HPLC法檢測不同提取方法對臍橙果皮中橙皮甙含量的影響*

張 娟,黃志強(qiáng),周鵬輝

(贛南醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系,江西 贛州 341000)

HPLC法檢測不同提取方法對臍橙果皮中橙皮甙含量的影響*

張 娟,黃志強(qiáng),周鵬輝

(贛南醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系,江西 贛州 341000)

目的：檢測不同提取方法對橙皮甙含量的影響。方法：分別采用冷凝回流法和堿式提取法提取贛南臍橙果皮橙皮甙，采用高效液相色譜法對橙皮甙含量進(jìn)行測定。采用ZORBAX C18柱，流動相為V(甲醇)∶V(0.5 %乙酸)=32∶68，流速0.4 mL·min-1，檢測波長283 nm，采用外標(biāo)定量法進(jìn)行測定。結(jié)果：橙皮甙在濃度為10～30 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R=0.993 4。冷凝回流法提取橙皮甙含量為4.18%，堿式提取法為1.18%。結(jié)論：冷凝回流含量高且純度好。

高效液相色譜；橙皮甙；冷凝回流；堿式提取

橙皮甙(Hesperidin)又名橙皮苷(Hesperidion)、柑果甙( Citrus)，是由一分子橙皮素與一分子的芳香二糖縮水結(jié)合而成，其結(jié)構(gòu)式為:C28H34O15。橙皮甙是一種淺黃色的結(jié)晶粉末，幾乎無臭無味，熔點(diǎn)260 ℃，能溶于稀堿和吡啶及70 ℃以上的熱水，微溶于甲醇，幾乎不溶于丙酮、醚、苯和氯仿[1]，分子量為610.5 。橙皮甙屬于雙氫黃酮類化合物，存在于柑橘類和中草藥(如陳皮、枳實(shí)等)中，是維生素P的主要成分，能保持微血管壁正常的滲透性，對心血管疾病有顯著療效。橙皮甙經(jīng)甲基化后，可配制成

多種防動脈粥樣硬化和心肌梗塞的藥物[2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3-6]：橙皮甙具有降低人體內(nèi)膽固醇、抗氧化、防霉、降血壓、抗病毒、抗肝炎、抗腫瘤、抗癌等功效。橙皮甙還是制備雙氫黃酮類、黃酮類和二氫查耳酮類藥物、天然抗氧化劑和食品添加劑(如低能甜味劑)的基本原料。因此，對橙皮甙的提取及其含量的測定研究是一個研究熱點(diǎn)。本文采用高效液相色譜法對贛南臍橙中橙皮甙的含量進(jìn)行測定。該方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確、可靠等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑 Agilent 1260 高效液相色譜儀； KQ-100DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；蒸餾裝置；超純水(艾柯科學(xué)儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)。

甲醇(色譜純，美國Tedia公司)；橙皮甙對照品(≥98%，天津一方科技有限公司)；無水乙醇(分析純)；濃鹽酸(分析純)；氫氧化鈉(分析純)；濃鹽酸(分析純)；氫氧化鈣(分析純)。

橙皮甙標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取0.001 25 g橙皮甙標(biāo)準(zhǔn)品，溶于少量的甲醇，轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，用甲醇定容，濃度為0.125 g·L-1。

臍橙產(chǎn)于贛南地區(qū)。

1.2 色譜條件 色譜柱：C18柱(ZORBAX，1.8 μm，50 mm×4.6 mm， Agilent);流動相∶V(甲醇)∶V(0.5 %乙酸)=32∶68；檢測波長：283 nm；柱溫：25 ℃；流速：0.4 mL·min-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 用超純水清洗橙皮，將清洗后的橙皮置于干燥箱中于38 ℃干燥24 h，將烘干后的橙皮用小型粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，制成粉末狀。

冷凝回流法：稱取樣品2.000 g，加入石油醚150 mL，80 ℃水浴回流2.5 h(脫脂)，棄去石油醚。樣品待石油醚揮發(fā)干后加入甲醇160 mL提取，80 ℃水浴回流3 h，放置冷卻，過濾。濾液置于250 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。

堿式提取法：用精密天平準(zhǔn)確稱取7.000 g,用70 mL蒸餾水浸泡，用玻璃板不斷攪拌30～45 min使之充分吸水軟化；量取55 mL飽和澄清石灰水于25 ℃浸入樣品中，玻棒攪拌30 min后，用5 mol·L-1NaOH將pH調(diào)至pH 13.0，用紗布先過濾，過濾后的濾液再進(jìn)行減壓抽濾，除去橙皮渣,濾液用1 mol·L-1HCl中和調(diào)至pH 4.5，待有沉淀物生成，靜置過濾，得粗橙皮甙。將10 mL 1%NaOH和90 mL 50%無水乙醇攪拌混合，再將粗橙皮甙加入，繼續(xù)攪拌1 h使粗橙皮甙溶解完全，然后過濾至濾液澄清，用1 mol·L-1HCl中和調(diào)至pH 5.0，靜置過夜，過濾，濾餅用50%無水乙醇洗滌一次，再用水洗至接近中性，得精制橙皮甙。將提取的橙皮甙樣品，用0.45 μm有機(jī)系濾膜過濾后置于1.5 mL試劑瓶中待測。

1.3.2 測定方法 樣品經(jīng)濾膜過濾，取1 mL裝入樣品瓶中，放入HPLC儀中進(jìn)行測定。以出峰時間定性，以峰面積定量(外標(biāo)法)。

1.3.3 橙皮甙標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 分別準(zhǔn)確量取0.125 g·L-1橙皮甙標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成濃度為10、15、20、25、30 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 結(jié) 果

