基于PCR方法對載體pBluescriptⅡSK(+)及pCAMBⅠA1300 的定點(diǎn)突變

蒲 艷，劉 超，林 琪，李繼洋，劉曉東

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052)

基于PCR方法對載體pBluescriptⅡSK(+)及pCAMBⅠA1300 的定點(diǎn)突變

蒲 艷，劉 超，林 琪，李繼洋，劉曉東

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052)

運(yùn)用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)對載體pBluescript Ⅱ SK(+)以及植物表達(dá)載體pCAMBⅠA1300多克隆位點(diǎn)內(nèi)相關(guān)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行改造，為運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯載體在構(gòu)建敲除體系時提供更多便捷可用的酶切位點(diǎn)。通過酶切鑒定以及測序表明，成功將pBluescript Ⅱ SK(+)載體多克隆位點(diǎn)內(nèi)XhoⅠ、EcoR Ⅴ、SmaⅠ、SacⅡ 4個酶切位點(diǎn)，分別改造為NheⅠ、MfeⅠ、NsiⅠ、PacⅠ；將pCAMBⅠA1300植物表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)內(nèi)的SacⅠ、SalⅠ以2個酶切位點(diǎn)分別改造為NsiⅠ、PacⅠ，為今后構(gòu)建CRISPR/Cas9基因組編輯載體及對植物功能基因進(jìn)行精準(zhǔn)定位研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。

pBluescript Ⅱ SK(+)；pCAMBⅠA1300；定點(diǎn)突變；PCR

PCR介導(dǎo)的體外定點(diǎn)突變(Site-directed mutagenesis，SDM)技術(shù)是分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中的一項(xiàng)非常重要的技術(shù)[1]，相比傳統(tǒng)使用化學(xué)、物理等因素的誘導(dǎo)導(dǎo)致的突變效率更高并且操作簡單，為基因修飾及改造提供了另一條途徑。它可以根據(jù)需要，在體外對已知序列的特定位點(diǎn)通過插入、缺失或替換一定長度的核苷酸序列，實(shí)現(xiàn)精確的改變堿基序列。它是研究分子水平、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能之間聯(lián)系的非常有力的一種手段[2]?，F(xiàn)在包括PCR介導(dǎo)及非PCR介導(dǎo)的突變技術(shù)都有所改進(jìn)[3-6]，目前熟為人知的方法有大引物PCR定點(diǎn)突變技術(shù)[7-9]、重疊延伸PCR定點(diǎn)突變技術(shù)[10-11]。由于上述方法仍存在某些因素，出現(xiàn)突變效率低的現(xiàn)象，因此PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變法，僅需要一步聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)就能對全質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生點(diǎn)突變。因其操作簡單、準(zhǔn)確率高并且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，越來越受到人們的青睞。

