非小細(xì)胞肺癌組織中ATF3表達(dá)及其臨床意義*

杜志明，江柏青

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科，江西 贛州 341000)

非小細(xì)胞肺癌組織中ATF3表達(dá)及其臨床意義*

杜志明，江柏青

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科，江西 贛州 341000)

目的：初步探討非小細(xì)胞肺癌中ATF3表達(dá)與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。方法：回顧分析我院選取98例術(shù)后病理診斷為非小細(xì)胞肺癌的患者，于2007年1月～2009年5月在我院行肺癌根治術(shù)，選取同一患者距離肺癌組織≥5 cm切緣的正常肺組織作為對照組，同時分別選取正常肺組織30例及炎性肺組織30例分別進(jìn)行檢測。采用免疫組化法及RT-PCR檢測肺組織中ATF3表達(dá)水平，并結(jié)合肺癌患者隨訪數(shù)據(jù)運(yùn)用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存期分析。結(jié)果： ATF3在非小細(xì)胞肺癌中呈高表達(dá)率，ATF3表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有顯著差異性(P<0.05)。生存分析提示ATF3的陽性組的生存期較ATF3陰性組的低(P<0.001)。結(jié)論：ATF3蛋白在非小細(xì)胞肺癌表達(dá)水平與癌旁組、正常肺組織組及炎性肺組織的表達(dá)水平有顯著差異性；且ATF3蛋白表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和TNM分期中有相關(guān)性；ATF3表達(dá)水平可作為肺癌患者術(shù)后預(yù)后判斷的指標(biāo)之一。

非小細(xì)胞肺癌；ATF3；免疫組化；RT-PCR

肺癌(lung cancer，LC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率都位居惡性腫瘤的前列，并且有逐年增高的趨勢[1]。肺癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前認(rèn)為是多因素、多途徑、長期共同作用的結(jié)果，包括外環(huán)境致癌因素(包括以吸煙、職業(yè)接觸致癌物、生活環(huán)境等)和自身內(nèi)在因素(肺部慢性疾病、自身免疫情況、遺傳因素等)[2-3]。激活轉(zhuǎn)錄因子3(activating transcription factor 3,ATF3)屬含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子ATF/CREB亞家族成員，它是一個應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)基因。在眾多的研究發(fā)現(xiàn)ATF3與腫瘤有關(guān)，并且很多的證據(jù)都顯示ATF3在人類腫瘤組織中有過度的表達(dá)。但在非小細(xì)胞肺癌中研究較少。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2007年1月～2009年5月在贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院行肺癌根治術(shù)患者98例，選取同一患者距離肺癌組織≥5 cm切緣的正常組織作為對照組。所有非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本均有完整的病理組織學(xué)資料和完整的臨床資料。所有病例均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，病例臨床病理資料如下：男性72例，女性26例；年齡28～78歲，中位年齡56.2歲；腫瘤直徑≤3 cm的51例，腫瘤直徑﹥3 cm的47例。同時分別選取正常肺組織30例(取自肺大皰手術(shù)及創(chuàng)傷性廢用肺組織)及炎性肺組織30例(包括炎性假瘤及結(jié)核球等)分別進(jìn)行檢測。隨訪至2014年5月，共隨訪98例，另外失訪8例按截尾值處理。

1.2 檢測方法 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。采用免疫組織化學(xué)即用型二步法染色檢測非小細(xì)胞肺癌ATF3表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)格一致。每例均常規(guī)HE染色。同時用非小細(xì)胞肺癌患者的手術(shù)切除肺癌組織及癌旁組織，采用半定量RT-PCR，提取RNA用Trizol法(北京TIANGEN生物技術(shù)公司)來提取組織中的ATF3，選取GAPDH作為內(nèi)參照，后用紫外分光光度計檢測總RNA的純度和濃度。

