水熱預(yù)處理提高花生分離蛋白酶解效率及其機理分析

陳 林，陳建設(shè)，于泓鵬，吳克剛※

（1. 廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院食品系，廣州 510006；2. 浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310018）

水熱預(yù)處理提高花生分離蛋白酶解效率及其機理分析

陳 林1，陳建設(shè)2，于泓鵬1，吳克剛1※

（1. 廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院食品系，廣州 510006；2. 浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310018）

為了提高花生分離蛋白的酶解效率，該文采用水熱法對花生分離蛋白進行預(yù)處理，利用響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化預(yù)處理工藝，并研究比較了預(yù)處理前后花生分離蛋白酶解敏感性和空間構(gòu)象的變化。結(jié)果表明：優(yōu)化后的最佳預(yù)處理條件為水熱壓力90 MPa、水熱溫度85℃、水熱時間20 min，此條件下酶解產(chǎn)物水解度達到16.3%，相對未經(jīng)預(yù)處理的酶解產(chǎn)物提高了 8 .1個百分點。水熱預(yù)處理提高了花生分離蛋白的主要組分花生球蛋白和伴球蛋白的酶解敏感性，使酶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)回收率提高了31.9個百分點。進行熒光光譜和紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)水熱預(yù)處理使花生分離蛋白三級結(jié)構(gòu)展開、二級結(jié)構(gòu)緊密程度下降，可能是其酶解敏感性提高的主要原因。因此水熱預(yù)處理是一種輔助提高花生分離蛋白酶解效率行之有效的方法。

蛋白；熱處理；優(yōu)化；水熱預(yù)處理；花生分離蛋白；酶解敏感性；空間構(gòu)象

0 引 言

花生蛋白是中國大宗優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源，具有較高的營養(yǎng)效價和豐富的功能特性?；ㄉ蛛x蛋白（peanut protein isolate，PPI）是一種花生蛋白的精制產(chǎn)品，蛋白質(zhì)量分數(shù)在90%以上，是一種重要的食品工業(yè)基礎(chǔ)原料。其中主要的蛋白質(zhì)組分為花生伴球蛋白和花生球蛋白，約占PPI總蛋白含量的90%[1]。目前國內(nèi)PPI的產(chǎn)量不斷增加，然而市場對于傳統(tǒng)PPI的需求已趨于飽和，由于商品化 P PI的溶解性較差，導(dǎo)致其在食品和非食品領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制[2]。國外已對PPI的分子結(jié)構(gòu)、功能特性、改性技術(shù)等進行了大量而深入的研究，美國和日本已利用PPI開發(fā)出了蛋白乳化劑、降血壓多肽、可食性膜等深加工產(chǎn)品，但這些技術(shù)基本沒有申請專利，屬于技術(shù)機密，對中國PPI生產(chǎn)技術(shù)的研究幫助較少[3-4]。探索花生蛋白改性技術(shù)及改善其功能特性，對開辟花生蛋白新的利用途徑，提高其使用價值，滿足人們健康需求，具有重要意義。

蛋白質(zhì)酶解是利用蛋白水解酶在溫和條件下催化蛋白質(zhì)水解成氨基酸和小肽。酶解反應(yīng)速度快、條件溫和、專一性強、無氨基酸破壞和有害物質(zhì)產(chǎn)生，故被認為是水解食品蛋白的最佳方法[5-6]。蛋白質(zhì)經(jīng)適度酶解后除了保留甚至提高其生物價外，功能特性明顯優(yōu)于原始蛋白質(zhì)[7-8]；利用蛋白酶解制備生物活性肽更是成為國內(nèi)外研究的熱點[9-10]。然而由于花生蛋白特殊的組成和結(jié)構(gòu)，蛋白分子高度壓縮、結(jié)構(gòu)緊密，對蛋白酶的水解作用有很強的抵抗力，導(dǎo)致酶解反應(yīng)速度慢、產(chǎn)物水解度低、酶解不徹底等問題，大大制約了花生蛋白酶解改性的實際效果[11-13]。因此尋求花生蛋白高效酶解技術(shù)是花生蛋白改性的關(guān)鍵。

