小檗堿對高脂飲食前列腺癌小鼠紅細胞免疫功能研究*

冷松柏,黃 明,鐘 毅,田原僮

( 贛南醫(yī)學(xué)院 1.2014級碩士研究生；2.第三附屬醫(yī)院泌尿外科；3.藥理學(xué)教研室,江西 贛州 341000)

小檗堿對高脂飲食前列腺癌小鼠紅細胞免疫功能研究*

冷松柏1,黃 明2,鐘 毅2,田原僮3

( 贛南醫(yī)學(xué)院 1.2014級碩士研究生；2.第三附屬醫(yī)院泌尿外科；3.藥理學(xué)教研室,江西 贛州 341000)

目的:探討小檗堿(BBR)對高脂飲食前列腺癌小鼠血脂、紅細胞脆性及紅細胞免疫功能的影響。方法:將36只皮下已接種好的前列腺癌小鼠隨機分成3組：正常飲食組(A組)、高脂飲食組(B組)、BBR +高脂飲食組(C組 )。30天后測定血脂、紅細胞脆性(EOF)及紅細胞C3b受體花環(huán)率(E-C3bRR)及紅細胞免疫復(fù)合物花環(huán)率(E-ICRR)變化水平。結(jié)果:B組的紅細胞滲透脆性(EOF)高于A組，C組的紅細胞滲透脆性(EOF)高于A組低于B組(P<0.05)；B組E-C3bRR明顯低于A組，E-ICRR高于A組(P<0.05)； C組E-C3bRR明顯高于B組，E-ICRR低于B組(P<0.05)。結(jié)論:高脂飲食可以降低前列腺癌模型小鼠紅細胞免疫功能；BBR直接可以調(diào)節(jié)前列腺癌小鼠紅細胞免疫功能以及通過降低前列腺癌小鼠血脂后間接調(diào)節(jié)紅細胞免疫功能。

小檗堿；高脂飲食；前列腺癌；紅細胞免疫

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是世界性的難題，嚴重危害男性健康[1]。發(fā)現(xiàn)時，30%～50%的患者已有轉(zhuǎn)移，不適合手術(shù)治療。轉(zhuǎn)移患者中約35%經(jīng)血源播散，約70%死于骨轉(zhuǎn)移[2]。生物免疫治療可以幫助患者提高自身的免疫，是一種有可能治愈前列腺癌的方法。BBR為黃連等傳統(tǒng)中藥的主要活性物質(zhì)，可作為生物免疫治療抑制劑，對前列腺癌抑制作用，但未探清對前列腺癌紅細胞免疫機制[3-4]。本研究旨在明確小檗堿是否通過調(diào)節(jié)血脂及紅細胞免疫，增加紅細胞免疫功能從而抑制前列腺癌的發(fā)展、擴散和轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細胞系 35～42天的雄性C57BL6/J小鼠36只，體重20～26 g，購自廣東省實驗動物中心(編號：18970786408)，常規(guī)飼養(yǎng)；高脂飼料：購自廣東省實驗動物中心；RM-1細胞系：由吉林大學(xué)動物實驗中心提供。

1.1.2 藥物、高脂飼料及試劑 小檗堿(北京盛世康普化工技術(shù)研究所):規(guī)格1 g，先用DMSO溶解后使用注射用水配制，根據(jù)給藥劑量和給藥體積配制成相應(yīng)溶度； RPMI-1640型號培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司)；小牛血清及胰酶(美國giobco公司)。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；潔凈臺(蘇凈集團蘇州康科技發(fā)展有限公司)；倒置顯微鏡(Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1 前列腺癌小鼠模型建立、分組及給藥 35～42天的雄性C57BL6/J小鼠，在無菌條件下于小鼠背部皮下注射本實驗培養(yǎng)的前列腺癌細胞(RM-1)，取對數(shù)生長期RM-1細胞，用0.25%胰酶消化，0.01 M PBS洗滌，調(diào)細胞濃度至2×107·mL-1，取0.1 mL接種于小鼠肩背部皮下組織。小鼠接種RM-1細胞后第15 d，按瘤體將36只小鼠隨機分成正常飲食組(A)、高脂飲食組(B)、BBR +高脂飲食組(C)，分別給予正常飲食、高脂飲食和高脂飲食+ BBR(7.5 mg·kg-1·d-1)腹腔注射30天，A組及C組給予BBR等量生理鹽水腹腔注射30天。

