SALL4、OCT4、C-kit在精原細胞瘤中的表達觀察*

何 玨，鄧 曉，張文書，王珍玲

(贛南醫(yī)學院病理學教研室，江西 贛州 341000)

SALL4、OCT4、C-kit在精原細胞瘤中的表達觀察*

何 玨，鄧 曉，張文書，王珍玲

(贛南醫(yī)學院病理學教研室，江西 贛州 341000)

目的：觀察SALL4、OCT4、C-kit在精原細胞瘤中的表達，探討其在該瘤病理診斷中的意義。方法：選取68例精原細胞瘤和20例病理形態(tài)相似的非精原細胞性腫瘤的術后標本，應用常規(guī)病理學技術及免疫組化Polink-2HRP染色系統(tǒng)檢測SALL4、OCT4、C-kit的表達，并觀察分析其與臨床病理形態(tài)特征的關系。結果： SALL4、OCT4、C-kit在68例精原細胞瘤中的表達率分別為100%(68/68)、91.2%(62/68)、95.5%(65/68)；在20例非精原細胞性腫瘤中的表達率分別為35%(7/20)、20%(4/20)、25%(5/20)；SALL4、OCT4、C-kit在精原細胞瘤中的表達明顯高于非精原細胞性腫瘤(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。結論：SALL4在精原細胞瘤中的表達具有較高的敏感性，協(xié)同OCT4、C-kit使用，對其病理診斷具有重要價值。

精原細胞瘤；SALL4；OCT4；C-kit；免疫組織化學

精原細胞瘤(Seminoma，SM)是來源于男性胚胎性腺原始生殖細胞的一類最常見的惡性腫瘤，占所有生殖細胞腫瘤的27%～56%，約90%發(fā)生于睪丸，在中線部位生殖神經(jīng)嵴附近如縱膈、腹膜后、顱內(nèi)松果體亦有一定的發(fā)病[1]；其形態(tài)學與其它圓細胞惡性腫瘤有一定的重疊，病理診斷有一定難度。SM對化療和放射治療均具有很高的敏感性，準確診斷，合理及時的治療可明顯提高其生存時間和生活質量[2]。SALL4是近年發(fā)現(xiàn)的一種來源于生殖干細胞的腫瘤基因[3]，OCT4是具有較強特異性的胚胎干細胞標志物，原癌基因 C-kit(CD117) 是造血干細胞的標志物，三者協(xié)同使用，對SM的病理診斷有很好的幫助。筆者選取2009年1月～2013年12月贛南醫(yī)院第一附屬醫(yī)院經(jīng)手術切除的SM共計68例為研究組，選取形態(tài)相似的非精原細胞性腫瘤(Non Seminoma,NSM)包括彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、胸腺瘤、黑色素瘤、低分化神經(jīng)內(nèi)分泌癌(NEC)、原始神經(jīng)外胚層腫瘤(PNET)共20例為對照組，進行回顧性研究；通過免疫組織化學(IHC)方法檢測SALL4、OCT4、C-kit在SM中的表達，探討其在病理診斷中的作用和意義，并結合臨床資料加以分析、總結，以期提高對SM的認識和診治水平。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年1月～2013年12月贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院經(jīng)外科手術切除、資料完整的SM患者68例，年齡19～65歲，中位年齡43.5歲；其中發(fā)生在睪丸55例，縱膈7例，腹膜后5例，骶尾部1例；臨床分期ⅠA期47例，ⅠB期間11例；ⅡA期6 例，ⅡB期2例；ⅢA期2 例；所選病例中，經(jīng)典型SM 59例，間變型SM(ASM)6例，精母細胞型SM(SSM)3例。SM病理診斷依據(jù)Magi-Galluzzi C等《泌尿生殖病理學》結合WHO泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤分類標準[4]；選取同期發(fā)生在男性患者睪丸、縱膈、腹膜后等部位形態(tài)相似的圓細胞惡性腫瘤，包括DLBCL 8例、胸腺瘤5例、黑色素瘤2例、NEC 3例、PNET 2例，共計20例進行分組對照研究，對照組年齡26～72歲，中位年齡51歲。全部病例的選取均符合倫理道德規(guī)范，并經(jīng)研究對象知情同意。

1.2 病理學研究方法

1.2.1 SM臨床分期及IHC依據(jù) 68例SM臨床分期依據(jù)AJCC和UICC標準[5]；IHC方案參考國際泌尿病理學會(ISUP)推薦方案，結合臨床實踐制訂[6]。

1.2.2 研究方法 68例SM及20例NSM均常規(guī)規(guī)范取材，4%中性甲醛固定，系列乙醇脫水，石蠟包埋，4 μm切片，蘇木素-伊紅(H&E)染色，采用二步法增強型辣根酶聚合物(Polink-2HRP)非生物素染色系統(tǒng)對全部研究腫瘤組織進行IHC標記，以 PBS 代替一抗為陰性對照，陽性對照為羅氏商供；標記抗體為：SALL4、OCT4、C-kit及相關腫瘤組合抗體。

