牙周膜成纖維細(xì)胞多種培養(yǎng)法的研究

吳憂 張軍梅

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550004)

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牙周膜成纖維細(xì)胞多種培養(yǎng)法的研究

吳憂 張軍梅△

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的 提高人牙周膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)的成功率，提高組織塊貼壁率，縮短培養(yǎng)時(shí)間，加快細(xì)胞增殖。方法 以高血清結(jié)合改良組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代HPDLCs與傳統(tǒng)組織塊法及改良組織塊培養(yǎng)法作比較。通過(guò)免疫組化方法鑒定細(xì)胞的來(lái)源，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，對(duì)三種方式的培養(yǎng)成功率、組織塊貼壁率及細(xì)胞增殖速度進(jìn)行比較。結(jié)果 三種方法所培養(yǎng)的原代細(xì)胞生長(zhǎng)均趨于正常，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多角形，波形蛋白鑒定呈陽(yáng)性，角蛋白鑒定呈陰性，符合正常HPDLCs的正常形態(tài)及生物學(xué)特點(diǎn)。高血清結(jié)合改良組織塊培養(yǎng)法的成功率為86.67%，明顯高于其他兩種方法(P<0.01)。結(jié)論 高血清結(jié)合改良組織塊培養(yǎng)法明顯提高了HPDLCs原代培養(yǎng)的成功率，適合在臨床上運(yùn)用。

原代培養(yǎng)； 提高培養(yǎng)成功率； 人牙周膜成纖維細(xì)胞

牙周膜成纖維細(xì)胞是牙周結(jié)締組織中最為主要的一種間充質(zhì)細(xì)胞，不僅具有更新與自我修復(fù)的能力[1]，同時(shí)還能夠分泌牙周組織中的間充質(zhì)以及在口腔正畸過(guò)程中促進(jìn)成骨與破骨過(guò)程的各種酶、生長(zhǎng)因子等。離體培養(yǎng)的HPDLCs對(duì)研究牙周生物學(xué)、藥物學(xué)、正畸力學(xué)都具有重要意義, 為近年來(lái)正畸生物力學(xué)的研究進(jìn)展發(fā)揮了巨大作用[2]。 成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法主要可以分為組織塊法和酶消化法。酶消化法雖可縮短培養(yǎng)時(shí)間，但因?yàn)槠洳僮鞑襟E復(fù)雜，對(duì)細(xì)胞損傷大，所以很難掌握。組織塊法因培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，所得細(xì)胞量也相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)使用高血清培養(yǎng)基，結(jié)合改良組織塊培養(yǎng)法共同培養(yǎng)HPDLCs，并將這種方法與傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)法、改良組織塊培養(yǎng)法做比較。