水熱處理是在密閉的壓力容器中（如高壓反應(yīng)釜），在高壓條件下對蛋白樣品進行加熱處理[14]。據(jù)報道，在水熱處理過程中蛋白質(zhì)同時經(jīng)歷高溫、高壓兩種作用導(dǎo)致其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化[15-19]。如葉榮飛等[15]研究發(fā)現(xiàn)水熱處理可破壞大豆蛋白的內(nèi)部基團，導(dǎo)致其亞基解離，從而使蛋白溶解性顯著提高。Tedford等[16-17]發(fā)現(xiàn)與常壓熱處理相比，水熱處理中高溫和高壓相聯(lián)合對維持β-乳球蛋白高級結(jié)構(gòu)的次級鍵和二硫鍵有協(xié)同增效的破壞作用，因此使其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了更為顯著的變化。水熱處理可破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)蛋白亞基解離，有可能使被包埋的酶解位點暴露，提高蛋白的酶解敏感性。然而針對花生蛋白，以往的研究多集中在水熱處理對蛋白功能特性的影響，而水熱處理后花生蛋白酶解特性的變化研究報道的很少。因此本文旨在研究水熱預(yù)處理對PPI酶解特性的影響，并通過研究比較預(yù)處理前后PPI及其酶解產(chǎn)物理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的變化，探討水熱處理提高PPI酶解敏感性的潛在機理。闡明該機理對提高花生蛋白的酶解效率、改善其功能特性具有重要的理論和現(xiàn)實意義，可為花生蛋白深加工提供理論和方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生分離蛋白（蛋白質(zhì)量分數(shù)為92.7%±0.7%，干基），青島長壽食品有限公司；復(fù)合蛋白酶Protamex（酶活力為 1 .5 AU/g），丹麥諾維信公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

高壓反應(yīng)釜（CJ-200，威海新元化工機械有限公司）；自動電位滴定儀（TIM840，美國Radiometer公司）；電泳系統(tǒng)（Mini-protean IV，美國Bio-Rad公司）；熒光分光光度計（FluoroMax-4，法國HORIBA Jobin Yvon公司）；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet 6700，美國Thermo fisher公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化水熱預(yù)處理工藝

將PPI分散到去離子水中配制成50 g/L的分散液，常溫下（25℃左右）攪拌2h使其充分分散，然后置于CJ-200高壓反應(yīng)釜中進行水熱預(yù)處理，處理過程中設(shè)定攪拌速率為20 r/min。通過單因素預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)水熱處理壓力（X1）、溫度（X2）和時間（X3）為影響酶解產(chǎn)物水解度（degree of hydrolysis，DH）的3個主要因素，并確定了它們適宜的水平范圍。響應(yīng)面法優(yōu)化試驗（response surface methodology，RSM）根據(jù)螺旋中心組合設(shè)計原理，采用軟件Design-expert 8.0.6中Box-Behnken模型進行三因素三水平試驗，以 D H為響應(yīng)值，各因素水平如表1所示。水熱處理后的PPI樣品（hydrothermally cooked PPI，HPPI）立即進行蛋白酶水解。部分樣品經(jīng)真空冷凍干燥（真空度為15 Pa，冷阱溫度為-60 ℃）得到粉末，粉碎后過60目篩，于密閉干燥容器中保藏備用。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計中水熱預(yù)處理工藝各因素和水平編碼表Table 1 Coded settings of process parameters for hydrothermal pretreatment in RSM

1.2.2 蛋白酶解反應(yīng)及水解度的測定

為了識別水熱預(yù)處理后花生蛋白暴露出的酶解位點，本文采用酶切位點比較廣泛的復(fù)合蛋白酶Protamex[20]，酶解過程如下：將樣品分散液調(diào)節(jié)至Protamex的最適酶解pH值（6.8），并將恒溫水浴溫度調(diào)節(jié)至最適酶解溫度（50 ℃）。啟動磁力攪拌器，預(yù)熱10 min，然后加入Protamex開始酶解，蛋白酶/底物比例為0.5%（質(zhì)量比）。酶解過程采用自動電位滴定儀自動滴加0.2 mol/L NaOH溶液入樣品分散液，從而維持酶解過程中樣品pH值在6.8±0.1。酶解120 min后，記錄堿液消耗量，采用pH-stat法測定DH[20]。酶解液于95 ℃水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫（25 ℃左右）后備用。部分樣品經(jīng)真空冷凍干燥（真空度為15 Pa，冷阱溫度為-60 ℃）得到粉末，粉碎均勻后過60目篩，于密閉干燥容器中保藏備用。

