鈣拮抗劑對(duì)大鼠腦缺血后血腦屏障通透性的影響

宋江莉，袁 婕

1.陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科(西安710068)，2.陜西省富平縣醫(yī)院內(nèi)二科(富平 711700)

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鈣拮抗劑對(duì)大鼠腦缺血后血腦屏障通透性的影響

宋江莉1,2，袁 婕1

1.陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科(西安710068)，2.陜西省富平縣醫(yī)院內(nèi)二科(富平 711700)

目的:探討鈣拮抗劑對(duì)大鼠腦缺血后血腦屏障(BBB)通透性的影響。方法:制備腦缺血再灌注(CIR)大鼠模型150只，在大鼠缺血2h后進(jìn)行再灌注。將大鼠平均分為觀察組(尼莫地平)與對(duì)照組(生理鹽水)，在6、12、24、48、72h時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行再灌注，觀察每個(gè)時(shí)間點(diǎn)BBB通透性損傷情況及梗死灶體積百分比。結(jié)果:隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，CIR后BBB通透性與梗死灶體積百分比出現(xiàn)逐步上升，且在12、48h達(dá)到雙高峰。觀察組的BBB通透性及腦梗死灶體積百分比的上升較對(duì)照組明顯(P<0.05)。結(jié)論:CIR能夠提升BBB的通透性，增加梗死灶體積百分比，而早期使用鈣拮抗劑能夠加重上述情況。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子的過(guò)度升高在較多神經(jīng)性損傷中起到了較為核心的作用[1]。目前的研究表明[2]：鈣拮抗劑可以有效中斷細(xì)胞內(nèi)鈣離子的交換，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而緩解血管痙攣。但是，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在研究腦缺血再灌注(CIR)時(shí)，發(fā)現(xiàn)鈣拮抗劑在對(duì)血腦屏障(BBB)保護(hù)方面存在較大的爭(zhēng)議[3]。本研究就鈣拮抗劑尼莫地平在CIR后對(duì)BBB通透性的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)性研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試劑：尼莫地平注射液、甲酰胺、分光光度計(jì)以及電子顯微鏡等。

1.2 CIR模型制備：選擇SD大鼠150只，體重200～250 g。本研究CIR造模采用插線法進(jìn)行，先給予每只大鼠350mg/kg水合氯醛，腹腔注射進(jìn)行麻醉。待充分麻醉后暴露頸部，并逐步分離、暴露右側(cè)頸動(dòng)脈。選擇直徑0.26mm的魚(yú)線，在手術(shù)前放入多聚賴氨溶液中浸泡。手術(shù)時(shí)先用血管夾夾閉右側(cè)頸動(dòng)脈，并在動(dòng)脈上剪一小口，將魚(yú)線一端緩慢送入，直到該端到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始部位。然后利用魚(yú)線阻斷該動(dòng)脈，即可引起局部腦缺血。當(dāng)阻斷該動(dòng)脈2h后將魚(yú)線牽拉回頸內(nèi)、外動(dòng)脈的分叉部位，即可實(shí)現(xiàn)再灌注。

2 動(dòng)物分組 根據(jù)數(shù)字隨機(jī)分組原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，其中觀察組(尼莫地平)75只，對(duì)照組(生理鹽水)75只。每組大鼠根據(jù)再灌注時(shí)間的不同再次進(jìn)行分組，6、12、24、48、72h組各15只。觀察組在造模后給予2mg/kg劑量的尼莫地平腹腔注射并在再灌注后每12h再次進(jìn)行相同劑量尼莫地平腹腔注射。對(duì)照組在造模后給予2mg/kg劑量的生理鹽水腹腔注射，并在再灌注后每12h再次進(jìn)行相同劑量生理鹽水腹腔注射。每只大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行處死，每組選取6只進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 BBB通透性檢測(cè) 每次大鼠在處死前2h，給予1%EB生理鹽水溶液靜脈注射。大鼠處死后取腦組織，將組織放置于甲酰胺溶液中，劑量按照3ml/10mg腦組織計(jì)算。然后進(jìn)行24h水浴，溫度設(shè)定為60℃。24h后使用熒光光度計(jì)測(cè)定光度值，并進(jìn)行腦組織中EB含量的測(cè)定，以EB含量最為BBB通透性檢驗(yàn)指標(biāo)。

