精子發(fā)生中miRNAs調控功能研究進展

陳曉旭，曾文先

（西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌712100）

特別報道

編者按

2017年《中國畜牧雜志》全面改版。為更好展示畜牧學領域的科技前沿，促進學術交流，本刊特別邀請不同領域的專家或青年骨干，圍繞各自的研究領域，介紹自己、團隊或國際研究機構近幾年的研究成果、存在問題及研究展望，或就當前的研究熱點問題進行討論和評論。2017年第一期自副主編開始，將為讀者帶來相關綜述，希望能引發(fā)讀者對相關熱點、難點的思考，并進行深入探討。

精子發(fā)生中miRNAs調控功能研究進展

陳曉旭，曾文先*

（西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌712100）

源源不斷的精子發(fā)生過程是雄性繁殖機能的基礎。精原干細胞（SSCs）持續(xù)不斷地自我更新和分化又是精子發(fā)生的基礎。精子發(fā)生起始于精原干細胞的分化，歷經漫長的減數(shù)分裂后形成單倍體圓形精細胞。后者經過變態(tài)發(fā)育過程，最終形成精子并釋放到曲細精管管腔中[1]。研究表明，成千上萬的基因參與了精子發(fā)生過程，然而如何實現(xiàn)對這些基因精確有效的調控還有待研究。MicroRNAs（miRNAs）作為一類長度為22 nt的單鏈非編碼小RNA，主要參與基因的轉錄后調控。近年來的研究表明，miRNAs參與調控雄性生殖細胞的增殖、分化以及凋亡。本文主要針對精子發(fā)生過程中miRNAs在睪丸不同細胞類型中的調控功能進行綜述。

1 miRNAs的生成與作用機制

miRNAs的轉錄與其在基因組中的位置相關。在眾多miRNAs基因中，大約有一半的miRNAs位于基因的內含子中，其轉錄調控與宿主基因一致或者不依賴于宿主基因。另外，部分miRNAs基因則成簇存在并共有相同的啟動子，因此這些miRNAs基因具有相同的轉錄調控機制[2]。miRNAs基因轉錄成pri-miRNAs，經過Drosha和DGCR8的加工并生成pre-miRNAs。這些pre-miRNAs會在EXP5-Ran·GTP復合物的作用下運送至細胞質，進一步被Dicer加工成雙鏈的RNA[3]。雙鏈的RNA會在AGO蛋白形成的miRNA誘導沉默復合體中進一步成熟為具有生物學功能的miRNAs。miRNAs調控基因的表達主要通過堿基互補配對的方式誘導mRNA的降解或翻譯抑制。這種調控識別方式主要依賴于成熟miRNAs第2～8位堿基的種子序列，因此，1個miRNA可以調控多個基因，同樣的1個基因也可被多個miRNAs調控[4]。

最新的研究表明，N6-腺嘌呤甲基化修飾（m6A）參與調控miRNAs的生成。Alarcon等[5]報道，HNRNPA2B1能夠結合pri-miRNAs的m6A修飾位點，并與DGCR8結合促進pri-miRNAs的加工；當細胞中缺少HNRNPA2B1或者m6A甲基化酶METTL3時，會導致細胞中未加工的pri-miRNAs水平上升，并降低成熟miRNAs的表達水平。因此，miRNAs生成受到m6A的調控。同時，miRNAs可以通過堿基互補配對的方式調控m6A修飾的形成。這種調控方式主要通過抑制METTL3與mRNA的結合，最終改變mRNA上的m6A修飾水平。m6A修飾水平的微妙變化能夠改變mRNA的穩(wěn)定性，從而調控基因的表達[6]。

2 miRNA在精子發(fā)生中的作用

2.1 Dicer條件性敲除模型鼠 Dicer條件性敲除模型鼠已被廣泛應用于探究miRNAs在精子發(fā)生中的作用。Remero等[7]在出生前小鼠的原始精原細胞中敲除Dicer致使減數(shù)分裂異常、粗線期精母細胞凋亡、圓形精子減少以及精細胞形態(tài)異常。Koheron等[8]采用NGN3啟動子驅動的Cre重組酶在A型精原細胞中敲除Dicer，則導致圓形精子細胞缺失，精子發(fā)生嚴重受阻；在早期精原細胞中Dicer的敲除也表現(xiàn)類似結果；在單倍體精子中敲除Dicer導致延長型精子以及精細胞的形態(tài)呈現(xiàn)異常，這些結果均表明miRNAs在精子發(fā)生調控中有著重要作用。

