熱泉菌Bacillus sp. BI-3產高溫脂肪酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

王 蕾，張培玉，李 江

(1.青島大學環(huán)境科學與工程學院，山東 青島 266071； 2.國家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266061)

生物工程

熱泉菌Bacillussp. BI-3產高溫脂肪酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

王 蕾1，張培玉1，李 江2

(1.青島大學環(huán)境科學與工程學院，山東 青島 266071； 2.國家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266061)

通過平板透明圈從印度尼西亞熱泉樣品中篩選出一株高產脂肪酶的菌株Bacillus.sp BI-3。首先以培養(yǎng)溫度、pH、碳源、氮源、金屬離子、氯化鈉添加量及接種量作為唯一變量進行單因素實驗，篩選出對酶活有顯著影響的單因素取值范圍，再利用Box-Behnken設計及響應面分析法進行回歸分析以確定最佳發(fā)酵條件。結果表明，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度49.1℃、蛋白胨0.78%、氯化鍶13 mmol/L、接種量1.5%、初始pH 7.0、酵母粉0.4%，優(yōu)化后發(fā)酵上清液的酶活達到224.63 U/mL。

熱泉菌Bacillussp. BI-3；高溫脂肪酶；發(fā)酵條件；響應面分析

微生物脂肪酶由于來源廣，生產周期短，生產過程容易控制，適用pH、溫度范圍廣，因而逐步成為脂肪酶的主要來源[1]。最近公布的36種商業(yè)化脂肪酶中有19種來源于真菌，8種來源于細菌，然而僅就微生物脂肪酶而言，仍存在酶產量低、熱穩(wěn)定性較差、pH耐受性差、易受金屬離子的干擾、催化效率低、有機溶劑耐受性差等問題[2]。此外，由于乳制品、釀酒等食品加工工業(yè)、生物柴油工業(yè)以及皮毛脫脂等領域的工業(yè)過程需要脂肪酶參與的同時，又要求有較高的反應溫度，因此對脂肪酶的最適反應溫度以及熱穩(wěn)定性有更嚴苛的要求[3]。

熱泉是一個巨大的生物資源寶庫，蘊藏著豐富的嗜熱微生物及其產生的次級代謝產物，特別是熱穩(wěn)定酶。本研究從印度尼西亞卡利安達島東海岸熱泉群中篩選獲得一株高產脂肪酶熱泉菌Bacillussp. BI-3，初步的酶學性質研究表明該酶最適溫度為55℃，在高于70℃時仍保持較高的穩(wěn)定性，因此在工業(yè)生產方面具有潛在的應用前景，為進一步提高其酶活和產量，本文對該菌株的發(fā)酵條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，以期為熱穩(wěn)定脂肪酶的開發(fā)應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

產脂肪酶菌株篩選分離自印度尼西亞熱泉水樣中，現保存于國家海洋局海洋生物活性物質重點實驗室菌種庫中(-80℃超低溫冰箱)。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：蛋白胨 5 g/L，酵母粉 1 g/L，陳海水配制。

固體培養(yǎng)基：蛋白胨 5 g/L，酵母粉 1 g/L，瓊脂粉 20 g/L，陳海水配制，滅菌后冷卻至60℃倒平板。

三丁酸甘油酯篩選平板：蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L，三丁酸甘油酯25 g/L，瓊脂20 g/L，陳海水配制，滅菌后冷卻至60℃，無菌條件下乳化1 min倒平板。

1.2 實驗方法

1.2.1 篩菌

將熱泉菌菌液進行梯度稀釋后接種于三丁酸甘油酯篩選平板，55℃恒溫培養(yǎng)24 h，選擇透明圈大的菌落進行復篩，并采用對硝基苯酚法進行酶活測定，選取酶活最高的菌株作為研究對象。

1.2.2 菌種鑒定

提取產酶菌株的基因組DNA并進行16S rDNA的鑒定，以確定產酶菌株的種屬。

1.2.3 菌體生物量的測定

菌株于55℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)，每隔6 h取1次樣，用分光光度計于600 nm下測定其吸光值來判斷菌體的生物量。

1.2.4 酶活測定

將篩選出的菌株取0.5 mL接種到含有50 mL液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，于55℃、150 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)30 h制備發(fā)酵液，參照Rathi等[4]的方法，用對硝基苯酚法測定酶活，并繪制對硝基苯酚溶液標準曲線。