1.2.3 蛋白質(zhì)回收率（protein recovery，PR）的測定

樣品酶解液經(jīng)4 000×g離心20 min，取上清液。采用半微量凱氏定氮法測定上清液中蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)回收率（PR）的計算公式為：PR=[樣品中水溶性蛋白質(zhì)量(g)/樣品中總蛋白質(zhì)量(g)]×100%。

1.2.4 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

參照Laemmli報道的方法[21]，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為4%，分離膠為質(zhì)量分數(shù)4%～15%的梯度膠。將冷凍干燥后的蛋白樣品溶解于樣品緩沖液（0.0625 mol/L Tris-HCl buffer （pH值6.8），20 g/L SDS，5%（體積分數(shù)）巰基乙醇，25%（體積分數(shù)）甘油和0.1 g/L 溴酚藍）中配置成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的分散液。95 ℃下水浴加熱5 min，離心后（4 000×g，20 min）取上清液。每個樣品的上樣量為10 μL。凝膠電泳在恒壓下進行，在濃縮膠中的電壓為60 V，進入分離膠后增至120 V。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍（R-250）對凝膠染色，再用甲醇和醋酸混合液脫色，最后在凝膠成像系統(tǒng)中進行成像處理。蛋白標(biāo)準品的分子量為14.4～97.4 kDa。

1.2.5 熒光光譜分析

將蛋白樣品用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH值7.0）配制成質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL的溶液。熒光發(fā)射光譜分析以蛋白分子中的熒光基團（色氨酸殘基）為探針[22]。為了降低酪氨酸的干擾，以295 nm為激發(fā)波長，在300～400 nm范圍內(nèi)進行掃描，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm，以緩沖液作為空白。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜分析

稱取冷凍干燥后的蛋白樣品2～6 mg，加入0.2 g左右的KBr，一起研磨混制均勻，壓片，平衡2 min。以干燥空氣為背景，采用紅外附件 A TR（衰減全反射）將蛋白樣品在傅里葉紅外光譜儀上做全波段（4 000～400 cm-1）掃描，掃描次數(shù)為32次，分辨率為4 cm-1。參照Cruz-Angeles等[23]的方法，用PeakFit v4.12軟件對位于1 600～1 700 cm-1波段屬于酰胺I帶特征峰的圖譜進行分析。校正基線，采用Gaussian去卷積，由二階導(dǎo)數(shù)擬合，多次擬合使殘差最小。根據(jù)子峰面積計算各部分二級結(jié)構(gòu)的相對含量。其中各子峰與二級結(jié)構(gòu)對應(yīng)關(guān)系為：1 615～1 637 cm-1、1 682～1 700 cm-1為β-折疊；1 648～1 664 cm-1為α-螺旋；1 637～1 648 cm-1為無規(guī)則卷曲；1 664～1 681 cm-1為β-轉(zhuǎn)角[24]。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

試驗中所有數(shù)據(jù)都是3次測定的平均值，通過SPSS 13.0進行方差分析，采用Duncan多重范圍檢驗，P＜0.05時表明差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果分析及模型擬合

根據(jù) B ox-Benhken的中心組合設(shè)計原理，設(shè)計了三因素三水平的二次回歸旋轉(zhuǎn)正交試驗，共17個試驗點，其中12個為析因點，5個為0點，析因點為自變量取值在水熱壓力（X1）、水熱溫度（X2）、水熱時間（X3）所構(gòu)成的三維頂點，0點為區(qū)域的中心點，0點重復(fù)5次，用以估算試驗誤差，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and experimental results

運用Design-expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到響應(yīng)值Y0（水解度，%）對試驗因素X1（水熱壓力，MPa）、X2（水熱溫度，℃）、X3（水熱時間，min）的回歸方程為：