4 腦梗死灶體積檢測(cè) 使用TTC染色法進(jìn)行，將腦組織先行放入-20℃冰柜中保存，待冰凍后進(jìn)行冠狀切片，厚度2mm左右。然后將切片放入2%TTC溶液中，避光孵育30min，溫度設(shè)定為37℃。將孵育后的切片用4%多聚甲醛固定，24h后進(jìn)行拍照，并使用圖像分析儀檢測(cè)每張切片的梗死灶面積，并計(jì)算其體積。

結(jié) 果

1 CIR后BBB通透性分析 見(jiàn)表1。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，缺血后腦組織中的EB水平亦隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)明顯的上升，且在12h、48h達(dá)到雙高峰。兩組進(jìn)行比較，可發(fā)現(xiàn)觀察組的EB水平與對(duì)照組同時(shí)間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩組大鼠CIR后不同時(shí)點(diǎn)EB蛋白含量比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間段比較，*P<0.05

2 CIR后腦梗死灶占全腦體積百分比分析 見(jiàn)表2。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組大鼠梗死灶體積均出現(xiàn)了顯著的上升，且在12、48h達(dá)到雙高峰。CIR 24 h后，觀察組腦梗死體積明顯大于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 兩組大鼠CIR后腦梗死灶占全腦體積百分比±s)

注：與對(duì)照組同時(shí)間段比較，*P<0.05

討 論

目前的研究發(fā)現(xiàn)[4]：BBB通透性的特異性檢測(cè)指標(biāo)以EB較為精準(zhǔn)和可靠。EB在血液中能夠和血清蛋白進(jìn)行結(jié)合，并形成EB白蛋白。在正常情況下，EB白蛋白是不可以通過(guò)BB，進(jìn)入腦組織的。在BBB受到損傷的情況下，EB白蛋白可以和血液中的其他相關(guān)蛋白一同通過(guò)組織的間隙，從而進(jìn)入大腦[5]。實(shí)驗(yàn)研究表明[6]：腦組織中EB含量與BBB受損的情況成正相關(guān)。因此，對(duì)大鼠腦組織中的EB水平進(jìn)行測(cè)定，能夠準(zhǔn)確、快速得知BBB的受損程度。

本研究發(fā)現(xiàn)：無(wú)論是觀察組還是對(duì)照組的大鼠，腦組織中EB水平隨著CIR時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)較大程度的上升。說(shuō)明腦缺血后，能夠引發(fā)BBB的損傷，導(dǎo)致其通透性出現(xiàn)上升，因此能夠在腦組織中檢測(cè)到EB的集聚升高。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)：EB水平在CIR后12h以及48h出現(xiàn)了兩個(gè)高峰值，提示BBB通透性在CIR后可能存在雙期性開(kāi)放。關(guān)于EB水平為何存在雙峰現(xiàn)象的研究也較多，Kuroiwa等發(fā)現(xiàn)：在EB上升的過(guò)程中，腦組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，特別是MMP-2de 水平也發(fā)生了雙峰升高的現(xiàn)象，說(shuō)明MMPs與EB水平上升存在較大的聯(lián)系。此外，研究還發(fā)現(xiàn)：BBB通透性的變化可能屬于一種應(yīng)激反應(yīng)，在12hEB上升時(shí)，BBB的結(jié)構(gòu)、功能雖然受到一定的破壞，但尚未造成嚴(yán)重的情況。48hEB再度嚴(yán)重上升時(shí)，說(shuō)明此時(shí)BBB損傷嚴(yán)重，通透性上升極為明顯。