PCR引物序列及擴(kuò)展產(chǎn)物如下：ATF3(314堿基對)的引物是5′-ATGATGCTTCAACACCCAGG-3′(正義鏈)和5′-TTTCGGCACTTTGCAGCTG-3′(反義鏈)。GAPDH(280堿基對)的引物5′-CATGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3′(正義鏈)和5′-GTTCAGCTCAGGGATGACCTTG-3′(反義鏈)。RT-PCR引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成。循環(huán)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 45 s，擴(kuò)增72 ℃ 60 s，循環(huán)32次；延伸72 ℃ 10 min，4 ℃終止。電泳鑒定并用凝膠成像系統(tǒng)(GelDot-It300)照像，并用圖像分析軟件分析光密度值，計算相對系數(shù)。相對系數(shù)=細(xì)胞因子表達(dá)強(qiáng)度/GAPDH表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 結(jié)果判定 免疫組化結(jié)果判定：每張切片由兩位病理專家采用盲法閱片，若意見不一，則再次閱片，討論后決定最后結(jié)果。ATF3染色定位于細(xì)胞核，胞漿內(nèi)也有少量著色，細(xì)胞陽性表達(dá)判斷時鏡下組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，以細(xì)胞核有棕黃色顆粒沉著。判定標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[14],每個高倍鏡下綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例，采用組織學(xué)評分(∑pi)計算積分。其中P代表將細(xì)胞陽性百分率進(jìn)行半定量分級：<5%為0分；5%～50%為2分；50%～75%為3分；≥75%為4分。i代表細(xì)胞染色深淺，0為不顯色或顯色不清；1為淺黃色；2為棕黃色；3為深褐色。兩者積分之和1～3分為弱陽性“+”，3～8分為中度陽性“++”，9～12分為強(qiáng)陽性“+++”。“++”及以上為陽性表達(dá)，用以計算陽性率。RT-PCR結(jié)果判斷：用凝膠電泳成像分析系統(tǒng)觀察并分析結(jié)果。在UV-254紫外透射反射分析儀上觀察結(jié)果，用凝膠成像系統(tǒng)(GelDot-It300)照像，并用圖像分析軟件分析光密度值，以ATF3/GAPDH光密度比值來表示ATF3 mRNA表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，ATF3表達(dá)與臨床病理關(guān)系分析結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)，ATF3 mRNA表達(dá)水平采用t檢驗(yàn)來分析。根據(jù)隨訪結(jié)果行Kaplan-Meier生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化顯示ATF3在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的分布 ATF3主要在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)著色，也有少量在胞漿染色，呈棕黃色(圖1與圖2)。

圖1 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞核中ATF3免疫組化染色陽性IHC ×100

2.2 ATF3在非小細(xì)胞肺癌組、正常肺組織組和炎性肺組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示：ATF3在非小細(xì)胞肺癌表達(dá)率為62.24%(61/98)，而正常肺組織組的表達(dá)率為0%(0/30)，炎性肺組織組的表達(dá)率10.00%(3/30)，χ2=51.23，P﹤0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

2.3 ATF3在非小細(xì)胞肺癌組與癌旁組中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示：ATF3在非小細(xì)胞肺癌表達(dá)率為62.24%(61/98)，而癌旁組的表達(dá)率為5.10%(5/98)，χ2=71.638，P﹤0.01，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表1 非小細(xì)胞肺癌組與正常肺組織組及炎性肺組織組中ATF3的表達(dá)

表2 非小細(xì)胞肺癌組與癌旁組中ATF3的表達(dá)

2.4 ATF3表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床特征的關(guān)系 免疫組化結(jié)果顯示：ATF3在非小細(xì)胞肺癌表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度無關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期有關(guān)，P﹤0.05，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

表3 ATF3表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床特征的關(guān)系

2.5 半定量RT-PCR分析ATF3 mRNA在NSCLC與癌旁正常肺組織組中表達(dá)情況

2.5.1 ATF3 mRNA在NSCLC與癌旁正常組織表達(dá) 見圖3。

圖3 RT-PCR：T代表腫瘤組織，N代表癌旁組織

2.5.2 半定量RT-PCR分析ATF3 mRNA在NSCLC與癌旁正常肺組織組中表達(dá)的相對值 我們用ATF3/GAPDH光密度比值來表示ATF3 mRNA表達(dá)水平。ATF3 mRNA在NSCLC和癌旁正常肺組織的相對值見表4。在98例的NSCLC組中有98例均檢測出有ATF3 mRNA表達(dá)，癌旁正常肺組織組中有5例有表達(dá)。ATF3在NSCLC中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組(P<0.01)(表4)。