1.2.2 觀察指標(biāo)及檢測方法 (1)利用全自動生化分析儀檢測血液血清中血脂情況。(2)紅細胞滲透脆性(EOF)：按表1制備9種不同濃度的低滲NaCl溶液，順序編號為1～9，以0.9%NaCl溶液為陰性對照，編號為10，以1.9%尿素溶液和雙蒸水(DH20)為陽性對照，分別編號為11和12。取肝素抗凝血，分別加入對應(yīng)編號試管中，判斷標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)試管內(nèi)液體全部變成透明紅色，證明紅細胞完全破裂溶血，引起紅細胞最快出現(xiàn)完全溶血的氯化鈉溶液濃度為紅細胞對氯化鈉溶液的最大抵抗力即最小滲透脆性。試管下層為混濁紅色，管底有部分沉淀，而上層開始出現(xiàn)透明紅色，表示部分紅細胞破裂溶血，當(dāng)開始出現(xiàn)部分溶血時的氯化鈉濃度為紅細胞對氯化鈉溶液的最小抵抗力即最大滲透脆性。當(dāng)試管下層若為混濁紅色，管底有大部分紅細胞成點，上層無色或者是極淡的紅色，這說明紅細胞沒有溶解。小鼠紅細胞脆性參考范圍：開始溶血為0.42%～0.46% NaCl溶液；完全溶血為0.28%～0.34% NaCl溶液。(3)采用Jiang J法測定E-C3bRR及E-ICRR變化水平，按常規(guī)計數(shù)100個紅細胞，單個紅細胞黏附2個或是以上酵母菌為1朵花環(huán)，算出各自花環(huán)率(E-C3bRR和E-ICRR)[5]。

表1 不同濃度的NaCl溶液配制

2 結(jié) 果

2.1 高脂飲食對前列腺癌模型小鼠血脂的結(jié)果 各組小鼠膽固醇(CHO)、甘油三脂(TC)的組間比較均有統(tǒng)計意義(F值分別為8.52、5.31，P值均<0.05)。B組小鼠膽固醇(CHO)、甘油三脂(TC)較A組均明顯升高(q值分別為-9.53、-7.28，P值均<0.05)，提示高脂血癥前列腺癌模型小鼠成功構(gòu)建；C組小鼠膽固醇(CHO)、甘油三脂(TC)指標(biāo)較B組低(q值分別為4.48、4.73，P值均<0.05)，說明BBR可降低前列腺癌小鼠血脂，調(diào)節(jié)血脂作用(見表2,表3)。

表2 高脂飲食對前列腺癌小鼠血脂的影響±s

注： A表示正常飲食組， B組表示高脂飲食組，C組表示BBR +高脂飲食組。

表3 高脂飲食對前列腺癌小鼠血脂指標(biāo)多個均數(shù)兩兩比較的q值及P值

對比組數(shù)CHOq值 P值TGq值 P值A(chǔ)，B-9．53<0．05-7．28<0．05A，C-16．50<0．05-0．38>0．05B，C4．48<0．054．73<0．05

注： A表示正常飲食組， B組表示高脂飲食組，C組表示BBR +高脂飲食組。

2.2 小鼠紅細胞滲透脆性結(jié)果 各組小鼠EOF組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義(F值為9.58，P值<0.05)。A組完全溶血范圍為(0.35±0.01)%，B組紅細胞完全溶血范圍為(0.43±0.02)%，C組紅細胞完全溶血范圍為(0.40±0.02)%)，B組EOF高于A組，低于C組(q值分別為-11.57、5.29，P值均<0.05)。見表4、表5。

