銀杏酚酸的提取分離方法、檢測(cè)方法、藥理作用及制劑研究進(jìn)展Δ

付強(qiáng)強(qiáng)，高振珅，劉林，井光芳，趙春霞，魯玲，王守箐，3（.臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東 臨沂 276005；2.廣東藥科大學(xué)藥科學(xué)院，廣州 5400；3.臨沂大學(xué)現(xiàn)代中藥研究所，山東 臨沂 276005）

銀杏酚酸的提取分離方法、檢測(cè)方法、藥理作用及制劑研究進(jìn)展Δ

付強(qiáng)強(qiáng)1，2＊，高振珅1，3#，劉林1，井光芳1，趙春霞1，魯玲1，王守箐1，3（1.臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東 臨沂 276005；2.廣東藥科大學(xué)藥科學(xué)院，廣州 511400；3.臨沂大學(xué)現(xiàn)代中藥研究所，山東 臨沂 276005）

目的：為銀杏的綜合利用和銀杏酚酸的進(jìn)一步研究提供參考。方法：以“銀杏酚酸”“提取”“藥理”“檢測(cè)”“Ginkgo phenol acid”“Ginkgolic acids”等為關(guān)鍵詞，組合查詢(xún)2000年1月－2016年6月在PubMed、Springer、ScienceDirect、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普等數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)銀杏酚酸的提取分離方法、檢測(cè)方法、藥理作用和制劑研究等進(jìn)行綜述。結(jié)果與結(jié)論：共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)321篇，其中有效文獻(xiàn)54篇。銀杏酚酸的提取分離方法有回流法、微波法、層析法、樹(shù)脂吸附法和超臨界CO2萃取法等；檢測(cè)方法主要有常規(guī)的薄層色譜法、氣相色譜法、熒光分光光度法、高效液相色譜（HPLC）法、紫外分光光度法以及聯(lián)合應(yīng)用的固相萃取-HPLC法、HPLC串聯(lián)大氣壓化學(xué)電離源質(zhì)譜法、HPLC-二極管陣列檢測(cè)法和HPLC-電噴霧質(zhì)譜等。銀杏酚酸主要有抗腫瘤、抑菌和殺菌、抗病毒、殺蟲(chóng)等藥理作用和抗氧化活性。銀杏酚酸提取分離及分析檢測(cè)方法成熟，但是現(xiàn)有劑型品種匱乏，大多數(shù)研究仍停留在基礎(chǔ)研究階段，局限在殺蟲(chóng)等農(nóng)藥領(lǐng)域或是簡(jiǎn)單的功能性食品方面。開(kāi)發(fā)銀杏酚酸的新劑型，如納米混懸劑、微乳、微囊、微球、包合物、固體分散體、脂質(zhì)體等，將其用于生物農(nóng)藥、功能性食品、抗腫瘤或是抗病毒制劑，具有很好的前景。

銀杏酚酸；提??；分離；藥理作用；制劑

銀杏酚酸屬漆酚類(lèi)物質(zhì)[1]，其為6-烷基或6-烯基水楊酸的衍生物，廣泛存在于銀杏葉、外種皮和種仁中，主要存在于銀杏的外種皮內(nèi)，可分為銀杏酸（白果酸、氫化白果酸、氫化白果亞酸）、銀杏酚、銀杏二酚等[2-3]。銀杏酚酸具有免疫毒性、細(xì)胞毒性和致敏性，是銀杏提取物及其制劑中引起中毒的主要物質(zhì)[4-5]。潘紅梅等[6]采用高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)銀杏酚酸粗提物時(shí)發(fā)現(xiàn)，銀杏酚酸主要由C13∶0、C15∶1、C17∶2、C15∶0、C17∶1等5種酚酸組分組成，銀杏外種皮、葉以及種仁中的銀杏酚酸種類(lèi)一致，但是色譜圖中還有未知的小峰，有待于進(jìn)一步分析確定其成分。筆者以“銀杏酚酸””“提取”“藥理”“檢測(cè)”“Ginkgo phenol acid”“Ginkgolic acids”等為關(guān)鍵詞，組合查詢(xún)2000年1月－2016年6月在PubMed、Springer、ScienceDirect、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普等數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)文獻(xiàn)。結(jié)果，共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)321篇，其中有效文獻(xiàn)54篇。現(xiàn)對(duì)銀杏酚酸的提取分離方法、檢測(cè)方法、藥理作用及其制劑研究等進(jìn)行綜述，以期為銀杏的綜合利用和銀杏酚酸的進(jìn)一步研究提供參考。