對該回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3?；貧w方程模型F檢驗非常顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.1），決定系數(shù)R2=0.97＞0.95，說明其他因素對試驗結(jié)果干擾較小，試驗誤差小，該回歸方程與實測值擬合度高，可以用該模型來分析和預(yù)測水熱預(yù)處理條件對PPI酶解產(chǎn)物DH的影響。此外，由表3中F值大小可知，本試驗三因素對響應(yīng)值DH的影響主次順序為：X1（水熱壓力）＞X3（水熱時間）＞X2（水熱溫度），即水熱預(yù)處理壓力對DH的影響最為顯著。

根據(jù)回歸模型做出相應(yīng)的響應(yīng)面圖，即分別將模型中X1、X2和X3中的一個因素固定在0水平，可得到另外兩個因素對DH的交互影響。由表3可知，X1X2間交互作用顯著（P＜0.05），而X1X3和X2X3間交互作用不顯著（P＞0.05），即水熱壓力（X1）與水熱溫度（X2）對水解度（Y0）存在顯著的交互作用。由圖1可見，隨著預(yù)處理各因素水平增大，DH呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，最大值集中在中心區(qū)域。這可能是因為水熱預(yù)處理過程中，PPI同時受到高溫、高壓的作用，其蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)和分子間聚集狀態(tài)發(fā)生改變，緊密的結(jié)構(gòu)松散開，暴露出更多的酶解位點，從而使PPI的酶解敏感性提高；然而若水熱處理條件過度，會使展開的蛋白分子因疏水相互作用或形成-S-S-重新聚集成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，酶解位點反而被包埋[15-19]。響應(yīng)面模型預(yù)測的最優(yōu)水熱預(yù)處理條件為水熱壓力90.57 MPa、溫度86.56 ℃、時間20.99 min，在此條件下預(yù)測DH可達到16.2%。為檢驗優(yōu)化結(jié)果的可靠性，對以上試驗結(jié)果進行了近似驗證試驗，考慮到試驗可操作性，以減少能耗和反應(yīng)時間為基準，選擇水熱壓力90 MPa、溫度85 ℃、時間20 min條件下進行3次平行驗證試驗，實際測定DH為16.3%±0.2%，驗證試驗測得數(shù)據(jù)與預(yù)測值無顯著差異（P＞0.05），且顯著（P＜0.05）高于未經(jīng)預(yù)處理酶解產(chǎn)物的DH 8.2%±0.2%，提高了8.1個百分點，再次證明 B ox-Behnken模型適用于優(yōu)化該反應(yīng)條件，優(yōu)化結(jié)果準確可靠，具有實用價值。

表3 響應(yīng)面模型的回歸方差分析Table3 Analysis of variance of regression equation for response surface quadratic model

圖1 水熱壓力與水熱溫度交互作用對PPI酶解產(chǎn)物水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Interactive effects of hydrothermal pressure and hydrothermal temperature on response degree of hydrolysis of PPI hydrolysate

2.2 水熱預(yù)處理對PPI酶解敏感性的影響

由響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果分析可知水熱預(yù)處理壓力是影響PPI酶解產(chǎn)物水解度的最主要因素，因此本試驗通過研究PPI酶解產(chǎn)物（PPI hydrolysate，PPIH）和HPPI酶解產(chǎn)物（hydrothermally cooked PPI hydrolysate，HPPIH）的亞基降解、水解度（DH）和蛋白質(zhì)回收率（PR），分析水熱預(yù)處理對PPI酶解敏感性的影響。圖2展示了對照PPI、HPPI（水熱壓力為65～105 MPa，水熱溫度為85℃，水熱時間為20 min）、PPIH和HPPIH的SDS-PAGE圖譜。對照PPI含有5條顏色較深的亞基條帶（S1～S5）。通過分子量標(biāo)記計算其分子量，并與文獻報道的花生蛋白的亞基組成進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S1（64 kDa）為花生伴球蛋白（conarachin），S2～S4（40，39，37 kDa）為花生球蛋白（arachin）中的酸性亞基，S5（25 kDa）為花生球蛋白中的堿性亞基[11-13]。與對照PPI相比，經(jīng)不同壓力水熱處理后，HPPI中各亞基條帶都有所消褪，并伴隨著一系列較低分子量蛋白多肽的生成。進一步測定HPPI的DH發(fā)現(xiàn)，HPPI-65 MPa、HPPI-90 MPa、HPPI-105 MPa的DH分別為1.7%、2.8%、3.0%，而對照PPI的DH僅為0.2%（見表4）。這表明在水熱處理下，花生蛋白發(fā)生了一定程度的自發(fā)水解。這一發(fā)現(xiàn)與之前的一些研究報道相似，如Tedford等[16-17]、Wang等[18]也都發(fā)現(xiàn)食品蛋白在高溫高壓聯(lián)合作用下會發(fā)生輕度水解。這可能是因為在蛋白質(zhì)的自發(fā)水解反應(yīng)中，水解速率與反應(yīng)體系的溫度和壓力呈正相關(guān)，即高溫高壓條件會加速蛋白的自發(fā)水解反應(yīng)[17]。