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)于2013年迅速崛起[12-13]，并已經(jīng)高效運(yùn)用于各種生物的基因定點(diǎn)編輯，受到了全世界的關(guān)注，目前，市面上雖然已有成套的CRISPR/Cas9基因組編輯試劑盒，提供完整的基因組編輯載體[14]，但考慮到物種特異性、基因序列的差異以及編輯載體在不同物種中的基因組編輯效率[15-16]，因此，一般常根據(jù)研究的自身需要，構(gòu)建針對不同物種且能在該物種中高效精準(zhǔn)地進(jìn)行基因組編輯的編輯載體，由于在構(gòu)建過程中需要使用到過渡載體pBluescript Ⅱ SK(+)以及植物表達(dá)載體pCAMBⅠA1300，需要考慮在編輯載體的各個元件中選擇合適的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，然而在構(gòu)建編輯載體時發(fā)現(xiàn)，該載體中由于Cas9序列大面積占有較多酶切位點(diǎn)，與原有pBluescript Ⅱ SK(+)和pCAMBⅠA1300載體多克隆位點(diǎn)存在沖突，所以在載體構(gòu)建過程中選擇酶切位點(diǎn)時比較局限。因此，本研究對上述2個載體多克隆位點(diǎn)部分酶切位點(diǎn)進(jìn)行了改造，為今后構(gòu)建CRISPR/Cas9基因組編輯載體系統(tǒng)奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用到的PCR模板pBluescript Ⅱ SK(+)、pCAMBⅠA1300載體均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，引物合成及測序均由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pBluescript Ⅱ SK(+)、pCAMBⅠA1300載體突變引物設(shè)計 通過設(shè)計1對互補(bǔ)的含預(yù)定突變位點(diǎn)的寡核苷酸引物，將突變堿基位于引物中央，兩側(cè)為18～19個正確的堿基，Tm值均為60 ℃。pBluescript Ⅱ SK(+)載體在多克隆位點(diǎn)4個酶切位點(diǎn)進(jìn)行改造，分別設(shè)計3對引物進(jìn)行3輪PCR擴(kuò)增(表1)，首先設(shè)計1對引物在原始模板pBluescript Ⅱ SK(+)載體多克隆位點(diǎn)內(nèi)將EcoR Ⅴ(GATATC)突變2個堿基為NheⅠ(GCTAGC)，SmaⅠ(CCCGGG)突變4個堿基為MfeⅠ(CAATTG)，第2對引物以第1輪測序正確后的質(zhì)粒為模板分別將XhoⅠ(CTCGAG)突變4個堿基為NsiⅠ(ATGCAT)，第3對引物以第2輪測序正確的質(zhì)粒為模板將SacⅡ(CCGCGG)主部堿基突變?yōu)镻acⅠ(TTAATTAA)。

在植物表達(dá)載體pCAMB Ⅰ A1300設(shè)計1對引物進(jìn)行1輪PCR，在其多克隆位點(diǎn)內(nèi)的2個酶切位點(diǎn)進(jìn)行改造將SacⅠ(GAGCTC)突變4個堿基為NsiⅠ(ATGCAT)，SalⅠ(GTCGAC)突變5個堿基為PacⅠ(TTAATTAA)。

1.2.2 突變反應(yīng) 采用Phusion超保真DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：4 μL 5×phusion Buffer、1.6 μL 2 mmol/L dNTP、10 μmol/L引物F和R各1 μL、1 μL DNA、0.2 μL Phusion高保真酶，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。pBluescript Ⅱ SK(+)載體反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 3 min；98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 30 s，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。pCAMBⅠA1300載體進(jìn)行克隆時擴(kuò)增體系不變，反應(yīng)程序僅改變延伸時間為7 min，反應(yīng)程序結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，檢測條帶正確后用NEB公司的內(nèi)切酶20 U/μLDPNⅠ進(jìn)行消化原質(zhì)粒模板的甲基化位點(diǎn)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。候選陽性克隆再進(jìn)一步進(jìn)行酶切鑒定、測序。

表1 突變引物序列Tab.1 Sequence of mutant primers used for PCR amplification

注：下劃部分為突變堿基序列。

Note：Underlined bases were designed mutant bases.

2 結(jié)果與分析

2.1 突變產(chǎn)物酶切鑒定

pBluescript Ⅱ SK(+)載體采用3輪PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變，每1輪對突變后的酶切位點(diǎn)進(jìn)行單酶切檢測，pBluescript Ⅱ SK(+)載體分3次改造了4個酶切位點(diǎn)分別用NheⅠ、MfeⅠ、NsiⅠ、PacⅠ進(jìn)行單酶切鑒定觀察結(jié)果(圖1)，由于質(zhì)粒有3種構(gòu)型，故通過單酶切觀察凝膠電泳圖譜中只能看見線型質(zhì)粒，說明初步構(gòu)建成功，下一步進(jìn)行測序。pBluescript Ⅱ SK(+)、pCAMBⅠA1300載體分別用通用引物M13、P1進(jìn)行測序。若測序結(jié)果正確就進(jìn)行下一步克隆，反應(yīng)條件均不變。 第2步，以測序結(jié)果正確的質(zhì)粒為模板進(jìn)行克隆NsiⅠ及PacⅠ位點(diǎn)，提取質(zhì)粒酶切鑒定送測序。植物表達(dá)載體pCAMB Ⅰ A1300采用1輪PCR,在其多克隆位點(diǎn)內(nèi)的2個酶切位點(diǎn)進(jìn)行改造，分別用NsiⅠ、PacⅠ進(jìn)行酶切鑒定(圖2)。