1 銀杏酚酸的提取分離方法

銀杏酚酸的提取分離方法有回流法、微波法、層析法、樹(shù)脂吸附法和超臨界CO2萃取法等。

1.1 回流法和微波法

張衡等[7]采用回流法提取銀杏酚酸，將銀杏外種皮預(yù)處理，稱(chēng)取一定量的銀杏外種皮粉末于燒瓶中，按照一定的料液比加入萃取溶劑，恒溫水浴回流提取，得到銀杏酚酸粗提物。研究中發(fā)現(xiàn)，銀杏酚酸的得率隨乙醇濃度的增大而升高，提高溫度有利于銀杏酚酸的提取，提取的最佳時(shí)間為1 h，而料液比對(duì)得率的影響不大。采用微波法提取銀杏酚酸，與回流法不同的是將恒溫水浴回流換成在微波催化合成/萃取儀中進(jìn)行萃取，從而得到銀杏酚酸粗提物。研究中發(fā)現(xiàn)，提取溶劑乙醇的濃度對(duì)得率的影響最大。在確保得率的情況下，微波法具有節(jié)省時(shí)間和能源、易于工業(yè)化操作的優(yōu)點(diǎn)。

1.2 層析法

1.2.1 柱層析分離 藏麗等[8]先使用皂化反應(yīng)，將銀杏外種皮中的酸性成分分離出來(lái)，再對(duì)總酸部分進(jìn)行酯化反應(yīng)，使總酸轉(zhuǎn)變成銀杏酸與脂肪酸酯的混合物，接著柱層析分離。在進(jìn)行柱層析分離時(shí)，第一步是用展開(kāi)劑淋洗層析柱，收集的餾分加入另一層析柱中，用另一種展開(kāi)劑進(jìn)行洗脫，多次洗脫后，得到產(chǎn)品。經(jīng)過(guò)檢測(cè)，得到的銀杏酸產(chǎn)品是由3種銀杏酸及2種二羥基銀杏酸組成的混合物。

1.2.2 薄層層析分離 倪學(xué)文等[9]在分離銀杏酚酸時(shí)采用了薄層層析法。將銀杏酚酸混合物溶于有機(jī)溶劑中，點(diǎn)樣、展開(kāi)、顯色，收集各個(gè)主要譜帶，經(jīng)甲醇洗脫、過(guò)濾，取濾液。將濾液濃縮，再加入稀硝酸溶解，用醇類(lèi)萃取，冷凍干燥后得到單體化合物。

1.3 樹(shù)脂吸附法

尹秀蓮等[10]采用樹(shù)脂吸附法分離銀杏酚酸。將銀杏酚酸石油醚溶液通過(guò)裝有D290樹(shù)脂的離子交換柱，大孔樹(shù)脂吸附完全后進(jìn)行洗脫，洗脫劑為1%的乙酸/石油醚溶液。除去洗脫液中的溶劑和乙酸，得到純度為85.59%的銀杏酚酸。倪學(xué)文等[11]做了樹(shù)脂的靜態(tài)吸附試驗(yàn)，將預(yù)處理的6種濕樹(shù)脂（NAK-9、X-5、AB-8、ADS-17、D3520、D4020）放入燒瓶中，加入吸附原液，振蕩，吸附完全后，過(guò)濾，用HPLC法測(cè)定濾液。結(jié)果，在6種吸附樹(shù)脂中樹(shù)脂AB-8的吸附效果最好。當(dāng)采用兩種大孔吸附樹(shù)脂吸附、不同濃度乙醇梯度洗脫時(shí)，產(chǎn)物純度可達(dá)95%[12]。利用樹(shù)脂精制銀杏酚酸成本低、效率高，是一種有效的分離方法。