圖2 水熱預(yù)處理前后花生分離蛋白及其酶解產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig.2 Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis profiles of hydrothermally pretreated peanut protein isolate and their hydrolysates

經(jīng)過Protamex酶解后，對照PPI中不同亞基表現(xiàn)出不同的酶解敏感性。在PPIH中，花生伴球蛋白（S1）條帶基本完全消失，而花生球蛋白的酸性亞基（S2～S4）和堿性亞基（S5）均未被完全酶解。由此可見，花生蛋白中的酸性亞基和堿性亞基對Protamex的酶解作用有較強的抵抗力，這與之前文獻報道一致[11-13]。與之相對照的是，HPPIH中花生伴球蛋白和花生球蛋白酸性亞基條帶已經(jīng)完全消失，且HPPIH-90 MPa和HPPIH-105 MPa中花生球蛋白的堿性亞基也僅有少量殘留。這說明經(jīng)過水熱預(yù)處理后，PPI的主要組分花生球蛋白和伴球蛋白的酶解敏感性明顯提高了。據(jù)報道，水熱處理過程中高壓和高溫相聯(lián)合對維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的次級鍵和二硫鍵有協(xié)同增效的破壞作用，可使球蛋白分子的致密結(jié)構(gòu)展開，甚至可使已變性聚集的蛋白分子變得松散，從而暴露出原來被掩蔽的酶解位點[15-19]。

表4展示了不同壓力水熱預(yù)處理后PPI、HPPI、PPIH和HPPIH的DH和PR。本研究采用的商品化PPI在制備過程中經(jīng)歷了噴霧干燥等高溫處理，可能發(fā)生了變性聚集[25]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)回收率較差（對照PPI的PR為17.6%）。經(jīng)水熱處理后，HPPI的PR顯著提高（P＜0.05），HPPI-90 MPa的PR為27.5%。Wang等[13]也發(fā)現(xiàn)熱變性大豆分離蛋白經(jīng)水熱處理（90 MPa，154℃，4 min）后，PR由13%提高到了35%，這表明水熱處理對已變性聚集蛋白產(chǎn)品的PR有明顯的改善作用。酶解后PPIH和HPPIH的DH和PR都增加了。然而與PPIH相比，HPPIH的DH和PR明顯更高。當(dāng)水熱壓力為90 MPa時，HPPIH的DH和PR分別達到了16.3%和73.4%，顯著高于 P PIH（DH=8.2%，PR=41.5%）（P＜0.05），其中PR提高了31.9個百分點。這可能是因為水熱預(yù)處理提高了PPI主要組分花生球蛋白和伴球蛋白的酶解敏感性，使Protamex對PPI的酶解作用不僅變得強烈（DH更高），而且更加廣泛（PR更高）：在相同的酶解條件下，有更多的花生蛋白在水熱預(yù)處理后可被Protamex酶解而變得可以溶解。

表4 水熱預(yù)處理對花生分離蛋白及其酶解產(chǎn)物水解度和蛋白質(zhì)回收率的影響Table 4 Effects of hydrothermal pretreatment on degree of hydrolysis and protein recovery of peanut protein isolate and its hydrolysate