1.2.3 IHC評價 由2名以上高年資病理醫(yī)生采用雙盲法，依據(jù)國際標準化評價[7],經(jīng)光學顯微鏡觀察共同完成；SALL4和OCT4為核陽性，C-kit(CD117)為膜陽性；以染色強度和染色范圍進行綜合評分；隨機選取10個視野，計數(shù)200個細胞，以10%～25%為(+)，25%～50%為(++)，>50%(+++)。以棕黃色為(+)，淡黃為弱(+)，不著色為(-)。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 病理特征 68例SM最大直徑18.5 cm，最小直徑1.5 cm;腫瘤切面灰白灰黃色，質地實，部分有出血及壞死，11例有不完整包膜；腫瘤細胞大小較一致，呈圓形或多邊形彌漫分布；部分細胞的胞膜較為清楚，胞質呈透明或淡染狀；胞核居中，呈橢圓形或圓形，染色質顆粒略粗，多均勻分布，腫瘤細胞可見明顯核仁；部分腫瘤細胞呈巢狀分布，巢間存在少量的間質，含有較多淋巴細胞浸潤，富于血管(見圖1)。對照組NSM與研究組SM光鏡下形態(tài)具有一定的相似性，鑒別診斷有一定難度。

2.2 ICH表達 研究組68例中，SALL4陽性68例(100%),定位于胞核(見圖2)；OCT4陽性62例(91.2%)，定位于胞核(見圖3)；C-kit陽性65例(95.5%)，定位于胞質和胞膜(見圖4)；SALL4+C-kit及SALL4+OCT4陽性均為68例(100%)。其中經(jīng)典型SM表達陽性率最高，MSM表達較弱。對照組20例NSM中，SALL4陽性7例(35%)，OCT4陽性(20%)，C-kit陽性5例(25%)， 2種抗體共同表達3例(15%)；其中DLBCL表達相對較好，其它如低分化NET、PNET、胸腺瘤、惡性黑色素瘤其表達更低(見表1)。經(jīng)對照分析，SALL4的IHC表達與OCT4、C-kit有一定的協(xié)同性，與腫瘤類型有明確的相關性。經(jīng)兩兩對照分析，SALL4、OCT4、C-kit協(xié)同作用在研究組和對照組織中的表達有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 精原細胞，瘤瘤細胞呈圓形、多邊形巢狀分布，胞質淡染，核居中，見明顯核仁；間質見淋巴細胞浸潤(H&E，×200)。

圖2 SALL4在SM中的表達，核陽性(Polink-2HRP，×200)

圖3 OCT4在SM中的表達，核陽性(Polink-2HRP，×200)

圖4 C-kit在SM中的表達，膜陽性(Polink-2HRP，×200)

表1 SALL4、OCT4及C-kit在精原細胞瘤和非精原細胞瘤中的表達/n(%)

Tab 1 Expression of SALL4, OCT4, C-kit in Seminoma and Nonseminoma

組別腫瘤類型例數(shù)SALL4OCT4C?kitSM59595859研究組ASM6634SSM3312合計6868(100)62(91．2)65(95．5)DLBCL8532Thymoma51-1對照組NEC3-1-PNET21-1Melanoma2--1合計207(35)4(20)5(25)

注：SM：精原細胞瘤，ASM：間變型精原細胞瘤，SSM：精母細胞瘤，DLBCL：彌漫性大B細胞性淋巴瘤，Thymoma：胸腺瘤，NEC：神經(jīng)內(nèi)分泌癌，PNET：原始神經(jīng)外胚層腫瘤，Melanoma：黑色素瘤。

3 討 論

SM是男性最常見的生殖細胞腫瘤，占所有生殖細胞腫瘤的27%～56%，多發(fā)生在35～45歲的青中年男性，中位年齡40歲[8]。早期臨床癥狀不明顯，影像學檢查常常有占位性病灶， 但確診主要依靠病理形態(tài)及IHC標記。治療以手術切除為主，配合放療及化療。預后與年齡、 腫瘤周圍侵犯及有無遠處轉移等相關。Ⅰ期SM預后良好，對化療有很高的敏感性，手術加化療即可能完全治愈，為避免長期放射治療因輻射而引起第二腫瘤的風險，故準確診斷SM并分期對臨床治療具有十分重要的意義[9]。