1.4 超臨界CO2萃取法

金黨琴[13]對(duì)超臨界CO2萃取法萃取銀杏外種皮中銀杏酚酸的工藝進(jìn)行了研究。將銀杏外種皮粉末裝于萃取設(shè)備中，在設(shè)定的條件下分別進(jìn)行靜態(tài)萃取和動(dòng)態(tài)萃取，在分離器中收集銀杏酚酸。在萃取壓力為25 MPa、萃取溫度為40℃、萃取時(shí)間為5 h、CO2流量為20 g/min、夾帶劑為乙醇的條件下，銀杏酚酸得率為0.9%[13]。尹秀蓮等[14]在萃取壓力為30 MPa、萃取溫度為45℃、萃取時(shí)間為6 h、CO2流量為2 L/min的條件下，制得銀杏酚酸的純度達(dá)80%。Tian L等[15]采用響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)超臨界CO2萃取法，在萃取壓力為31.3 MPa、萃取溫度為46.1℃、CO2流量為11.1 g/min、乙醇夾帶劑為30 mL、靜態(tài)時(shí)間為1 h、動(dòng)態(tài)時(shí)間為2 h的條件下，提取量達(dá)74 mg/g。超臨界CO2萃取法具有操作方法簡(jiǎn)便、有機(jī)溶劑使用量少、得率高、純度高、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。

2 銀杏酚酸的檢測(cè)方法

銀杏酚酸的檢測(cè)方法主要有常規(guī)的薄層色譜（TLC）法、氣相色譜（GC）法、熒光分光光度法、HPLC法、紫外分光光度（UV）法以及聯(lián)合應(yīng)用的固相萃取-HPLC法、HPLC串聯(lián)大氣壓化學(xué)電離源質(zhì)譜法、HPLC-二極管陣列檢測(cè)法和HPLC-電噴霧質(zhì)譜等。

2.1 熒光分光光度法

熒光分光光度法具有靈敏度高、操作方便、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)。田亞平等[16]建立了檢測(cè)銀杏酚酸的熒光分光光度法，與HPLC法比較，兩種方法的測(cè)定結(jié)果基本一致，但是前者具有精密度偏低的缺點(diǎn)。目前，該法已很少采用。

2.2 HPLC法

HPLC法作為最常用的一種含量測(cè)定方法，具有方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性好、重現(xiàn)性好、精密度高等優(yōu)點(diǎn)，但是儀器價(jià)格相對(duì)昂貴[16-17]。王蕎薇等[17]采用HPLC法測(cè)定銀杏葉中銀杏酚酸的含量，結(jié)果表明，該法的精密度、準(zhǔn)確度均十分理想，可用于銀杏葉的質(zhì)量控制。

反相HPLC（RP-HPLC）法作為HPLC法的一部分，具有分離效果好、準(zhǔn)確性高、分析速度快及儀器自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合于揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子質(zhì)量大及離子型化合物的分析。所以，銀杏酸的RPHPLC法分析發(fā)展特別迅速?？子裣嫉萚18]采用RP-HPLC法測(cè)定銀杏酸，結(jié)果表明該法的準(zhǔn)確度高、精密度好、分析速度快，適合銀杏酸的測(cè)定。

2.3 UV法

仰榴青、趙東亞等[19-20]研究了UV法測(cè)定銀杏酸的含量。銀杏酸屬弱極性物質(zhì)，銀杏外種皮提取物溶液中弱極性的黃酮類(lèi)化合物，由于吸收峰靠近銀杏酸檢測(cè)波長(zhǎng)且含量相對(duì)較高，會(huì)干擾銀杏酸測(cè)定。預(yù)凈化樣品采用正己烷萃取法，避免了多次濃縮過(guò)程。UV法檢測(cè)結(jié)果與HPLC法相似，但前者操作簡(jiǎn)單、分析速度快、投入成本低，是一種更容易推廣的銀杏酸定量分析方法。

2.4 其他方法

《美國(guó)藥典》（35版）[21]和《歐洲藥典》（6.1版）[22]規(guī)定，銀杏制劑中銀杏酚酸的含量應(yīng)低于5 μg/g[21-23]；2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[24]規(guī)定，銀杏制劑中銀杏酚酸的含量應(yīng)低于10 μg/g。羅曼等[25]采用固相萃取-HPLC法測(cè)定毒性成分總銀杏酸含量，采用C18柱，用75%甲醇洗脫去脂溶性雜質(zhì)，有效除去了雜質(zhì)的干擾，保證了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。Fuzzati N等[23]采用HPLC串聯(lián)大氣壓化學(xué)電離源質(zhì)譜法和HPLC-二極管陣列檢測(cè)法用于分析銀杏酸和其相關(guān)的酚類(lèi)，樣品在室溫下48 h內(nèi)穩(wěn)定。該法不需要濃縮步驟，可用于銀杏提取物中銀杏酚酸的定量分析，但是儀器價(jià)格昂貴。Ndjoko K等[26]采用HPLC-電噴霧質(zhì)譜法對(duì)銀杏葉提取物通過(guò)電噴霧電離進(jìn)行了快速定性和定量測(cè)定，該法比LC-UV法具有更強(qiáng)的選擇性和較高的靈敏度，可量化測(cè)定銀杏酚酸的含量低至1.5 μg/g。該法可廣泛用于各種商業(yè)化的銀杏制劑的研究，以考察有關(guān)植物藥的安全性。Xia H等[27]使用HPLC-電噴霧質(zhì)譜法檢測(cè)大鼠血漿中銀杏酚酸，用于其藥動(dòng)學(xué)的研究，獲得了滿意結(jié)果。該法可用于生物樣品中銀杏酚酸的含量測(cè)定。