2.3 水熱預(yù)處理對PPI空間構(gòu)象的影響

蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象與其酶解敏感性密切相關(guān)。本研究采用熒光光譜和紅外光譜分析水熱預(yù)處理前后 P PI空間構(gòu)象的變化，試圖從分子水平上解析水熱預(yù)處理提高PPI酶解敏感性的潛在機理。

2.3.1 熒光光譜分析

本研究采用295 nm作為激發(fā)波長，所得到的是色氨酸（Trp）殘基為發(fā)射基團的熒光光譜，其熒光強度和最大吸收波長反映了Trp殘基所處微環(huán)境的變化[13,22,26]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)三級結(jié)構(gòu)展開時，內(nèi)部的Trp殘基暴露于極性環(huán)境中，最大吸收波長增大（即紅移）[13,22]。水熱預(yù)處理前后PPI的熒光發(fā)射光譜如圖3所示。對照PPI具有323 nm處的最大熒光發(fā)射峰和332 nm處的副峰，表明Trp殘基主要位于PPI結(jié)構(gòu)內(nèi)部，因為包埋于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的Trp殘基的熒光發(fā)射峰通常在323～335 nm之間[22,26]。與PPI相比，HPPI在323 nm處的熒光峰強度明顯減弱，負峰則紅移至339 nm且強度明顯增加，這表明水熱處理使PPI中Trp殘基所處的微環(huán)境極性增加（包埋于蛋白內(nèi)部的Trp殘基暴露于水溶液中），意味著PPI的三級結(jié)構(gòu)展開，之前被掩蔽的酶解位點也很可能因此暴露出來。此外，隨著水熱壓力的增大，339 nm處的熒光峰強度先增加，然后稍稍下降，這說明水熱處理壓力對PPI三級結(jié)構(gòu)的松散程度有重要影響。

圖3 水熱預(yù)處理對花生分離蛋白內(nèi)源熒光發(fā)射光譜的影響Fig.3 Influences of hydrothermally pretreatment on the intrinsic emission fluorescence spectra of peanut protein isolate

2.3.2 紅外光譜分析

蛋白質(zhì)紅外光譜中酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）頻率的遷移與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[27]。如圖4a所示，將對照PPI紅外光譜中酰胺I帶進行Gaussian去卷積、二階導(dǎo)數(shù)擬合，得到 6 個子峰，分別歸屬為蛋白二級結(jié)構(gòu)中的4種構(gòu)象：α-螺旋（1 658 cm-1）、β-折疊（1 619 cm-1、1 632 cm-1、1 685 cm-1）、β-轉(zhuǎn)角（1 671 cm-1）和無規(guī)則卷曲（1 645 cm-1）[24]。通過計算每種構(gòu)象的峰面積與酰胺I帶的總峰面積之比即可得到每種構(gòu)象所占的百分含量。由表5可見，對照PPI二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲的含量分別為24.6%、36.2%、21.3%、17.9%。此結(jié)果與之前的文獻報道相似，表明PPI含有較多的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)[28]。經(jīng)過水熱處理后，HPPI中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量顯著（P＜0.05）降低，而β-折疊和無規(guī)則卷曲的含量顯著（P＜0.05）升高。在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲與其他幾種構(gòu)象相比顯然是一種更加松散的結(jié)構(gòu)[29]。本研究結(jié)果與文獻報道[16-17]的相似，表明適當(dāng)?shù)乃疅崽幚砜墒怪参锏鞍锥壗Y(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲的含量增加。α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角都呈緊密無空腔結(jié)構(gòu)，對蛋白酶的水解作用有很強的抵抗力，而β-折疊的緊密程度和構(gòu)象穩(wěn)定性都相對較低，因此酶解敏感性較高[30]。此外，值得注意的是與對照PPI相比，雖然HPPI中β-折疊總含量增加，但是1 685 cm-1處的β-折疊含量卻下降了。據(jù)Cruz-Angeles等[23]研究發(fā)現(xiàn)，1 682～1 700 cm-1處的β-折疊要比1 615～1 637 cm-1處的β-折疊結(jié)構(gòu)更加緊密。由上述結(jié)果分析可知，水熱預(yù)處理可使花生分離蛋白二級結(jié)構(gòu)變得松散、緊密程度下降。另一方面，HPPI-105 MPa的無規(guī)則卷曲含量顯著（P＜0.05）低于HPPI-90 MPa，表明水熱壓力過高可能會導(dǎo)致蛋白二級結(jié)構(gòu)重新聚集。

