2 目標(biāo)DNA序列的同源物種搜索

在3個(gè)雌株BSA池中擴(kuò)增出的雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記的PCR產(chǎn)物(圖1)，測(cè)序結(jié)果表明，目標(biāo)DNA序列長(zhǎng)度為678 bp，其SRAP引物區(qū)間的DNA序列長(zhǎng)度為643 bp。針對(duì)Me03-Em02 SRAP-DNA片段，利用在線搜索工具BLAST for 1000 plants上的mega blast模塊進(jìn)行物種搜索(表2)，表明從高山紅景天雌株中分離的目標(biāo)DNA序列與共享生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)(Bioinfodata)上的紅景天(Rhodiola rosea)的核骨架scaffold-ZJUL-2062946具有極高的序列一致性，同源一致性得分最高(1 115分)，顯著性水平為0。說明從高山紅景天雌株基因組DNA中分離的目標(biāo)DNA序列包含于已知紅景天核骨架scaffold-ZJUL-2062946中。

表2 目標(biāo)DNA片段的顯著一致的核骨架

2.3 雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記關(guān)聯(lián)基因搜索

為確定與高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記關(guān)聯(lián)的目的基因，利用包含引物的Me03-Em02 SRAP-DNA序列與所下載的長(zhǎng)度為1 626 bp的Scaffold-ZJUL-2062946序列進(jìn)行比對(duì)搜索(圖2)。結(jié)果表明，目標(biāo)DNA序列的反向互補(bǔ)序列與Scaffold-ZJUL-2062946上第731個(gè)堿基到第1 380個(gè)堿基之間的DNA序列相重疊(圖2)；Me03-Em02 SRAP-DNA序列橫跨Scaffold-ZJUL-2062946上重疊區(qū)內(nèi)存在的1個(gè)ORF(位于第589～840堿基)及其上游區(qū)序列；高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記的上游引物位于該ORF的DNA序列中，即位于反向互補(bǔ)序列的下游；而下游引物位于該ORF的上游區(qū)段，即位于反向互補(bǔ)序列的上游。與Scaffold-ZJUL-2062946序列相比，Me03-Em02 SRAP標(biāo)記的正向引物序列中存在9個(gè)堿基替換突變，而反向引物中存在1個(gè)堿基的插入突變和6個(gè)堿基的缺失突變；而且在Scaffold-ZJUL-2062946重疊區(qū)ORF的上游區(qū)，在該標(biāo)記上下游引物區(qū)間內(nèi)還存在1個(gè)堿基缺失。由于1個(gè)ORF對(duì)應(yīng)1個(gè)功能基因，本研究中發(fā)掘的高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記是由與其相關(guān)聯(lián)基因的突變所形成的雌株特異性標(biāo)記。

注：帶下劃線的淺黑色背景部分表示與Me03-Em02 SRAP-DNA重疊區(qū)中存在的開放閱讀框(ORF)；Me03-Em02 SRAP片段前后兩端下劃線部分為引物序列

圖2 雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記與Scaffold-ZJUL-2062946中所含基因的關(guān)聯(lián)性

Fig.2 Association of the female plant specific Me03-Em02 SRAP marker with the gene involved in Scaffold-ZJUL-2062946

2.4 雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記關(guān)聯(lián)基因分析

2.4.1 雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記關(guān)聯(lián)基因的基因組學(xué)定位

為確定高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的基因在物種基因組上存在的位置，在NCBI上對(duì)核骨架Scaffold-ZJUL-2062946的DNA序列進(jìn)行基因組學(xué)搜索(表3)，結(jié)果表明Scaffold-ZJUL-2062946屬于葉綠體基因組；Scaffold-ZJUL-2062946在葉綠體全基因組上覆蓋率為15%。該核骨架與與竹島景天(Sedum takesimense)葉綠體基因組上同源區(qū)的序列一致性高達(dá)100%，與其他植物的葉綠體基因組上同源區(qū)的序列一致性，也都為98%～99%。在NCBI共享數(shù)據(jù)庫(kù)上，并未找到Scaffold-ZJUL-2062946與核基因組相關(guān)聯(lián)的任何信息；說明在Scaffold-ZJUL-2062946上存在的與高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的基因?qū)儆谌~綠體基因。

表3 包含雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記關(guān)聯(lián)基因的核骨架Scaffold-ZJUL-2062946的基因組學(xué)定位

Table 3 Genomic location of Scaffold-ZJUL-2062946 involving the gene associated with the female plant specific Me03-Em02 SRAP marker