3 銀杏酚酸的藥理作用

銀杏酚酸具有致過(guò)敏、致突變的作用，被看作是銀杏葉提取物中的有害成分，此毒性成分可抑制大腦里的谷氨酸轉(zhuǎn)變成γ-氨基丁酸，進(jìn)而使大腦細(xì)胞功能喪失[28-30]。銀杏酚酸對(duì)原代大鼠肝細(xì)胞的毒性明顯小于對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性，細(xì)胞色素P450（CYP）3A和CYP1A介導(dǎo)的反應(yīng)可能會(huì)增強(qiáng)銀杏酚酸的毒性[31]。近年來(lái)，人們對(duì)銀杏酚酸的藥理作用[32]研究逐步深入，尤其是抗腫瘤、抑菌和殺菌、抗病毒、殺蟲(chóng)和抗氧化等方面。

3.1 抗腫瘤作用

銀杏酚酸能抑制細(xì)胞增殖、遷移和浸染活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；能誘導(dǎo)激活腺苷一磷酸激活的蛋白激酶途徑及一些關(guān)鍵酶的合成，例如乙酰輔酶A/脂肪酸合成酶，從而抑制癌細(xì)胞脂肪的從頭合成[33]。銀杏酚酸對(duì)體外人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的毒性作用和體內(nèi)荷H22肝癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制作用的研究結(jié)果表明，其能明顯抑制這兩種細(xì)胞的增長(zhǎng)，并抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[34-35]。銀杏酚酸于體外能抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721生長(zhǎng)，在0～30 mg/L范圍內(nèi)呈時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系。銀杏酚酸對(duì)荷H22肝癌小鼠的免疫系統(tǒng)不僅沒(méi)有明顯的不良反應(yīng)，而且還能顯著提高荷瘤小鼠的免疫功能，表現(xiàn)為荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)的顯著升高。銀杏酚酸于體內(nèi)能顯著抑制荷H22肝癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)，其抑瘤作用可能與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能有關(guān)[34]。研究提示，銀杏酚可作為一種小劑量抗腫瘤輔助藥物。

3.2 抑菌和殺菌作用

銀杏酚酸對(duì)茄子白絹病菌、茄子立枯病菌、甘藍(lán)黑斑病菌、白菜炭疽病菌、黃瓜枯萎病菌等5種蔬菜病原菌的菌絲生長(zhǎng)都有抑菌作用[36]，可以抑制一些常見(jiàn)植物致病性真菌的生長(zhǎng)[37]。銀杏酚酸對(duì)柿角斑病菌、稻瘟病菌、梨銹病菌、玉米炭疽病菌、柑橘瘡痂病菌、甘蔗鳳梨病菌、西瓜枯萎病菌、梨褐斑病菌和香蕉炭疽病菌等9種植物病原真菌均有抑制作用，其中對(duì)香蕉炭疽病菌活性最高；對(duì)綠膿桿菌、蠟樣芽孢桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、痢疾志賀氏菌、大腸埃希菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、傷寒桿菌等10種動(dòng)物病原細(xì)菌也有不同程度的抑制作用，其中對(duì)巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性最強(qiáng)[38]。銀杏酚酸對(duì)2種細(xì)菌（大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌）以及4種真菌（青霉、產(chǎn)紫青霉、沙門(mén)柏干酪青霉、黑曲霉）均有抑菌作用，其中對(duì)大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、青霉的抑菌作用較好[39]。