2.2 miRNA在精原干細胞自我更新及分化中的作用 SSCs位于睪丸曲細精管基部的微環(huán)境中，其自我更新與分化的平衡是確保雄性動物源源不斷產生精子的基礎，并受到多種因子調控。神經營養(yǎng)因子（GDNF）能夠作用于細胞表面的RET和GFRα1受體，激活PI3K/AKT或者SFK信號通路，調控SSCs的自我更新[9]。miRNAs也參與SSCs自我更新調控。研究表明，miR-20、miR-21、miR-34c-135a、miR -146a、miR-182、miR-183、miR -204、miR-465a-3p、miR-465b-3p、miR-465c-3p、miR-465c-5p、miR-544在SSCs中高豐度表達[10-11]。其中，miR-20、miR-21和 miR-106a能 夠 維 持 SSCs穩(wěn) 態(tài)。Moritoki等[12]研究表明，miR-135a通過轉錄因子FOXO1的表達變化改變細胞表面膜受體RET蛋白的表達水平，進而調控SSCs的命運。而miR-544及miR-224均能夠通過調控轉錄因子PLZF影響SSCs的自我更新[13-14]。另外，SSCs的增殖則受到miR-34c以及miR-204調控[15-16]。

研究表明，維甲酸能夠誘導精原細胞的分化與減數(shù)分裂起始。維甲酸能夠下調生殖細胞內miR-146、let7家族、miR-17-92、miR-106b-25和 miR-221/222表達水平[17-19]。其中，敲除miR-17-92導致SSCs以及精原細胞數(shù)量減少，并造成精子發(fā)生受損[19]。過表達miR-221/222能夠抑制維甲酸誘導的精原細胞分化。此外，miR-34c靶向于NANOS并上調減數(shù)分裂相關基因，從而調控SSCs的分化和減數(shù)分裂過程[20]。

2.3 miRNA調控減數(shù)分裂以及精子變態(tài)發(fā)育 越來越多的證據表明miRNAs參與減數(shù)分裂的調控。miR-449 和miR-34b/c的表達水平均隨著減數(shù)分裂的開始而上調。由于miR-449和miR-34b/c的種子序列相同，它們在調控精子發(fā)生中的作用有重疊，因此只有同時敲除miR-449和miR-34b/c才能導致精子發(fā)生障礙[21]。同時，miR-34b-5p能夠調控Cdk6的表達以調控減數(shù)分裂過程[22]。類似地，miR-18作為精母細胞中高豐度表達的miRNA，也通過調控Cdk6調控精子發(fā)生過程[23]。

精子發(fā)生中組蛋白依次被過渡蛋白（TPs）以及精蛋白（PRMs）替換是雄性生殖細胞特有的發(fā)育過程[24]。在減數(shù)分裂后期的生殖細胞中，TPs以及PRMs的精確表達是精子變態(tài)發(fā)育的先決條件。因此，為了確保這一過程準確而有效地進行，TPs和PRMs受到嚴格的轉錄后調控。現(xiàn)已證實，miR-469能夠抑制粗線期精母細胞以及圓形精子中TP2和PRM2的表達[25]，而miR-122a則是在生殖細胞后期高豐度表達且調控TP2基因的表達[26]。

盡管大量的miRNAs會在精子變態(tài)發(fā)育過程中丟失，但是精子中殘余的miRNAs同樣具有重要功能。miR-34c參與受精卵第1次分裂過程[27]，而精子中miR-424/322的表達紊亂誘導精子中雙鏈分子的斷裂[28]。通過探究弱精子癥患者與正常人中精子表達的差異，人們確定了一些潛在的可作為不孕標記的miRNAs。以miR-151a-5p為例，miR-151a-5p在弱精子癥患者中高表達且參與線粒體的生物學功能[29]。

2.4 miRNA在睪丸體細胞中的功能 精子發(fā)生同樣依靠睪丸體細胞的參與，來源于支持細胞和間質細胞的細胞因子能夠調控精子發(fā)生過程。因此，miRNAs對睪丸體細胞的調控也可影響精子發(fā)生過程。有研究指出，激素可誘導支持細胞miRNAs的表達水平變化，從而改變支持細胞的狀態(tài)。例如雌二醇可誘導支持細胞miR-17和miR-1285的表達變化，從而調控支持細胞的增殖[30-31]。這種對于支持細胞增殖的調控也可通過miR-133b[32]和miR-762[33]的表達變化實現(xiàn)。睪丸間質細胞主要負責雄激素的生成，促黃體生成素（LH）誘導的雄激素生成過程會受到miRNAs的調控。miR-140-5p/3p能夠控制小鼠睪丸間質細胞的數(shù)量，miR-140-5p/3p的缺失會導致間質細胞數(shù)量的增加[34]。

總的來說，miRNA通過調控支持細胞以及間質細胞的發(fā)育與功能，為SSCs的自我更新和分化創(chuàng)造了一個合適的微環(huán)境，為SSCs提供了結構以及營養(yǎng)支持。因此，睪丸體細胞中miRNAs同樣在精子發(fā)生過程中有著重要的作用。