表4 ATF3mRNA在NSCLC與癌旁正常肺組織組中表達(dá)的相對值

2.6 ATF3陰性及陽性患者的生存曲線 在對98例ATF3表達(dá)陽性及陰性的患者進(jìn)行隨訪，并進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，提示ATF3陽性患者的生存期低于陰性患者，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖4)。

圖4 Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

在正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化是多階段、多基因參與的過程。在這些過程中涉及多個相關(guān)基因的調(diào)節(jié)和多條傳導(dǎo)途徑激活。特別是在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中，腫瘤細(xì)胞因?yàn)橛龅皆S多的應(yīng)激信號和損傷從而激活多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過復(fù)雜而精確的調(diào)控，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)反應(yīng)。激活轉(zhuǎn)錄因子3 (ATF3)在大多數(shù)細(xì)胞中ATF3的mRNA的水平是很低的或者不能被探查出，但是它會被各種應(yīng)激信號大量的誘導(dǎo)[4-5]。動物實(shí)驗(yàn)表明ATF3被誘導(dǎo)的信號有：缺血、缺血再灌注損傷、創(chuàng)傷、軸突斷裂、機(jī)體受到侵襲等；在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中ATF3被誘導(dǎo)的信號包括：血清因子類、細(xì)胞因子類、遺傳毒性因子、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子、腺病毒蛋白E1A等[4]。并且我們發(fā)現(xiàn)這些誘導(dǎo)的信號大多數(shù)都是損傷性信號，同時ATF3是在這些反應(yīng)中最早的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子之一。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化，我們發(fā)現(xiàn)ATF3主要分布在非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞核，也有少量表達(dá)于細(xì)胞漿，染色為棕黃色顆粒。因?yàn)锳TF3是一個高度保守的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在大多數(shù)細(xì)胞中的表達(dá)水平是很低的，但細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)中特別是在DNA發(fā)生損害時，會發(fā)生向上的調(diào)節(jié)[6]。本組研究發(fā)現(xiàn)ATF3在正常及炎癥肺組織基本不表達(dá)，可能是炎性刺激大部分未損傷肺組織的DNA，ATF3的傳導(dǎo)通路未被激活，故ATF3未在正常肺組織及炎性肺組織中表達(dá)；而在炎性肺組織中的有3例有ATF3的表達(dá)，可能是炎性刺激比較強(qiáng)，以致炎性肺組織有癌變的傾向。

王新君等[7]研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中ATF3表達(dá)明顯高于前列腺增生組和正常前列腺組，估計ATF3表達(dá)增加為促進(jìn)細(xì)胞增值和促進(jìn)細(xì)胞周期及抑制凋亡的相關(guān)基因有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATF3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)上調(diào)，與王新君等研究結(jié)果相一致，提示ATF3在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生和發(fā)展中起一定的作用。但同時顯示ATF3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤的大小、組織學(xué)類型和分化程度關(guān)系不大(P<0.05)。

ATF3在腫瘤細(xì)胞中不僅僅表現(xiàn)出表達(dá)增加，而且有關(guān)研究還顯示出其表達(dá)的增加可能增加腫瘤的侵襲力和能動性。Bandyopadhyay等[8]通過微陣列的研究發(fā)現(xiàn)Drg1能通過抑制ATF3啟動子的活性來調(diào)控ATF3的表達(dá)。而ATF3的過度表達(dá)能增加在體外的前列腺癌細(xì)胞的侵襲力，更重要的是ATF3的過度表達(dá)在顯著增加了前列腺細(xì)胞的肺部轉(zhuǎn)移，通過下調(diào)ATF3基因的表達(dá)能抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲力。Janz等[9]在研究霍奇金淋巴瘤時發(fā)現(xiàn)ATF3在RS細(xì)胞中過度表達(dá)，而旁邊的細(xì)胞未被探及染色，同時通過RNA干擾技術(shù)敲除ATF3基因，結(jié)果使霍奇金淋巴瘤細(xì)胞增殖受到了抑制，其細(xì)胞活力降低。Yin等[10]在體外研究中發(fā)現(xiàn)ATF3在腫瘤發(fā)展中具有兩種截然相反的功能。通過增加或缺失功能的方法，發(fā)現(xiàn)在未轉(zhuǎn)移的MCF10A乳房上皮細(xì)胞中ATF3能促進(jìn)其凋亡，而在具有侵襲性的MCF10CA1a癌細(xì)胞中ATF3能保護(hù)該細(xì)胞，并能增加該細(xì)胞的能動性。ATF3在惡性腫瘤中表達(dá)對于惡性腫瘤是有利的，因?yàn)樗芴岣吣[瘤細(xì)胞的能動性和侵襲力。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATF3的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況和TNM分期有相關(guān)性。特別是在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況中，ATF3的表達(dá)有顯著的差異性，ATF3的陽性率隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的嚴(yán)重程度而逐漸升高，轉(zhuǎn)移情況越嚴(yán)重，其陽性表達(dá)率越高，并且卡方檢驗(yàn)提示P<0.01，有顯著的差異性，故可以認(rèn)為ATF3的表達(dá)與腫瘤侵襲力和能動性密切相關(guān)，結(jié)果與以上研究相一致。ATF3可能參與了非小細(xì)胞肺癌的腫瘤轉(zhuǎn)移，表達(dá)增加使腫瘤的侵襲力和能動性增加。