M.1 kb DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量；A.pBluescript Ⅱ SK(+)載體PCR擴(kuò)增；B.1.pBluescript Ⅱ SK(+)為原質(zhì)粒模板；2～4.pBluescript Ⅱ SK(+)突變后分別用Nsi Ⅰ、Nhe Ⅰ、Mfe Ⅰ、Pac Ⅰ酶切。M.1 kb DNA Marker；A.PCR amplification of pBluescript Ⅱ SK(+) vector；B.1.The original plasmid templet of pBluescript Ⅱ SK(+)；2-4.The mutationof pBluescript Ⅱ SK(+) use Nsi Ⅰ，Nhe Ⅰ，Mfe Ⅰ，Pac Ⅰ enzyme digestion respectively.

M.1 kb DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量；A.pCAMBⅠA1300載體PCR擴(kuò)增；B.pCAMBⅠA1300突變后用 Nsi Ⅰ酶切；C：1.pCAMBⅠA1300原質(zhì)粒模板；2.pCAMBⅠA1300突變后用Pac Ⅰ酶切。M.1 kb DNA Marker；A.PCR amplification of pCAMBⅠA1300 vector；B.The mutation of pCAMBⅠA1300 use Nsi Ⅰ enzyme digestion；C：1.The original plasmid templet of pCAMBⅠA1300；2.The mutation of pCAMBⅠA1300 use Pac Ⅰ enzyme digestion.

2.2 突變反應(yīng)產(chǎn)物測序結(jié)果

pCAMBⅠA1300載體多克隆位點(diǎn)內(nèi)突變的2個位點(diǎn)NsiⅠ、PacⅠ及pBluescript Ⅱ SK(+)載體突變后的4個位點(diǎn)NheⅠ、MfeⅠ、NsiⅠ、PacⅠ經(jīng)測序結(jié)果分析其目標(biāo)序列與設(shè)計序列完全一致(圖3)。

3 討論

體外突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其功能之間復(fù)雜關(guān)系的有力工具，以及確認(rèn)結(jié)構(gòu)域或特定氨基酸所處位置的重要手段，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一，也是實(shí)驗(yàn)室中用來改造及優(yōu)化基因的常用手段。體外突變的方法較多，但傳統(tǒng)方法一般以單鏈DNA作為模板，其操作繁瑣、技術(shù)難度大并且實(shí)驗(yàn)成本較高，難以滿足研究的要求。PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變技術(shù)是以原始DNA為模板，設(shè)計突變引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過設(shè)計1對互補(bǔ)的突變引物，長度通常為30～35個核苷酸，錯配堿基不宜過長一般位于引物5′端，引物兩端互補(bǔ)的序列通常為18～19個核苷酸。其反應(yīng)結(jié)果為2種產(chǎn)物：原始模板及擴(kuò)增產(chǎn)物。DPNI酶可以有效地識別并切割原始質(zhì)粒模板腺嘌呤甲基化的5′-Gm6ATC-3′序列[17]，而不能切斷新合成模板中非甲基化的GATC序列，這樣就避免了原始模版的干擾。進(jìn)行20 U/μL DPNI酶消化質(zhì)粒后，就可以將原質(zhì)粒模板甲基化位點(diǎn)消除并變成許多被截斷的DNA片段，而剩下沒有被消化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，該機(jī)體能夠進(jìn)行自我修復(fù)并由缺刻質(zhì)粒變?yōu)榄h(huán)狀質(zhì)粒。試驗(yàn)中，采用60 ℃進(jìn)行退火，高保真Phusion酶[18]，運(yùn)用其3′到5′核酸外切酶活性降低錯配率[19]。

下劃部分表示酶切位點(diǎn)堿基序列，小寫表示突變堿基。Bases underlined were restriction site，lower-case letters represent mutants bases.