登錄號(hào)全基因組定位物種來源極值總值覆蓋率/%顯著水平一致性/%KF954541.1葉綠體全基因組竹島景天Sedumtakesimense171171152e-38100KP006497.1葉綠體全基因組風(fēng)鈴草Campanulatakesimana165165151e-3699KJ477692.1葉綠體全基因組山茱萸Hanabusayaasiatica165165151e-3699JX427551.1葉綠體全基因組垂盆草Sedumsarmentosum165165151e-3699KF746351.1葉綠體全基因組向日葵Helianthusgrosseserratus165165151e-3699EU090187.1葉綠體全基因組藍(lán)鐘花Tracheliumcaeruleum165165151e-3699KX154571.1葉綠體全基因組薇甘菊Mikaniamicrantha159159155e-3598KX499525.1葉綠體全基因組蒲公英Taraxacumamplum159159155e-3598

2.4.2 雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記關(guān)聯(lián)基因的生物信息分析

利用NCBI網(wǎng)站上在線工具ORF Finder和專用分析軟件DNAStar7.1搜索的結(jié)果(圖2)，在Scaffold-ZJUL-2062946 DNA序列的負(fù)鏈第589～840堿基存在的、與高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的開放閱讀框(ORF)編碼1條由83個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(圖3)。

注：淺黑色背景區(qū)表示開放閱讀框(ORF)；實(shí)線箭頭表示閱讀方向

經(jīng)ProtParam(http://web.expasy.org/)理化特性分析表明(圖4-A)，該蛋白分子量為9.4 k Da，理論等電點(diǎn)(pI)為4.83，無信號(hào)肽；其不穩(wěn)定系數(shù)Instability index (II)為49.93，>40.0，屬于不穩(wěn)定蛋白，無法以自由態(tài)存在。亞細(xì)胞定位分析表明，該蛋白存在于葉綠體膜上，是一種跨膜蛋白(圖4-B)；其N-末端第1～19氨基酸位于膜內(nèi)側(cè)(N-末端位于葉綠體膜的內(nèi)側(cè))，第20～42個(gè)氨基酸為跨膜區(qū)，第43～80個(gè)氨基酸位于膜的外側(cè)(C-末端位于葉綠體膜外側(cè))，延伸至細(xì)胞質(zhì)中。

圖4 與雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記關(guān)聯(lián)基因編碼的蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位(A)及其跨膜屬性(B)

2.4.3 雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記關(guān)聯(lián)基因功能

與高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記相關(guān)聯(lián)基因編碼的蛋白，利用NCBI在線分析工具Conserved Domain Search Service (CD Search)模塊進(jìn)行分析(圖5)，結(jié)果表明，高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的基因?yàn)閜sbE；它編碼細(xì)胞色素b559(Cytochrome b559)蛋白的α亞基，該亞基具有Cytochrom_B559超級(jí)家族功能結(jié)構(gòu)域和Cytochrom_B559a超級(jí)家族功能結(jié)構(gòu)域等2個(gè)結(jié)構(gòu)域。從結(jié)構(gòu)域的一致性來講，其功能與Cytochrom_B559a更加一致。細(xì)胞色素b559是光合作用途徑中重要的一種蛋白，它通過與血紅素和金屬離子結(jié)合參與光合系統(tǒng)II光反應(yīng)中的電子傳遞。

圖5 高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的基因編碼的蛋白的功能

3 討論與結(jié)論

一直以來，由于高山紅景天雄性植株的有效成分含量明顯高于雌性植株，人們對(duì)如何在植株幼苗生長(zhǎng)的早期鑒別和區(qū)分雌雄植株、選擇種植雄性植株進(jìn)行了諸多嘗試，包括通過植株形態(tài)學(xué)觀察、同工酶檢測(cè)，甚至采用RAPD、AFLP等分子標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)行早期鑒定，但效果均不佳[3-6]。尤其是未能發(fā)掘出可直接用于早期鑒定和選擇雄性植株的雄株特異性的形態(tài)學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記。SRAP是一種新型的功能性分子標(biāo)記；近年來，人們利用該標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行快速定位質(zhì)量性狀單基因與數(shù)量性狀主效基因，并獲得成功；如，Lu等(2014)利用F2群體通過構(gòu)建2個(gè)極端表型的BSA池(每池10株)并進(jìn)行目標(biāo)DNA測(cè)序，在黃瓜1號(hào)染色體Ef1.1區(qū)段中鑒定出1個(gè)早花候選基因Csa1G651710[25]。