圖4 水熱預(yù)處理前后花生分離蛋白紅外光譜中酰胺I帶擬合曲線Fig.4 Deconvoluted infrared amide I band of unpretreated and hydrothermally pretreated peanut protein isolate

表5 水熱預(yù)處理前后花生蛋白二級結(jié)構(gòu)百分比Table 5 Secondary structure percentage of unpretreated and hydrothermally pretreated peanut protein isolate %

熒光光譜和紅外光譜分析結(jié)果都表明水熱處理后PPI的空間構(gòu)象發(fā)生了明顯變化，適當(dāng)壓力的水熱處理可使其三級結(jié)構(gòu)展開、二級結(jié)構(gòu)緊密程度下降。這可能是因為水熱處理破壞了維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的次級鍵和二硫鍵，從而使花生蛋白的高級結(jié)構(gòu)展開、蛋白聚集體破碎。此外，如前所述水熱處理過程中，PPI發(fā)生了輕度自發(fā)水解，使其分子量降低、帶電基團增多，也可能是其空間構(gòu)象變得松散的重要原因之一。與致密的蛋白結(jié)構(gòu)相比，松散的蛋白結(jié)構(gòu)顯然具有更多的酶解位點，而且空間位阻較小，更容易與蛋白酶接觸反應(yīng)，因此具有更高的酶解敏感性[30-31]。

3 結(jié) 論

1）利用Design Expert 8.0.6設(shè)計軟件中Box-Behnken模型對水熱預(yù)處理條件進行了優(yōu)化，經(jīng)檢驗證明該模型是合理可靠的（R2=0.97＞0.95），能夠較好地預(yù)測花生分離蛋白酶解產(chǎn)物的水解度。優(yōu)化后的水熱預(yù)處理條件為水熱壓力90 MPa、溫度85℃、時間20 min，此條件下酶解產(chǎn)物水解度為16.3%，相對未經(jīng)預(yù)處理的酶解產(chǎn)物提高了8.1個百分點。

2）水熱預(yù)處理提高了花生分離蛋白（peanut protein isolate，PPI）主要組分花生球蛋白和伴球蛋白的酶解敏感性，使更多的花生蛋白可被Protamex酶解而變得可以溶解。在最優(yōu)水解預(yù)處理條件下，酶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)回收率為73.4%，相對未經(jīng)預(yù)處理的酶解產(chǎn)物提高了31.9個百分點。

3）水熱處理后，PPI的空間構(gòu)象發(fā)生了明顯的變化，適當(dāng)壓力的水熱處理可使其三級結(jié)構(gòu)展開、二級結(jié)構(gòu)緊密程度下降，可能是其酶解感性提高的主要原因。

綜上所述，水熱預(yù)處理是一種輔助提高花生分離蛋白酶解效率行之有效的方法，可使酶解產(chǎn)物水解度和蛋白質(zhì)回收率大大提高，為蛋白高效酶解改性提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。

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Hydrothermal pretreatment improving proteolysis efficiency of peanut protein isolates and its mechanism analysis

Chen Lin1,Chen Jianshe2,Yu Hongpeng1,Wu Kegang1※
(1. Department of Food Science,College of Chemical Engineering and Light Industry,Guangdong University of Technology,Guangzhou 510006,China;2. School of Food Science and Biotechnology,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310018,China)