在Kaplan-Meier生存分析中，ATF3的陽性組的生存期較ATF3陰性組的低(P<0.001)。單因素分析顯示，ATF3的陽性與總體的生存率有關(guān)。多因素分析顯示ANXA2的表達(dá)與一些傳統(tǒng)的因素(腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期)密切相關(guān)。這些結(jié)果都表明，ANXA2在非小細(xì)胞肺癌患者中的高表達(dá)提示該患者預(yù)后差。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示ATF3在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)升高，ATF3的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)，與腫瘤的分級相關(guān)。ATF3的表達(dá)在腫瘤轉(zhuǎn)移組中升高，并且轉(zhuǎn)移的越嚴(yán)重表達(dá)率就越高，說明該因子在非小細(xì)胞肺癌中的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起到重要的作用。ATF3可以作為預(yù)測非小細(xì)胞肺癌的惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)。ATF3在惡性腫瘤中的具體作用可能與腫瘤本身的惡性程度和所處的內(nèi)環(huán)境有相關(guān)性，并且可能和機(jī)體自身的免疫功能有關(guān)。因?yàn)樵摶蚰苷{(diào)控細(xì)胞周期和腫瘤的轉(zhuǎn)移，若進(jìn)一步研究ATF3的作用信號傳導(dǎo)通路及分子機(jī)制，可能能揭示出非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

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Expression of ATF3 in the Tissue of Non-small-cell Lung Cancer and its Clinical Significance

DUZhi-ming,JIANGBai-qing

(Dept.ofCardiothoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou,JingXi341000)

Objectives：To observe the expression of ATF3 in non-small cell lung cancer tissues,and to investigate the relationship between ATF3 expression and clinical pathological character and prognosis in non small cell lung cancer. Methods: Retrospective analysis of 98 patients with non-small cell lung cancer diagnosed by postoperative pathology was performed,who were undergone lung cancer surgery in our hospital from January, 2007 to May,2009. Normal lung tissue of the same patient more than 5 cm away from lung cancer tissue was taken as control group.30 normal lung tissue and 30 inflammatory lung tissue were detected. RT-PCR and immunohistochemistry were used to detect the expression of ATF3 in normal lung tissues and non-small cell lung cancer, which was combined with the analysis of patient survival time. Results：ATF3 showed high expression rate in non small cell lung cancer. There was a significant difference between ATF3 expression and lymph node metastasis and TNM stage (P<0.05). Survival analysis suggested that the survival time of ATF3 positive group was lower than that of ATF3 negative group (P<0.001). Conlusion: The expression level of ATF3 protein and those of the adjacent group in non-small cell lung cancer, normal lung tissue and inflammatory lung tissue have significant difference; the protein expression of ATF3 is correlated with the lymph node metastasis and TNM staging; ATF3 expression can be used as one of the indicators of prognosis of patients with lung cancer.

non-small-cell lung cancer；ATF3；RT-PCR；immunohistochemistry

江西省教育廳科研基金資助項(xiàng)目(編號：GJJ10576)

江柏青，男，教授、主任醫(yī)師。E-mail:jwt12345@163.com

R734.2

A

1001-5779(2016)06-0891-05

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.06.015

2016-07-18)(責(zé)任編輯：敖慧斌)