典型的SM外觀呈結節(jié)狀，有分葉，大小不等，切面灰白色，質軟，較均勻；部分腫瘤伴有壞死；質地均勻，可有不完整包膜；光鏡下，腫瘤細胞呈圓形、多邊形，邊界較清，胞質透亮，可見明顯的核仁；腫瘤被纖細的纖維組織分隔成條索狀、梁狀、巢片狀、管狀、篩狀結構。在HE染色光學顯微鏡下，SM形態(tài)特征與其它圓細胞腫瘤有一定的重疊，準確的臨床病理診斷難度較大，容易發(fā)生誤診。常需要IHC抗體標記以輔助診斷和鑒別診斷；傳統(tǒng)IHC抗體主要以PLAP、CK、EMA、CD117等為主，其特異性和敏感性均受客觀因素影響，在臨床使用中效果不夠理想；新發(fā)現(xiàn)的抗體單一使用,亦容易發(fā)生偏差，產(chǎn)生誤診和漏診;為更好的解決臨床病理診斷中的疑難問題和困惑，課題組參考國際泌尿病理學會(ISUP)推薦方案，結合臨床實踐，選取SALL4、OCT4、C-kit的組合抗體，制訂IHC方案付諸臨床及研究。

SALL4是果蠅婆羅雙樹基因(Drosophila spalt)的同源基因, 屬于C2H2型鋅指轉錄因子，定位于細胞核內(nèi),是近來腫瘤病理診斷和治療研究中的熱點，負責調(diào)節(jié)胚胎干細胞的多向發(fā)育潛能和自我更新,是許多腫瘤演進中的關鍵基因，在生殖細胞腫瘤中呈現(xiàn)高度敏感性和特異性,被證實是一種實用性很高的診斷型標志物[10]。同樣有研究證實SALL4在肝癌、膽管癌、腎母細胞瘤、胃癌、肺癌、淋巴瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤的上皮成分中均有不同程度的陽性表達，有望成為新的癌細胞靶向基因[11]。干細胞轉錄因子OCT4在維持干細胞多功能性和自我更新中起著重要的作用，有研究證實其與SALL4具有很好的協(xié)同作用[12]；在臨床SM的基因診斷中 ,OCT4可以逐步取代 PLAP 的地位[13]。原癌基因C-kit是造血干細胞的標志物，其表達異?？纱碳つ[瘤細胞的持續(xù)增殖和抗凋亡信號的失控， 有利于腫瘤的惡性增殖；是診斷SM的經(jīng)典IHC抗體之一,但許多腫瘤中均有不同程度的表達[14-15]。

本研究通過IHC的方法，聯(lián)合檢測SALL4、OCT4、C-kit 在SM及NSM中的表達，彌補了單一抗體在特異性和敏感性方面的不足,結果顯示研究組68例SM中，SALL4陽性100%,OCT4陽性92.6%，C-kit陽性95.5%；SALL4+C-kit及SALL4+OCT4陽性均為100%；其中經(jīng)典型SM表達陽性率最高，精母細胞型SM表達不足。對照組20例NSM中，SALL4陽性35%，OCT4陽性20%，C-kit陽性25%， 2種抗體共同表達15%；其中DLBCL表達相對較好，其它如低分化NET、PNET、胸腺瘤、惡性黑色素瘤其表達更低；證實SM中這三種基因的表達明顯高于NSM組織 (P<0.05)，并且SALL4、OCT4、C-kit三者與SM的發(fā)生相關，其間可能存在著協(xié)同關系；經(jīng)對照分析，SALL4、OCT4、C-kit的表達與腫瘤類型有明確的相關性；但是,由于研究群體的樣本較小，尚有許多缺陷存在，相信隨著研究的深入，應該會有更多的發(fā)現(xiàn)。

SM是一種多基因共同作用的惡性腫瘤，其形態(tài)學與多種圓細胞惡性腫瘤有重疊，臨床IHC中選擇的抗體由于其特異性、敏感性的問題，均有不同程度的缺陷，在病理診斷中若選用單一抗體有可能導致誤判。SALL4在多種腫瘤中都有表達，在生殖細胞腫瘤中具有很高的敏感性，而其特異性有一定的局限性，本研究采用SALL4、OCT4、C-kit協(xié)同方案，可對SM做出準確的病理診斷；其研究方案具有一定的創(chuàng)新性思路，有其內(nèi)在的實用價值。

總之，病理醫(yī)師對于SM的診療起著重要的作用，使用IHC的方法，合理選用SALL4、OCT3/4、C-kit的抗體組合，協(xié)同使用，通過準確的病理診斷，正確的腫瘤分類，提供恰當?shù)牟±矸制谝约邦A后參數(shù)，可以為臨床積極治療和監(jiān)測予以有效的支持，盡早發(fā)現(xiàn)并綜合治療以提高患者生存質量和生存率。

[1] Magi-Galluzzi C, Przybycin CG.Genitourinary Pathology[M].New York:Springer, 2015: 447-461.