方框1、2、3、4分別表示pBluescript Ⅱ SK(+)多克隆位點(diǎn)內(nèi)突變后的酶切位點(diǎn)Nhe Ⅰ、Mfe Ⅰ、Nsi Ⅰ、Pac Ⅰ；5、6分別表示pCAMBⅠA1300多克隆位點(diǎn)內(nèi)突變后的酶切位點(diǎn)Nsi Ⅰ、Pac Ⅰ。

pBluescript Ⅱ SK(+)載體是從噬菌體基因組中獲得的一段序列改造而成，由于其序列中存在一段噬菌體侵染細(xì)菌并且在其體內(nèi)能夠穩(wěn)定遺傳的保守序列，因此可以在大腸桿菌中穩(wěn)定復(fù)制。其次，也保證了該載體在大腸桿菌中以多拷貝形式存在，由于其在大腸桿菌中兼容性較高，因此被廣泛應(yīng)用于載體構(gòu)建過程中，充當(dāng)過渡載體?，F(xiàn)在常用的 CRISPR/Cas9系統(tǒng)是基于細(xì)菌和古細(xì)菌獲得的一種自身適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[20]， CRISPR/Cas系統(tǒng)分為：TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ 3種不同類型，Cas9蛋白是Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)的Cas相關(guān)蛋白(CRISPR associated protein，Cas),只分布在細(xì)菌中，是3個類型中較為簡單的，其序列較大占有較多酶切位點(diǎn)，所以在載體構(gòu)建過程中酶切位點(diǎn)的選擇比較局限。因此本研究成功地改造了pBluescript Ⅱ SK(+)多克隆位點(diǎn)內(nèi)XhoⅠ、EcoR Ⅴ、SmaⅠ、SacⅡ 4個酶切位點(diǎn)，并分別改造為NheⅠ、MfeⅠ、NsiⅠ、PacⅠ；pCAMBⅠA1300植物表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)內(nèi)的SacⅠ、SalⅠ 2個酶切位點(diǎn)，分別改造為NsiⅠ、PacⅠ，且改造位點(diǎn)在此載體中是唯一的酶切位點(diǎn)。為今后構(gòu)建CRISPR/Cas9 基因組編輯載體系統(tǒng)，方便獲得任何靶基因突變的植物材料，為進(jìn)一步研究基因功能奠定了基礎(chǔ)。該系統(tǒng)已經(jīng)在動物、植物、微生物上取得了顯著的成果，相信CRISPR/Cas系統(tǒng)在未來的基礎(chǔ)理論研究、臨床研究、基因治療、作物育種、發(fā)酵工程等領(lǐng)域必將有越來越廣闊的應(yīng)用前景，并且有更深遠(yuǎn)的影響。

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Site-directed Mutagenesis of pBluescript Ⅱ SK(+) and pCAMBⅠA1300 Vectors Based on PCR Method

PU Yan，LIU Chao，LIN Qi，LI Jiyang，LIU Xiaodong

(College of Agronomy，Xinjiang Agricultural University，Key Laboratory of Agricultural Biological Technology，Urumqi 830052，China)

In order to provide more convenient and efficient restriction enzyme site for the construction of CRISPR/Cas9 gene editing system in the future，the multiple clone site of pBluescript Ⅱ SK(+) and pCAMBⅠA1300 vectors were modified.DNA sequences showed that site-directed mutagenesis were successfully implemented in both pBluescript Ⅱ SK(+) and pCAMBⅠA1300 vectors.The four clone sites of pBluescript Ⅱ SK(+) aboutXhoⅠ，EcoR Ⅴ，SmaⅠ，SacⅡ were transformed toNheⅠ，MfeⅠ，NsiⅠ，PacⅠ respectely；Two clone sites of pCAMBⅠA1300，SacⅠ andSalⅠ were changed toNsiⅠ，PacⅠ.Thus，lay solid foundation for further use on CRISPR/Cas9 genome editing vector.

pBluescript Ⅱ SK(+)；pCAMBⅠA1300；Site-directed mutagenesis；PCR

2016-06-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560534)

蒲 艷(1992-)，女，新疆烏魯木齊人，在讀碩士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。

劉曉東(1975-)，男，新疆烏魯木齊人，副教授，博士，主要從事作物分子設(shè)計育種研究。

Q78

A

1000-7091(2016)06-0083-05

10.7668/hbnxb.2016.06.013