2.3 前列腺癌模型小鼠紅細胞受體花環(huán)及免疫復(fù)合物花環(huán)的結(jié)果 各組小鼠E-C3bRR和E-ICRR組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為5.47，5.62，P值均<0.05)，B組E-C3bRR明顯低于A組(q=10.21，P<0.05)，E-ICRR高于A組(q=-14.15，P<0.05)； C組E-C3bRR明顯高于B組(q=-5.14，P<0.05)，E-ICRR低于B組(q=5.63，P<0.05)?？梢姼咧嬍晨梢越档颓傲邢侔┬∈蠹t細胞免疫功能；而BBR可調(diào)節(jié)前列腺癌小鼠血脂和紅細胞免疫功能。見表4、表5。

表4 各組之間EOF(%)、E-C3bRR(%)與E-ICRR(%)差異情況

注： A表示正常飲食組， B組表示高脂飲食組，C組表示BBR +高脂飲食組。

表5 BBR對高脂飲食對前列腺癌小鼠各指標(biāo)均數(shù)兩兩比較的q值及P值

注： A表示正常飲食組， B組表示高脂飲食組，C組表示BBR +高脂飲食組。

3 討 論

從表2研究結(jié)果顯示，與B組相比，給藥組膽固醇(CHO)、甘油三脂(TC)值明顯下降，說明BBR有降血脂作用，而血脂增高可引起紅細胞免疫功能下降。在膜組成成分中發(fā)現(xiàn)，紅細胞膜的成分改變等可以影響紅細胞C3bR活性以及紅細胞膜表面的抗原性。膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整性對膜上C3bR的功能有極其重要作用。高血脂對紅細胞免疫方面的影響主要有以下幾點：①血中脂蛋白含量明顯增加，刺激產(chǎn)生某些抗體，形成大量的循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)，粘附在紅細胞膜表面，消耗了C3bR位置，使其受體空位數(shù)目減少，活性明顯降低，導(dǎo)致紅細胞C3b受體花環(huán)率(E-C3bR)下降[6-7]。②隨著各種脂蛋白的增加，在紅細胞膜、組織液以及血漿之間將發(fā)生脂質(zhì)交換作用，影響紅細胞膜上脂質(zhì)成分，紅細胞膜表面的抗原性發(fā)生改變，使紅細胞與C3b黏附功能發(fā)生障礙，細胞釋放及降解免疫復(fù)合物的功能減弱，導(dǎo)致C3bR空位減少。③紅細胞膜組成成份中膽固朜/磷脂比增高，使膜成分變化，引起膜功能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致紅細胞免疫功能下降。

紅細胞滲透脆性(EOF)是一項敏感的特異性指標(biāo)，在不同的病理下很容易發(fā)生改變[8]。EOF可以用來衡量紅細胞抵抗性和完整性[9]。通過設(shè)置不同溶度梯度的氯化鈉來檢測紅細胞的滲透脆性。研究結(jié)果顯示，我們發(fā)現(xiàn)高脂飲食組與正常飲食組比較EOF明顯增加(P<0.05)，小檗堿+高脂飲食組與高脂飲食組比較EOF明顯減小(P<0.05)。EOF可以被用于抗氧化應(yīng)激和對抗防止氧自由基損傷的指標(biāo)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，增加紅細胞丙二醛的溶度，最終導(dǎo)致大量水進入細胞引起細胞破裂[9]。我們猜測高脂飲食組EOF增加很可能和紅細胞膜上氧化損傷有關(guān)。