[2] 那彥群，葉章群，孫穎浩，等. 中國泌尿外科疾病診斷治療指南手冊(2014版)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：90-105.

[3] Andeen N K, Tretiakova M S. Metastatic Treated Malignant Germ Cell Tumors: Is SALL4 a Better Marker Than Placental Alkaline Phosphatase?[J]. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology Aimm, 2016，24(3):210-214.

[4] Elbe JN, Sauter G, Epstein JI,et al. Pathology and genetics of tumours of the urinary system and male genital organs[M]. Lyon: IARC Press，2004：245-280.

[5] Edge SB，Byrd DR，Compton CC，et a1．AJCC cancer staging manual[M]．7th ed．New York：Springer，2010:469-478.

[6] Ulbright TM, Tickoo SK, Berney DM, et al. Best practices recommendations in the application of immunohistochemistry in testicular tumors: report from the International Society of Urological Pathology consensus conference[J].American Journal of Surgical Pathology, 2014, 38(8):50-59.

[7] Lin F, Shi J. Standardization of Diagnostic Immunohistochemistry[M].New York：Springer, 2015:17-30.

[8] Baithun S I, Lee A. Pathology of Testicular Tumors[M].London：Springer，2015:451-461.

[9] Horwich A, Fossa SD, Huddart R, et al. Second cancer risk and mortality in men treated with radiotherapy for stage I seminoma[J].British Journal of Cancer, 2014, 110(1):256-263.

[10] Markku M, Zengfeng W, Mccue P A, et al. SALL4 expression in germ cell and non germ cell tumors: a systematic immunohistochemical study of 3215 cases[J].American Journal of Surgical Pathology,2014,38(3):410-20.

[11] Xu Z, Xiao Y, Wei Z, et al. SALL4: An emerging cancer biomarker and target[J].Cancer Letters, 2015, 357(1):55-62.

[12] Lopez Beltran A, Menendez C L, Montironi R, et al. Rare Tumors and Tumor like Conditions in Urological Pathology[J].Anticancer Research, 2015,35(5):311-371.

[13] 李晶晶, 李巍, 李國利. Oct4、PLAP基因在睪丸精原細胞瘤早期診斷中的意義[J].實用臨床醫(yī)藥雜志, 2013, 17(1):10-12.

[14] 許春偉, 韓鴻雁, 王晶晶,等. CD117、PDGFRA蛋白單獨及聯(lián)合DOG1檢測在胃腸道間質瘤中的診斷價值[J].臨床與病理雜志, 2015,35(2):252-257.

[15] 段愛紅，孫志強，吳小華，等. CD117、 Nestin、 CD133 和 Ki67 在卵巢上皮性癌組織中的表達及意義[J].河北醫(yī)藥， 2014，36(20)：3045-3048.

Expression of SALL4, OCT4 and C-kit in the Seminoma

HEJue,DENGXiao,ZHANGWen-shu,WANGZhen-ling

(Dept.ofPathology,GannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangx341000)

Objective: To observe the expression of SALL4, OCT4 and C-kit in the seminoma, and to explore its significance in the diagnosis of the tumor. Methods: Postoperative samples of 68 seminoma and 20 non-seminoma with similar Pathologic morphology were selected. The expression of SALL4, OCT4 and C-kit were detected by routine pathological technique and immunohistochemical Polink-2HRP staining system. To observe and analyze the relationship between the clinical features and pathological characteristics. The relationship between the expressions and the clinical pathological morphological features was observed and analyzed. Results: The expression rates of SALL4, OCT4 and C-kit in 68 cases seminomas were 100% (68/68), 91.2% (62/68) and 95.5% (65/68), respectively. the expression rates in 20 cases of non-seminomas were 35% (7/20), 20% (4/20), 25% (5/20), respectively; The expression of SALL4, OCT4 and C-kit in the seminomas was significantly higher than that in the non-seminomas. The difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion: The expression of SALL4 in the seminoma is highly sensitive. It is of great value in the pathological diagnosis if it is used with OCT4 and C-kit.

seminoma; SALL4;OCT4;C-kit;immunohistochemistry

江西省教育廳科學技術研究項目(GJJ14690)

R737

A

1001-5779(2016)06-0876-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.06.011

2016-08-18)(責任編輯：劉仰斌)