老年急性白血病患者死亡相關(guān)蛋白激酶基因表達(dá)的初步觀察

牛一蒙 王亞柱 李艷

老年急性白血病患者死亡相關(guān)蛋白激酶基因表達(dá)的初步觀察

牛一蒙 王亞柱 李艷

白血病在老年人中的發(fā)病率較高,且老年人常常合并各種基礎(chǔ)疾病,各臟器功能退化,故預(yù)后相對較差,死亡率高。探尋老年白血病患者特異性的分子生物學(xué)異常,成為目前的研究熱點(diǎn)之一[1]。死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)是一種由鈣離子、鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的絲氨酸、蘇氨酸激酶,是細(xì)胞凋亡的一種正性的調(diào)節(jié)因子[2-3]。動物實(shí)驗(yàn)表明,DAPK能夠在腫瘤發(fā)育的早期階段抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,對于晚期轉(zhuǎn)移也有一定的效果,被認(rèn)為是腫瘤的抑制劑。DAPK基因表達(dá)出現(xiàn)低表達(dá)或者缺失,可導(dǎo)致該基因CpG島的啟動子區(qū)異常甲基化,失去細(xì)胞凋亡作用,被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因素[4-5]。

目前國內(nèi)對于DAPK基因表達(dá)在造血系統(tǒng)惡性腫瘤的相關(guān)研究,主要集中于全年齡段病人領(lǐng)域。對老年患者的相關(guān)研究,國內(nèi)尚未有相關(guān)報道,本研究探討中國老年急性白血病患者中DAPK基因表達(dá)狀態(tài),力爭為進(jìn)一步揭示該基因表達(dá)在老年急性白血病臨床診療上的意義,為疾病的早期診斷及判斷預(yù)后找到新的思路與方法。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 急性白血病初發(fā)老年患者52例,年齡62～81歲，平均(68.52±3.28)歲,均來源于2011年1月到2014年9月本院門診及病房住院患者,其中急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)21例,急性髓細(xì)胞性白血病(AML)31例。所有患者年齡≥60歲,均參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[6]第3版進(jìn)行診斷,排除實(shí)體腫瘤繼發(fā)及骨髓異常增生綜合征(MDS)轉(zhuǎn)歸急性白血病患者。選取血象正常的非白血病老年患者10例為正常對照,年齡61～77歲,平均(67.71±5.94)歲。

1.2 方法

1.2.1 試劑:Ficoll-Hypaque液購自北京鼎國生物公司。氰醌(hydroquinone)亞硫酸氫鈉(sodiumbisulfite)購自sigma公司。Wizard DNA Clean-Up System試劑盒購自promega公司。蛋白酶K、dNTP混合液、Taq酶、marker(DL20OO)、TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV等購自大連寶生物(TAKARA)公司。GeneFinder購自廈門百維信生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所需引物均由上海生物工程公司合成。

1.2.2 單個核細(xì)胞分離:抽取骨髓或外周血5～10 ml,肝素抗凝,經(jīng)淋巴細(xì)胞Ficoll-Hypaque液分離單個細(xì)胞。

1.2.3 RNA提取及RT-PCR檢測DAPK mRNA表達(dá):TRizol法提取RNA,溶解后采用紫外分光光度儀檢測RNA純度和濃度。cDNA第一鏈合成體系為25 μl,用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV,OligodT以及相關(guān)試劑按說明配成適當(dāng)濃度,合成cDNA。以Primer軟件設(shè)計引物,DAPK引物序列上游引物：5′-GCCTGGAGACGGAGAAGAT-3′下游引物5′-AACTCCCGTGGCTGGTAGA-3′，引物長度均為170 bp。β-actin上游引物:5′-GTGCGTGACATTAAGGAG-3′,β-actin下游引物:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCT-3′，長度均為520 bp。采用RT-PCR法擴(kuò)增預(yù)處理后的RNA模本,反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min,然后95 ℃延伸45 s,退火溫度為54 ℃ 45 s,延伸溫度為72 ℃ 45 s,擴(kuò)增28個循環(huán),72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在15 g/L瓊脂糖凝膠儀上進(jìn)行電泳1 h,GeneFinder染料染色,成像儀觀察并攝像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理,率和構(gòu)成比的比較采用卡方檢驗(yàn)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果表明,DAPK基因在10例正常對照者骨髓標(biāo)本中均有表達(dá),DAPK mRNA相對含量的表達(dá)平均值為0.92±0.18,而在老年急性白血病患者骨髓標(biāo)本中可見DAPK基因表達(dá)缺失及表達(dá)水平降低,缺失率達(dá)48%(25/52),mRNA表達(dá)平均值為0.51±0.20,明顯低于正常對照者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中52.38%(11/21)的ALL病人骨髓標(biāo)本DAPK mRNA表達(dá)缺失,陽性標(biāo)本表達(dá)平均值為0.53±0.20,AML病人缺失率為45.16%(14/31),表達(dá)平均值為0.45±0.21,FAB分型各亞型間缺失率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 DAPK基因表達(dá)情況

3 討論

DAPK位于人類第9染色體的長臂q34.1,全長4293 bp?？墒蛊涞孜锏鞍椎慕z氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化,是一類新發(fā)現(xiàn)的鈣離子/鈣調(diào)素依賴激酶[7]。DAPK是一個細(xì)胞凋亡正調(diào)節(jié)子,能以P19ARF依賴的方式激活p53,抑制胚胎成纖維細(xì)胞的瘤性轉(zhuǎn)化,激活caspase和導(dǎo)致DNA碎裂而引起細(xì)胞凋亡。為多種凋亡信號的匯合點(diǎn),其表觀遺傳學(xué)如甲基化可促進(jìn)其表達(dá)的缺失[8],從而抑制其促腫瘤細(xì)胞凋亡的功能。人類在多種癌癥如膀胱癌、腎癌、前列腺癌、肺癌及MDS,B細(xì)胞淋巴瘤等血液系統(tǒng)腫瘤中,均發(fā)現(xiàn)DAPK基因表達(dá)出現(xiàn)低表達(dá)或者缺失[9-11]。提示其與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

本研究發(fā)現(xiàn),DAPK基因在10例正常對照者骨髓標(biāo)本中均有表達(dá),DAPK mRNA相對含量為0.92±0.18,而在老年急性白血病病人骨髓標(biāo)本中mRNA表達(dá)平均值為0.51±0.20,明顯低于正常對照者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中48%(25/52)的老年急性白血病患者骨髓標(biāo)本DAPK mRNA表達(dá)缺失,該結(jié)果提示DAPK基因表達(dá)發(fā)生改變是老年急性白血病的常見現(xiàn)象。FAB分型各亞型之間比較則無明顯差異。之前文獻(xiàn)報道,DAPK mRNA 全人群ALL組和AML組的表達(dá)缺失率分別是52.7%和38.9%[12],本研究提示AML組老年人群缺失率較非老年人群有所上升,考慮可能與老年患者病程長,疾病進(jìn)展迅速相關(guān),尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

老年急性白血病患者往往提示著不良的預(yù)后[13],本研究的結(jié)果為老年急性白血病的早期診斷與治療提供了新的科研方向,因時間及試驗(yàn)條件限制,尚需大樣本試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證,同時,逆轉(zhuǎn)該基因表達(dá)缺失,是否可改善患者預(yù)后,尚需要對患者進(jìn)一步的隨訪與觀察。

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100001遼寧省沈陽市，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院干診科(牛一蒙)；血液科(王亞柱，李艷)

李艷，Email: liyan2@medmail.com.cn

R 733.7

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10.3969/j.issn.1003-9198.2016.12.023

2016-01-04)