The use of peanut protein has attained an increasing attention,primarily attributed to its high nutrition value,steady supply,and low cost compared with other proteins with different sources. Peanut protein isolate(PPI) is the most refined peanut protein product,containing 90% protein on a moisture-free basis,and is used as a kind of important protein material in food industry. However,the poor protein solubility and functional properties of commercial PPI limit its application in food and non-food products. Because of small side reactions and safeness,proteolysis has been widely used to improve protein functionalities and to prepare bioactive peptides. However,peanut proteins are resistant to proteolysis due to their compact structures that protect many of the hydrolysis sites. Recently,several studies have reported that hydrothermal treatment could not only alter the spatial conformations of globular proteins,but also break up protein aggregates into smaller pieces,which may cause the exposure of previously buried hydrolysis sites. However,little work has been done so far to investigate this possibility. Therefore,this work aimed to investigate the influences of hydrothermal pretreatment on the proteolysis pattern and the structure of PPI. Hydrothermally cooked PPI(HPPI) was prepared using a CJ-200 autoclave,and protease Protamex was used for the preparation of PPI hydrolysates(PPIH) and HPPI hydrolysates(HPPIH). Response surface methodology(RSM) was used to optimize the processing conditions of hydrothermally cooking,and the optimal conditions were as follows:the pressure was 90 MPa,the temperature was 85 ℃,and the time was 20 min. The actual degree of hydrolysis(DH) of HPPIH obtained under this pretreatment condition was 16.3%±0.2%,which was not significantly different(P＞0.05) from the predicted value(DH=16.2%). And the analysis of variance of the regression equation for the response surface quadratic model showed that the sequence of the importance for influential factors was pressure ＞ temperature ＞ time. The analysis of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) profiles of PPI,HPPI,PPIH and HPPIH showed that hydrothermal pretreatment substantially improved the enzymatic accessibility of the major subunits of conarachin and arachin in PPI,which were initially resistant to Protamex hydrolysis. As a result,more peanut proteins in HPPI could be readily hydrolyzed and become soluble,causing a strong increase in protein recovery(PR) for HPPIH. Under the 90 MPa pressure,HPPIH showed a much higher PR of 73.4% than that of PPIH(PR=41.5%). In addition,it was somewhat surprising that the observations of SDS-PAGE profiles and DH measurement both showed that hydrothermal pretreatment enhanced the spontaneous hydrolysis of PPI. Analysis of the intrinsic emission fluorescence spectra of PPI and HPPI demonstrated that compared with the control PPI,HPPI showed a decrease in the intensity of the fluorescence peak at 323 nm,and a red-shift for the peak at 332 nm,which suggested that hydrothermal treatment caused the unfolding of tertiary structure for PPI. Analysis of Fourier transform infrared spectra(FTIR) of PPI and HPPI demonstrated that compared with the control PPI,HPPI showed a significant decrease in α-helix and β-turn,and an increase in β-sheet and random coil,which suggested that hydrothermal treatment could loosen the secondary structure of peanut protein. So it is inferred that the unfolded tertiary structure and the loosened secondary structure for HPPI after hydrothermal pretreatment may be the main causes for its improved enzymatic accessibility. In conclusion,this study shows that hydrothermal pretreatment is a highly effective technique to accelerate and enhance the proteolysis of PPI.

proteins;heat treatment;optimization;hydrothermal pretreatment;peanut proteins isolates;proteolytic susceptibility;protein conformation

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.01.038

TS201.1

A

1002-6819(2017)-01-0278-07

陳 林，陳建設(shè)，于泓鵬，吳克剛. 水熱預(yù)處理提高花生分離蛋白酶解效率及其機理分析[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2017，33(1)：278－284.

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.01.038 http://www.tcsae.org

Chen Lin,Chen Jianshe,Yu Hongpeng,Wu Kegang. Hydrothermal pretreatment improving proteolysis efficiency of peanut protein isolates and its mechanism analysis[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2017,33(1):278－284.(in Chinese with English abstract)doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.01.038 http://www.tcsae.org

2016-07-09

2016-10-30

廣東省科技計劃項目（2016A020210113）；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目（20134420120008）。

陳 林，男，廣東廣州人，講師，博士，2008年赴英國利茲大學(xué)研修，主要從事食品生物技術(shù)、蛋白質(zhì)化學(xué)與工程方面的研究。廣州廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院食品系，510006。Email：l.chen@gdut.edu.cn

※通信作者：吳克剛，男，貴州人，教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。廣州廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院食品系，510006。Email：kgwu@gdut.edu.cn