2.1 色譜條件的選擇 余曉等[7]采用C18柱(5 μm 200 mm×4.6 mm)，乙腈-0.4%磷酸溶液(體積比為20∶80)為流動相對遵義產(chǎn)金桔與臍橙果皮中橙皮甙含量進(jìn)行了測定；李秀玲等[8]測定枳實(shí)和枳殼中的橙皮甙含量時，色譜柱為Hypersil ODS1柱(250 mm×4.6 mm),選用了乙腈-0.5%乙酸溶液(體積比為22∶78)為流動相；董朝青等[9]采用C18柱(5 μm 200 mm×4.6 mm)，流動相為甲醇和0.5%乙酸(體積比為32∶68)。本實(shí)驗(yàn)高效液相色譜法在色譜條件的選擇上，首次選用ZORBAX C18柱(50 mm×4.6 mm ，1.8 μm)，甲醇和0.5%乙酸(體積比為32∶68)作為流動相對橙皮甙進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)此C18柱亦能有效地將橙皮甙進(jìn)行分離，結(jié)果穩(wěn)定可靠。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1，橙皮甙標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間為4.05 min。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 選高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣1 μL，連續(xù)5次，測定峰面積，峰面積RSD為4.27%，表明儀器精密度良好，見表1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在選擇的色譜條件下，將配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣分析。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，橙皮甙的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：Y=21.708X-32.065，R2=0.998 5。由此可知橙皮甙在質(zhì)量濃度為10～30 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4 樣品測定 余曉等[7]采用醇類提取法，經(jīng)HPLC法測定，測得遵義產(chǎn)金桔果皮中橙皮甙含量為4.60%，遵義產(chǎn)臍橙果皮中橙皮甙含量為5.25%；趙虹橋等[10]采用微波輔助法從檻柑果皮中提取橙皮苷，經(jīng)紫外分光光度法測得橙皮苷得率為2.02%。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法依上述色譜條件，取樣品液1 μL進(jìn)樣，測定峰高，依標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，可求出橙皮甙的含量分別為4.18%、1.18%,冷凝回流方法效果更佳。樣品色譜圖見圖2、圖3。

圖2 冷凝回流提取橙皮甙色譜

圖3 堿式提取橙皮甙色譜圖

2.5 回收率試驗(yàn) 將橙皮甙標(biāo)準(zhǔn)品按照相同的方法進(jìn)行處理，按色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次。兩種不同提取方法測得平均回收率分別為98.10%、94.30%，RSD 2.19%、1.51%，結(jié)果見表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

3 討 論

HPLC法是利用高效液相色譜儀，選擇適宜的色譜柱和流動相使橙皮甙和其它成分分離，以紫外檢測器得到峰面積，由峰面積計(jì)算橙皮甙的含量的方法，具有應(yīng)用范圍廣，穩(wěn)定性好和靈敏度高，重復(fù)性高，高效相色譜柱可反復(fù)使用，自動化操作，定量精度高，測量準(zhǔn)確等特點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)首次采用ZORBAX C18柱(50 mm×4.6 mm，1.8 μm)，甲醇和0.5%乙酸(32∶68)作為流動相，用高效液相色譜法對贛南臍橙皮中的橙皮甙的含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)此C18柱亦能有效地將橙皮甙進(jìn)行分離，結(jié)果穩(wěn)定可靠，檢測的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復(fù)性好。

本實(shí)驗(yàn)分別采取冷凝回流法和堿式提取法對樣品中橙皮甙進(jìn)行提取，結(jié)果表明冷凝回流法提取率高于堿式提取法，從液相色譜圖上可發(fā)現(xiàn)堿式提取的橙皮甙雜峰較多，說明樣品中含有較多干擾物質(zhì)，長期使用對儀器有損壞。因此，今后實(shí)驗(yàn)中可以用有機(jī)溶劑橙皮中橙皮甙進(jìn)行提取，效果更佳。

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[7] 余曉,錢民章.HPLC法測定遵義產(chǎn)兩種柑橘果皮中橙皮甙含量[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,28(2):175-177.

[8] 李秀玲,李龍,肖紅斌,等.反相高效液相色譜法測定枳實(shí)、枳殼中橙皮甙和柚皮甙的含量[J].色譜,2002,20(6):585-586.

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[10] 趙虹橋,文赤夫.湘西椏柑果皮中橙皮苷的提取與純化[J].現(xiàn)代食品科技,2008,24(8)：812-815．

Effect of Different Extraction Methods on Hesperidin Content in Navel Orange Peel by HPLC Detection

ZHANGJuan,HUANGZhi-qiang,ZHOUPeng-hui

(Dept.ofPreventiveMedicine,GannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Objective: To test the effect of different extraction methods on the content of hesperidin. Method: High performance liquid chromatography was used for the determination of the content of hesperidin in Gannan navel orange peel which was respectively extracted by condensation reflux and alkali extraction. Chromatographic separation was performed by using C18 column with methanol and 0.5% acetic acid(V/V,32∶68) as mobile phase at a flow rate of 0.4 mL·min-1. The UV detection wavelength was fixed at 283 nm.External calibration method was used in this experiment. Result: The linearity was obtained over the range of 10～30 mg·L-1(R=0.993 4). The content of hesperidin extracted with reflux method was 4.18 %, and was only 1.18 % with alkali extraction method . Conclusion: The content of hesperidin is higher and purer by the method of condensation reflux than alkali extraction.

high performance liquid chromatography(HPLC); hesperidin；condensation reflux; alkali extraction

江西省教育廳科技項(xiàng)目(NO:GJJ14698)

R285.5

A

1001-5779(2016)06-0861-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.06.007

2016-04-07)(責(zé)任編輯：敖慧斌)