本研究利用高山紅景天不同性別植株構(gòu)成的7個(gè)BSA池，從228個(gè)SRAP引物組合中發(fā)掘到1個(gè)雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記；該標(biāo)記與葉綠體基因組上psbE基因相關(guān)聯(lián)。葉綠體psbE基因編碼的蛋白是細(xì)胞色素b559(Cytochrome b559)蛋白的α亞基，通過與血紅素和金屬離子結(jié)合參與光合系統(tǒng)II光反應(yīng)中的電子傳遞，是植物光合作用中必不可少的一種蛋白。

迄今為止，人們從性別決定的基因角度去尋找與雌雄植株相關(guān)的特異性分子標(biāo)記，但并沒有任何證據(jù)說明雌雄植株間有效成分含量的差異與其性別決定基因直接有關(guān)。實(shí)際上，高山紅景天雄株，不僅有效成分含量高于雌株，而且形態(tài)上也與雌株存在差異。在成株期，雄株比雌株葉片狹長(zhǎng)且薄，莖稈比雌株細(xì)，分枝數(shù)多于雌株，地下根莖粗，莖長(zhǎng)和莖數(shù)等均大于雌株；與之相比，雌株株高比雄株高些，且比雄株健壯，莖稈更加粗壯，葉片更大更厚[4-5]。所以，高山紅景天不同性別植株間有效成分含量和外觀形態(tài)上的差異，根本原因很可能并不在于性別差異本身。本研究中，利用Me03-Em02 SRAP標(biāo)記在高山紅景天雌株池中擴(kuò)增出的雌株特異的DNA片段，包含psbE基因的部分外顯子DNA序列和該基因的上游序列。與包含psbE基因的葉綠體核骨架Scaffold-ZJUL-2062946的DNA序列相比，Me03-Em02 SRAP標(biāo)記的上游和下游引物序列中均存在堿基替換和/或堿基缺失突變，尤其是上游引物序列中存在1個(gè)堿基的插入和連續(xù)6個(gè)堿基的缺失。這意味著本研究中發(fā)掘的高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記源于其雌株葉綠體基因組中psbE基因的突變。

目前，高山紅景天雌株中與其特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的psbE基因序列中存在的突變是否導(dǎo)致高山紅景天雌性植株失去psbE基因功能，造成雌株與雄株間的差異，以及psbE基因是否與高山紅景天花器的發(fā)育有關(guān)，這些都還不清楚，待于進(jìn)一步研究。但由于psbE基因是光合代謝途徑中具有重要作用1個(gè)基因，高山紅景天雌株葉綠體基因組psbE基因的突變很可能會(huì)造成雌株和雄株在光合代謝上的差異，進(jìn)而影響雌株下游次生代謝，并造成高山紅景天雌株的有效成分含量低于雄株。

總之，在本研究中發(fā)掘出1個(gè)高山紅景天雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記；雖然未能發(fā)掘出可直接用于雄株早期鑒定和選擇的雄株特異性SRAP標(biāo)記，但可以借助雌株特異性Me03-Em02 SRAP標(biāo)記，通過早期鑒定和淘汰雌株，進(jìn)而對(duì)雄株進(jìn)行間接選擇。

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Functional analysis of the gene associated with the SRAP marker specific to female plants of Rhodiola sachalinensis A. Bor

WANG Yanyu, ZHOU Yazhuo, ZHENG Dahao, LIU Fupeng, WU Weilin*， LI Meishan

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

BSA pools constructed using female, male and bisexual plants ofRhodiolasachalinensisA. Bor collected from Changbai Mountains as materials, a female plant specific SRAP marker was explored, subsequently the function of the gene associated with the SRAP marker was clarified. The results revealed that, among the 1044 fragments amplified from 7 BSA pools, only one 678 bp SRAP-fragment produced from female plant BSA pools with Me03-Em02 SRAP primer pair was specific to female plants ofRhodiolasachalinensis. The Me03-Em02 SRAP fragment was involved in scaffold-ZJUL-2062946 belonging to chloroplast genome, and the Me03-Em02 SRAP marker was associated with the gene psbE of the chloroplast genome. The polypetides encoded by the gene psbE was α-subunit of Cytochrome b559 was a trasmembrane protein, which was involved in photosynthesis metabolism.

RhodiolasachalinensisA. Bor; different sexual plants; SRAP; BSA; gene function

2016-11-10

吉林省教育廳項(xiàng)目(吉教科合字[2015]第29號(hào))；延邊大學(xué)科研課題(延大科合字[2014]第26號(hào))；延邊大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金資助。

王延禹(1991—)，男，吉林乾安人，在讀碩士，研究方向?yàn)橛衩追肿佑N，吳委林為通信作者。

E-mail: wlwu@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)04-0283-09

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.04.002

S567.239

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