3 總結與展望

精確而有效地調控基因表達是精子發(fā)生正常進行的先決條件。研究證實，miRNAs在特定的細胞類型或精子發(fā)生階段中表達，然而其中大部分miRNAs在精子發(fā)生中的功能還未闡明。第一，將來的研究可借助單細胞測序的方法，可更為準確地揭示特定生殖細胞類型中miRNAs的表達特點。條件性敲除技術以及CRISPR/Ca9技術的出現(xiàn)將能夠進一步加快關于miRNAs功能的研究。第二，miRNAs在睪丸組織體細胞中的表達特點和作用還有待進一步闡明。睪丸體細胞中的miRNAs能否以旁分泌的方式分泌到SSCs微環(huán)境中，miRNAs能否調控睪丸體細胞生長因子的分泌進而影響生殖細胞發(fā)育，都需要進一步探究。第三，轉錄因子既能夠調控SSCs的自我更新，也能夠調控SSCs的分化，然而miRNAs調控轉錄因子表達的作用機制還需更深入研究。第四，m6A能夠調控pri-miRNAs的加工，這為探究miRNAs生成調控和作用機制拓展了新的視野。在將來的研究中，探究生殖細胞發(fā)育中RNA表觀修飾的變化將為更深刻地理解精子發(fā)生提供理論基礎。最后，一些miRNAs已經被篩選為雄性不育的標記分子，闡明不孕不育患者中miRNAs標記分子的致病機理將有助于為男性不育提供新的療法?？傊?，揭示這些問題將有助于更為深刻地認識和理解miRNAs在精子發(fā)生中的生物學作用。

[1]Rathke C, Baarends W M, Awe S,et al. Chromatin dynamics during spermiogenesis[J]. Biochim Biophys Acta, 2014,1839:155-168.

[2]Ramalingam P, Palanichamy J K, Singh A,et al. Biogenesis of intronic miRNAs located in clusters by independent transcription and alternative splicing[J]. RNA, 2014,20:76-87.

[3]Yi R, Qin Y, Macara I G,et al. Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs[J]. Genes Dev, 2003,17:3011-3016.

[4]Pasquinelli A E. NON-CODING RNA MicroRNAs and their targets: recognition, regulation and an emerging reciprocal relationship[J]. Nat Rev Genet, 2012, 13:271-282.

[5]Alarcon C R, Lee H, Goodarzi H,et al. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing[J]. Nature,2015, 519:482-485.

[6]Alarcon C R, Goodarzi H, Lee H,et al. HNRNPA2B1 Is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events[J]. Cell, 2015, 162:1299-1308.

[7]Romero Y, Meikar O, Papaioannou M D,et al. Dicer1 depletion in male germ cells leads to infertility due to cumulative meiotic and spermiogenic defects[J]. PLoS One, 2011, 6: (10):e25241.

[8]Korhonen H M, Meikar O, Yadav R P,et al. Dicer is required for haploid male germ cell differentiation in mice[J]. PLoS One, 2011, 6:e24821.

[9]Oatley J M, Avarbock M R, Brinster R L. Glial cell linederived neurotrophic factor regulation of genes essential for self-renewal of mouse spermatogonial stem cells is dependent on src family kinase signaling[J]. J Biological Chem, 2007, 282:25842-25851.

[10]Niu Z Y, Goodyear S M, Rao S,et al. MicroRNA-21 regulates the self-renewal of mouse spermatogonial stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011,108:12740-12745.

[11]He Z P, Jiang J J, Kokkinaki M,et al. MiRNA-20 and mirna-106a regulate spermatogonial stem cell renewal at the post-transcriptional level via targeting STAT3 and Ccnd1[J]. Stem Cells, 2013, 31:2205-2217.

[12]Moritoki Y, Hayashi Y, Mizuno K,et al. Expression profiling of microRNA in cryptorchid testes: miR-135a contributes to the maintenance of spermatogonial stem cells by regulating FoxO1[J]. J Urol, 2014, 191:1174-1180.

[13]Song W, Mu H, Wu J,et al. miR-544 regulates dairy goat male germline stem cell self-renewal via targeting PLZF[J]. J Cell Biochem, 2015, 116:2155-2165.

[14]Cui N, Hao G, Zhao Z,et al. MicroRNA-224 regulates selfrenewal of mouse spermatogonial stem cells via targeting DMRT1[J]. J Cell Mol Med, 2016, 20(8):1503-1512.

[15]Li M, Yu M, Liu C,et al. miR-34c works downstream of p53 leading to dairy goat male germline stem-cell (mGSCs)apoptosis[J]. Cell Prolif, 2013, 46:223-231.

[16]Niu B W, Wu J, Mu H L,et al. miR-204 regulates the proliferation of dairy goat spermatogonial stem cells via targeting to sirt1[J]. Rejuvenation Res, 2016, 19:120-130.