酶活單位定義：在pH 7.0、55℃條件下，以每分鐘釋放1 μmol對硝基苯酚所需的酶量定義為1個酶活單位(U)。

1.2.5Bacillussp. BI-3的發(fā)酵條件優(yōu)化

菌株Bacillus.sp BI-3產酶發(fā)酵條件優(yōu)化過程中，固定條件為蛋白胨0.1%，酵母粉0.5%，以陳海水配制培養(yǎng)基，調節(jié)培養(yǎng)基pH 7.0，接種量0.1%，在55℃搖床培養(yǎng)30 h。首先測定菌株的生長曲線和產酶曲線，并以培養(yǎng)溫度、pH、碳源、氮源、金屬離子、氯化鈉添加量及接種量作為唯一變量進行單因素實驗，篩選出對酶活有顯著影響的單因素取值范圍，后進行響應面分析。

2 結果與討論

2.1 產脂肪酶菌株的篩選

采用平板透明圈法篩選共獲得14株具有脂肪酶活性的熱泉菌株。經過復篩及酶活測定最終得到高產菌株BI-3(見圖1)，經16s rDNA鑒定表明，該菌為Bacillus屬。因此，本研究選擇菌株Bacillussp.BI-3用于優(yōu)化及后期實驗研究。

圖1 菌株 BI-3篩選圖

從嗜熱微生物中篩選并獲得熱穩(wěn)定酶是最有效的方法，來源于嗜熱微生物的熱穩(wěn)定酶，因其作用溫度高、熱穩(wěn)定性好、有機溶劑耐受性強等優(yōu)勢，在多個生物工程領域具有巨大的應用潛能[5]。近年來一些熱穩(wěn)定的脂肪酶陸續(xù)被發(fā)現，且很多源自芽孢桿菌屬，如BacillusthermoleovoransID-1[6]、Bacillusthermocatenulatus[7]、Bacillusstearothermophilus[8-9]、Bacillussp. J33[10]以及BacillusA30-1[11]。

2.2Bacillussp. BI-3發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗

Bacillussp. BI-3發(fā)酵條件的單因素實驗結果如圖2～圖11所示。

圖2 培養(yǎng)溫度對Bacillus sp. BI-3生長及產酶的影響

圖3 碳源對Bacillus sp. BI-3生長及產酶的影響

圖4 酵母粉添加量對Bacillus sp. BI-3 生長及產酶的影響

圖5 氮源對Bacillus sp. BI-3生長及產酶的影響

圖6 蛋白胨添加量對Bacillus sp. BI-3 生長及產酶的影響

圖7 接種量對Bacillus sp. BI-3生長及產酶的影響

圖8 pH對Bacillus sp. BI-3生長及產酶的影響

圖9 氯化鈉添加量對Bacillus sp. BI-3生長及產酶的影響

圖10 金屬離子對Bacillus sp. BI-3生長及產酶的影響

圖11 氯化鍶濃度對Bacillus sp. BI-3生長及產酶的影響

從圖2～圖11可以看出，Bacillussp. BI-3最佳培養(yǎng)溫度為50℃、接種量為1.5%、初始pH為7.0；培養(yǎng)基成分為酵母粉0.4%、蛋白胨0.7%、氯化鍶13 mmol/L、氯化鈉0%。

2.2.2 Plackett-Burman實驗設計

根據單因素實驗結果，分別對菌株Bacillussp. BI-3培養(yǎng)條件中的酵母粉A、蛋白胨B、初始pH C、接種量D、氯化鈉E、培養(yǎng)溫度F和氯化鍶G 7個因素進行考察。Plackett-Burman實驗設計及結果見表1，Plackett-Burman實驗水平及效應分析見表2。

表1 Plackett-Burman實驗設計及結果(n=12)

表2 Plackett-Burman實驗水平及效應分析

由表2可以看出，蛋白胨、培養(yǎng)溫度和氯化鍶對酶活的影響顯著(P<0.05)，可信度大于97%。因此，選擇蛋白胨、培養(yǎng)溫度和氯化鍶作為后期最陡爬坡實驗的研究對象。

2.2.3 最陡爬坡實驗

根據Plackett-Burman實驗篩選出的3個顯著性因素蛋白胨、培養(yǎng)溫度和氯化鍶設計最陡爬坡實驗的坡長，以發(fā)酵液上清液酶活作為響應值。最陡爬坡實驗設計及結果見表3。

表3 最陡爬坡實驗設計及結果

由表3可以看出，酶活最高值出現在實驗3，因此以實驗3的培養(yǎng)條件作為Box-Behnken設計的中心點。

2.2.4 Box-Behnken實驗設計及結果

根據Plackett-Burman實驗篩選出的3個顯著性因素及最陡爬坡實驗確定的Box-Behnken設計的中心點，設計Box-Behnken實驗。Box-Behnken實驗因素及水平見表4，Box-Behnken實驗設計及結果見表5。