紅細胞是機體重要的免疫細胞，占全血容積50%，其免疫功能主要通過紅細胞膜上補體受體1型獲得，可以結(jié)合循環(huán)免疫復(fù)合物、病毒、細菌和腫瘤細胞，防止其擴散到其它敏感組織[4]。紅細胞C3b受體(E-C3bRR)花環(huán)及紅細胞免疫復(fù)合物(E-ICRR)花環(huán)試驗是判斷紅細胞免疫粘附功能的重要指標(biāo)[10]。如二項指標(biāo)都低下，判為原發(fā)性紅細胞免疫功能低下，為紅細胞膜C3b受體受到破環(huán)和影響所致[11]。如果RBC-C3b受體花環(huán)率降低，而E-ICRR花環(huán)率增高，為繼發(fā)性紅細胞免疫功能低下[11]。本組表4研究結(jié)果顯示，與正常飲食組相比，高脂飲食可以導(dǎo)致E-C3bRR花環(huán)率降低及E-ICRR花環(huán)率升高，小檗堿升高高脂飲食前列腺癌小鼠E-C3bRR花環(huán)率及降低E-ICRR花環(huán)率。提示高脂飲食可以繼發(fā)性降低小鼠紅細胞免疫功能，小檗堿可以改善紅細胞免疫功能。

本研究發(fā)現(xiàn)：模型組在PCa小鼠的發(fā)生和發(fā)展過程中存在紅細胞免疫功能異常，和Shatokhin M N等研究一致，這就證實PCa模型小鼠確實存在紅細胞免疫功能低下，就確認PCa模型小鼠容易發(fā)生血行擴散與紅細胞免疫功能低下有關(guān)[12]。此外，Albanes D研究表明前列腺癌伴高脂血癥患者更易經(jīng)血液等轉(zhuǎn)移[13]。這可能與高膽固醇狀態(tài)引起的紅細胞獲得性免疫下降有關(guān)[14]。雒守鳳等發(fā)現(xiàn)降血脂藥能夠改善血液的高粘滯狀態(tài)，其改善程度與腫瘤的臨床療效呈平行關(guān)系[15]。據(jù)此推測血液粘滯狀態(tài)與紅細胞免疫功能密切相關(guān)。

因此，高脂飲食可以降低前列腺癌模型小鼠紅細胞免疫功能；BBR本身可以調(diào)節(jié)前列腺癌小鼠紅細胞免疫功能以及通過降低前列腺癌小鼠血脂后間接調(diào)節(jié)紅細胞免疫功能。通過改善前列腺癌小鼠紅細胞免疫功能，從而抑制PCa轉(zhuǎn)移，延緩其進展。

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Effect of Berberine on Erythrocyte Immunity in Mice with High Fat Diet

LENGSong-bai1,HUANGMing2,ZHONGYi2,TIANYuan-tong3

(1.Master'sGraduateStudent,Grade2014;2.Dept.ofUrinarySurgery,theThirdAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity;3.Dept.ofPharmacology,GannanMedicalUniversity,GanZhou,Jiangxi341000)

Objective:To study the effect of berberine (BBR) on blood lipid and red cell immunity in mice with high fat diet. Methods:36 subcutaneous prostate cancer mice were randomly divided into 3 groups: normal diet group (group A), high fat diet group (group B), BBR + high fat diet group (group C). Serum lipids, erythrocyte fragility (EOF), erythrocyte C3breceptor rosette (E-C3bRR) and erythrocyte immune complex rosette (E-ICRR) levels were measured 30 days later. Results:EOF of group B was higher than group A; EOF of group C was higher than group A, but lower than group B(P<0.05); E-C3bRR of group B was lower than group A, but E-ICRR was higher than group A (P<0.05); E-C3bRR of group C was significantly higher than group B, but E-ICRR was lower than group B(P<0.05).Conclusion:High fat diet can reduce the erythrocyte immunity in mice with prostate cancer; BBR can directly regulate the erythrocyte immune and indirectly regulate the erythrocyte immunity by reducing blood lipids in mice with prostate cancer.

berberine; high fat diet; prostate cancer; erythrocyte immunity

江西省自然科學(xué)基金資助項目(20132BAB205008)

田原僮，女，博士，副教授。 E-mail: anntian@126.com

R285.5

A

1001-5779(2016)06-0850-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.06.004

2016-08-17)(責(zé)任編輯：敖慧斌)