[17]Huszar J M, Payne C J. MicroRNA 146 (Mir146) modulates spermatogonial differentiation by retinoic acid in mice[J].Biol Reprod, 2013, 88:15.

[18]Tong M H, Mitchell D, Evanoff R,et al. Expression of Mirlet7 family microRNAs in response to retinoic acidinduced spermatogonial differentiation in mice[J]. Biol Reprod, 2011, 85:189-197.

[19]Tong M H, Mitchell D A, McGowan S D,et al. Two miRNA clusters, Mir-17-92 (Mirc1) and Mir-106b-25(Mirc3), are involved in the regulation of spermatogonial differentiation in mice[J]. Biol Reprod, 2012, 86:72.

[20]Yu M, Mu H, Niu Z,et al. miR-34c enhances mouse spermatogonial stem cells differentiation by targeting Nanos2[J]. J Cell Biochem, 2014, 115:232-242.

[21]Bao J, Li D, Wang L,et al. MicroRNA-449 and microRNA-34b/c function redundantly in murine testes by targeting E2F transcription factor-retinoblastoma protein (E2F-pRb)pathway[J]. J Biol Chem, 2012, 287:21686-21698.

[22]Smorag L, Zheng Y, Nolte J,et al. MicroRNA signature in various cell types of mouse spermatogenesis: Evidence for stage-specifically expressed miRNA-221, -203 and -34b-5p mediated spermatogenesis regulation[J]. Biol Cell,2012, 104:677-692.

[23]Bjork J K, Sandqvist A, Elsing A N,et al. miR-18, a member of Oncomir-1, targets heat shock transcription factor 2 in spermatogenesis[J]. Development, 2010,137:3177-3184.

[24]Kleene K C. Patterns, mechanisms, and functions of translation regulation in mammalian spermatogenic cells[J]. Cytogenet Genome Res, 2003, 103:217-224.

[25]Dai L S, Tsai-Morris C H, Sato H,et al. Testis-specific miRNA-469 Up-regulated in gonadotropin-regulated testicular RNA helicase (GRTH/DDX25)-null mice silences transition protein 2 and protamine 2 messages at sites within coding region implications of its role in germ cell development[J]. J Biol Chem, 2011, 286:44306-44318.

[26]Yu Z R, Raabe T, Hecht N B. MicroRNA Mirn122a reduces expression of the posttranscriptionally regulated germ cell transition protein 2 (Tnp2) messenger RNA (mRNA) by mRNA cleavage[J]. Biol Reprod, 2005, 73:427-433.

[27]Liu W M, Pang R T, Chiu P C,et al. Sperm-borne microRNA-34c is required for the first cleavage division in mouse[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012,109:490-494.

[28]Zhao K, Chen Y, Yang R,et al. miR-424/322 is downregulated in the semen of patients with severe DNA damage and may regulate sperm DNA damage[J]. Reprod Fertil Dev, 2015, 28(10) 1598-1607.

[29]Zhou R, Wang R, Qin Y,et al. Mitochondria-related miR-151a-5p reduces cellular ATP production by targeting CYTB in asthenozoospermia[J]. Sci Rep, 2015, 5:17743.

[30]Kumar N, Srivastava S, Burek M,et al. Assessment of estradiol-induced gene regulation and proliferation in an immortalized mouse immature Sertoli cell line[J]. Life Sci, 2016, 148:268-278.

[31]Jiao Z J, Yi W, Rong Y W,et al. MicroRNA-1285 regulates 17beta-estradiol-inhibited immature boar sertoli cell proliferation via adenosine monophosphate-activated protein kinase activation[J]. Endocrinology, 2015,156:4059-4070.

[32]Yao C, Sun M, Yuan Q,et al. MiRNA-133b promotes the proliferation of human Sertoli cells through targeting GLI3[J]. Oncotarget, 2016, 7:2201-2219.

[33]Ma C P, Song H B, Yu L,et al. miR-762 promotes porcine immature Sertoli cell growth via the ring finger protein 4(RNF4) gene[J]. Sci Rep, 2016, 6:32783.

[34]Rakoczy J, Fernandez-Valverde S L, Glazov E A,et al.MicroRNAs-140-5p/140-3p modulate leydig cell numbers in the developing mouse testis[J]. Biol Reprod, 2013, 88(6):143.

10.19556/j.0258-7033.2017-12-001

國家自然科學基金（31272439、31572401）

陳曉旭（1992- ）男，博士研究生，研究方向為動物遺傳育種與繁殖，E-mail：chenxiaoxu1992@outlook.com

*通訊作者：曾文先，教授，博士生導師，研究方向為動物遺傳育種與繁殖，E-mail：zengwenxian2015@126.com