鈣拮抗劑目前在臨床上廣泛用于治療缺血性神經(jīng)損傷引發(fā)的相關(guān)疾病，其能夠通過(guò)阻止細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到治療的目的[7]。但在本實(shí)驗(yàn)中，尼莫地平在CIR大鼠中卻無(wú)法緩解造模后腦組織EB水平以及梗死灶發(fā)的體積百分比。相反，與對(duì)照組比較，尼莫地平反而加重了大鼠BBB通透性以及梗死灶體積比例。通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，造成這種情況的原因可以從以下幾個(gè)方面闡述[8]：腦缺血后隨即使用鈣拮抗劑，是能夠一定程度上緩解血管痙攣、阻止BBB通透性上升的作用的。但是，鈣拮抗劑的使用，也可能損傷血管內(nèi)血流的自動(dòng)調(diào)控，從而出現(xiàn)BBB通透性的上升。此外，CIR能夠引起生物膜發(fā)生結(jié)構(gòu)、功能的改變，而鈣拮抗劑能夠加重這一破壞。因此，在CIR后，隨即使用鈣拮抗劑時(shí)能夠?qū)δX組織造成一定程度破壞的。

總之，CIR后BBB通透性是呈現(xiàn)進(jìn)行性上升的，并且在12h、48h達(dá)到雙峰值。而再灌注后使用鈣拮抗劑，能夠加重腦組織EB水平及梗死灶體積，造成BBB通透性進(jìn)一步上升的關(guān)鍵。因此，再灌注后不應(yīng)立即給予鈣拮抗劑，防止腦組織損傷惡化。

[1] 楊霄鵬,李秋芳,楊瑞玲,等.金納多對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠MMP-9活性和血腦屏障通透性的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2012,32(10):2105-2107.

[2] 崔冬雪.改善藥物血腦屏障通透性方法的研究進(jìn)展[J].軍事醫(yī)學(xué),2012,36(9):718-720.

[3] 劉 翔，許靜紅，齊鐵偉，等.急性創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血腦屏障通透性變化與Claudin-5的相關(guān)性研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2012,11(9):954-957.

[4] 陳應(yīng)柱,張嫻嫻,肖 璐,等.丁苯酞對(duì)放射性腦損傷大鼠血腦屏障的影響[J].中華放射腫瘤學(xué)雜志,2012,21(4):392-395.

[5] 金 路,喻 斌,董小平,等.血腦屏障上的P-糖蛋白及其他ABC超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控[J].中藥新藥與臨床藥理,2012,23(4):493-496.

[6] 宋 毅,秦石成,張 勇,等.超聲聯(lián)合微氣泡開(kāi)放大鼠血腦屏障的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華超聲影像學(xué)雜志,2012,(7):613-616.

[7] 王振華,劉云會(huì),馬 騰,等.大鼠局灶性腦缺血再灌注早期血腦屏障通透性變化的研究[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,41(12):1073-1076.

[8] 李 兵,陳祎招,蔣偉平,等.腦出血后血腦屏障緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)變化[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2012,11(6):575-580.

(收稿：2016-05-20)

Effect of calcium antagonist on the permeability of blood brain barrier (BBB) after cerebral ischemia in rats

Song Jiangli,Yuan Jie.

Department of Neurology,Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an710068)

Objective: To observe the effect of calcium antagonist on the permeability of blood brain barrier (BBB) after cerebral ischemia in rats. Methods: 150 rat models of cerebral ischemia-reperfusion (CIR) were prepared and the brains of subjects were reperfusion after ischemia in 2h. The rats were divided into observation group (nimodipine) and control group (normal saline), respectively to reperfusion in 6h, 12h, 24h, 48h, 72h time points, to observe the BBB permeability damage and Measurement infarct volume percentage on each time point. Results: with the prolongation of time, the percentage of BBB permeability and infarct volume increased gradually after CIR, and reached the peak in 12h and 48h. The BBB permeability and the percentage of infarct volume in the observation group were significantly higher than those in the control group (P< 0.05). Conclusion: CIR can increase the permeability of BBB, increase the percentage of infarct volume, and the early use of calcium antagonists can aggravate the situation.

Brain ischemia/pathology Calcium channel blockers/therapeutic use Blood-brain barrier @ Nimodipine

腦缺血/病理生理學(xué) 鈣通道阻滯藥/治療應(yīng)用 血腦屏障 @尼莫地平

R743.31

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.01.002