3.3 抗病毒作用

銀杏提取物對(duì)單純皰疹Ⅰ型病毒和水皰性口炎病毒均無(wú)作用，但對(duì)柯薩奇B3病毒有一定的抗病毒作用[40]。銀杏酚酸在體外能抑制非細(xì)胞體系的人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）蛋白酶活性和人體細(xì)胞的HIV感染。與陰性對(duì)照組比較，銀杏酸（31.2 μg/mL）抑制HIV蛋白酶活性達(dá)60%，呈濃度依賴(lài)性；在質(zhì)量濃度為150μg/mL時(shí)，僅表現(xiàn)出有限的細(xì)胞毒性[41]。

3.4 殺蟲(chóng)作用

銀杏酚酸具有殺蟲(chóng)作用。石啟田等[42-45]研究表明，銀杏外種皮中的銀杏酸、銀杏酚、白果酚是殺蟲(chóng)、驅(qū)蟲(chóng)的活性物質(zhì)[42]，對(duì)多種蚜蟲(chóng)及薊馬、菜青蟲(chóng)等農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)具有防治作用[43]。銀杏酚對(duì)菜青蟲(chóng)的防治作用是以拒食作用和驅(qū)蟲(chóng)作用為主[44]，作用機(jī)制是由于銀杏酚抑制了酶的合成，影響了菜青蟲(chóng)的蛻皮和生長(zhǎng)發(fā)育，使其表現(xiàn)為拒食和發(fā)育為超齡幼蟲(chóng)，多數(shù)不能形成蛹而致死[45]。金黨琴[46]研究表明，銀杏酚酸對(duì)甜菜夜蛾的作用方式有多種，包括胃毒、觸殺、拒食、內(nèi)吸等，其中以拒食作用最為顯著。

銀杏酚酸作為新型滅螺藥，其活性作用機(jī)制不同于氯硝柳胺，而是靶向于釘螺線粒體，抑制包括細(xì)胞色素C氧化酶、三磷酸腺苷合成酶、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶等線粒體酶的基因表達(dá)[47]。Wu L等[48]利用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)研究銀杏酚酸、硝唑尼特、大蒜素與蒿甲醚在體外培養(yǎng)體系抗隱孢子蟲(chóng)活性的影響研究表明，銀杏酚酸可以抗隱孢子蟲(chóng)的活性。

Maleeva G等[49]采用膜片鉗技術(shù)，研究銀杏酚酸對(duì)激活在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達(dá)的受體通道引起的離子電流的影響，結(jié)果顯示，銀杏酸可使α1甘氨酸受體亞基介導(dǎo)的電流增強(qiáng)，而對(duì)α2、α3甘氨酸受體或γ-氨基丁酸A型受體無(wú)此作用。這表明銀杏酚酸是一種新型的α1甘氨酸受體的選擇性增強(qiáng)劑。

此外，銀杏酚酸還具有抗氧化活性。銀杏外種皮多酚粗提物對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和羥自由基的清除能力隨濃度升高而增強(qiáng)[50]。

4 銀杏酚酸的制劑研究

張小利等[51-52]制備了銀杏酸凝膠劑。楊小明等[53]，研制了銀杏酸微乳劑，應(yīng)用于農(nóng)藥。程華平等[54]進(jìn)行了銀杏酸豆奶的研制，擴(kuò)展了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，銀杏酚酸提取分離及分析檢測(cè)方法成熟，但是現(xiàn)有劑型品種匱乏，大多數(shù)研究仍停留在基礎(chǔ)研究階段，局限在殺蟲(chóng)等農(nóng)藥領(lǐng)域或是簡(jiǎn)單的功能性食品方面。開(kāi)發(fā)銀杏酚酸的新劑型，如納米混懸劑、微乳、微囊、微球、包合物、固體分散體、脂質(zhì)體等，將其用于生物農(nóng)藥、功能性食品、抗腫瘤或是抗病毒制劑，具有很好的前景。另外，對(duì)銀杏酚酸的毒性及其治療作用的研究有待進(jìn)一步拓展，尤其是其生物利用度、藥動(dòng)學(xué)和毒理研究。對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以尋找低毒高效的化合物也是今后研究的一個(gè)方向。

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R248.1；R943.1

A

1001-0408（2017）04-0547-04

2016-05-09

2016-12-07）

（編輯：余慶華）

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（No.2015GSF119013）；臨沂大學(xué)2015年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（No.43、44）

＊學(xué)士。研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)。E-mail：932291822 @qq.com

#通信作者：講師，碩士。研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)。E-mail：zhenshengao@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.32