表4 Box-Behnken實驗因素及水平

表5 Box-Behnken實驗設計及結果

根據表5利用Design-Expert軟件進行回歸分析，得到回歸模型：酶活= 210.00+77.69A-15.74B+4.57C+1.75AB+10.48AC-9.23BC-52.65A2-66.10B2-47.07C2。

回歸模型經回歸方差分析可知(見表6)，回歸性極顯著。回歸模型的R2=97.14%，說明該模型可以解釋97.14%實驗所得菌株Bacillussp. BI-3酶活的變化，從而說明該模型與實際擬合較好，可用于菌株Bacillussp. BI-3酶活的分析與預測。

通過Design-Expert軟件進一步分析預測，達到最高酶活時，所對應的A、B、C3個因素的編碼值分別為0.83、-0.18、1，即培養(yǎng)溫度49.1℃、蛋白胨0.78%、氯化鍶 13 mmol/L，此時預測最大酶活為226.49 U/mL。

根據預測的最佳條件進行3組驗證實驗，得出實際酶活為224.7、225.2、224.0 U/mL，平均為224.63 U/mL，與預測值226.49 U/mL接近，說明該模型能夠較好地預測該菌實際發(fā)酵情況。

環(huán)境因素對微生物的生長與代謝具有很大的影響，適宜的外界環(huán)境能夠促進微生物生長，甚至促進某些人類所需特定代謝產物的生成。本文中培養(yǎng)溫度、氮源和金屬離子對Bacillussp. BI-3的酶活均具有顯著的影響，因此對野生菌的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，能夠有效地提高其產酶量或酶活性[12]。

表6 回歸模型的方差分析

本研究的產酶菌株是源自印度尼西亞卡利安達島東海岸熱泉的地衣芽孢桿菌屬(Bacilluslicheniformis)，芽孢桿菌較其他的產脂肪酶菌(如霉菌和酵母菌等)具有更高的產酶活性[13-14]，而且芽孢桿菌易于保存，能夠降低生產成本，芽孢桿菌還具有較強的胞外分泌酶的能力，投入工業(yè)生產時能夠降低能耗，提高生產效率，是具有較好開發(fā)前景的脂肪酶生產菌。

3 結 論

綜合考慮生物量和環(huán)境因素對酶活的影響后，通過單因素實驗得出最佳培養(yǎng)溫度為50℃、接種量1.5%、初始pH 7.0；培養(yǎng)基成分為酵母粉0.4%、蛋白胨0.7%、氯化鍶13 mmol/L、氯化鈉0%。培養(yǎng)溫度、蛋白胨、氯化鍶與酶活存在著顯著的相關性，通過響應面回歸分析得到優(yōu)化的Bacillussp. BI-3的發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度49.1℃、蛋白胨 0.78%、氯化鍶13 mmol/L，優(yōu)化后發(fā)酵上清液的酶活達到224.63 U/mL。

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Optimization of fermentation conditions of hot spring bacteriaBacillussp. BI-3 producing thermostable lipase

WANG Lei1, ZHANG Peiyu1, LI Jiang2

(1.College of Environment Science and Engineering, Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong, China;2.The First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao 266061, Shandong, China)

A lipase-producing strain from Indonesia hot spring, namedBacillussp. BI-3, was screened by transparent circle. The ranges of single factors(culture temperature, pH, carbon sources, nitrogen sources, metal ions, dosage of NaCl and inoculation amount) were selected by single factor experiment firstly. Then, Box-Behnken design and response surface methodology were adopted to determine the optimal fermentation conditions. The results showed that the optimal fermentation conditions ofBacillussp. BI-3 were obtained as follows: culture temperature 49.1℃, peptone 0.78%, SiCl213 mmol/L, inoculation amount 1.5%, initial pH 7.0, yeast powder 0.4%. The enzyme activity of fermented supernatant was 224.63 U/mL after optimization.

hot spring bacteriaBacillussp. BI-3； thermostable lipase； fermentation condition；response surface methodology

2016-05-26；

2016-09-28

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(0214T09);國家海洋局海洋生物活性物質與現代分析技術重點實驗室開放資金(MBSMAT-2015-06)

王 蕾(1991)，女，碩士研究生，研究方向為微生物生態(tài)學(E-mail)1617906539@qq.com。

李 江，副研究員(E-mail)lijiang@fio.org.cn。

Q556;TQ426

A

1003-7969(2017)01-0104-05