1 器材與方法

1.1 主要試劑及器材 DMEM 低糖培養(yǎng)基(Gibco 公司，美國(guó))、胎牛血清(FBS，Hyclone 公司，美國(guó))、Ⅰ型膠原酶(Sigma 公司，美國(guó))、60 mm培養(yǎng)皿 、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、25 mm培養(yǎng)瓶(NEST公司)、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素(Hyclone公司，美國(guó))、兔抗人波形蛋白(北京中杉金橋公司)、鼠抗人角蛋白(北京中杉金橋公司)、生物安全柜(美國(guó)THORMO)、Heraus 28 RS 低溫高速 離心機(jī) (Heraus 公司，德國(guó))、Hereaus HERA 3180F CO2培養(yǎng) 箱 (Hereaus 公司， 德國(guó))、DMIRB 倒置相差顯微鏡 (Leica 公司，德國(guó))、細(xì)胞粒度分析及計(jì)數(shù)儀 (Beck-man Coulter 公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 HPDLCs的原代培養(yǎng) 我院門(mén)診部拔除的健康正畸前磨牙，患者年齡12～16歲。拔除后立刻放入預(yù)先預(yù)冷含100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基中，快速移至超凈臺(tái)中，將牙冠放入乙醇侵泡約1 min后，使用PBS液反復(fù)沖洗離體牙根面去除污物及冠方乙醇，并使用預(yù)先配置的含10%FBS及雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)基潤(rùn)濕根面，使用手術(shù)刀刮取根中1/3牙周膜放置于培養(yǎng)皿中，將刮取得到的牙周膜組織剪成約1 mm的小塊待使用。(1)HPDLCs傳統(tǒng)培養(yǎng)法：本法使用含15%FBS及 100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基對(duì)組織塊進(jìn)行培養(yǎng)。首先在60 mm的培養(yǎng)皿中加入1～2 mL完全培養(yǎng)基潤(rùn)濕皿底，進(jìn)而將預(yù)先預(yù)備好的組織塊平鋪于皿底，組織塊間的間隔約4 mm。將培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱中約4h后，再加入完全培養(yǎng)基4 mL繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液一次；(2)HPDLCs改良組織塊培養(yǎng)法：首先將預(yù)備好的組織塊放入15 mL的離心管中，隨后向離心管中加入2 mL 0.2%的Ⅰ型膠原酶，將離心管放入CO2培養(yǎng)箱中30 min，每5 min將離心管拿出搖晃使組織塊與酶均勻接觸，隨后離心機(jī)離心800 rpm/min,3 min，將沉淀物取出均勻平鋪于60 mm的培養(yǎng)皿中，加入1～2mL含15%及100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基，再放入CO2培養(yǎng)箱中約4 h后，再加入完全培養(yǎng)基4 mL繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液一次；(3)HPDLCs改良組織塊培養(yǎng)結(jié)合高血清培養(yǎng)法：本法使用含40%FBS及100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基對(duì)組織塊進(jìn)行培養(yǎng)。其培養(yǎng)方式與改良組織法相同。

1.2.2 HPDLCs的傳代 使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，待組織塊周圍的細(xì)胞到達(dá)融合狀態(tài)時(shí)，使用探針將組織塊勾除，并向皿中加入4 mL含EDTA(0.02%)的0.25%胰蛋白酶，37 ℃培養(yǎng)箱中消化4～5 min后加入雙倍的完全培養(yǎng)基終止消化(沿用原代培養(yǎng)時(shí)使用的血清濃度)，使用移液槍吹打皿底使細(xì)胞脫落后收集于15 mL的離心管中，離心機(jī)1 000 rmp/min，5 min，棄去上清液，再向離心管中加入5 mL完全培養(yǎng)基(除高血清法需使用含25%FBS的完全培養(yǎng)基外，其余兩種培養(yǎng)法均使用含10%FBS的完全培養(yǎng)基)，將細(xì)胞吹打至重懸后接種于培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，4～5 d換液一次。

1.2.3 細(xì)胞的純化及鑒定 牙周膜成纖維細(xì)胞的純化即是將其與其中的上皮細(xì)胞分離，使用含EDTA(0.02%)的0.25%胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，一般4～5 min，利用HPDLCs與上皮細(xì)胞對(duì)胰酶的耐受度不同這一性質(zhì)，再傳到至4～5代時(shí)，HPDLCs可完全純化。牙周膜成纖維細(xì)胞是來(lái)自于上皮中胚層的細(xì)胞，其與上皮細(xì)胞相區(qū)別的特異性蛋白即波形蛋白，本實(shí)驗(yàn)即鑒定細(xì)胞中是否存在波形蛋白及角蛋白，由此來(lái)鑒定細(xì)胞的來(lái)源。

1.2.4 HPDLCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 取生長(zhǎng)至第4代的HPDLCs，使用0.25%的胰蛋白酶消化，離心后棄去上清液，加入含20%FBS的培養(yǎng)基后重懸細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL的量接種于24孔板中，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d對(duì)細(xì)胞進(jìn)行一次換液，后每24 h消化3孔對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取3孔細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值進(jìn)行計(jì)算，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d，根據(jù)得到的7 d細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖，其中以細(xì)胞數(shù)量作為縱軸，以細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)作為橫軸。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)χ2檢驗(yàn)比較3種實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞培養(yǎng)的成功率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三種實(shí)驗(yàn)方法的比較 均取15例健康牙周膜進(jìn)行分析。高血清結(jié)合改良組織塊培養(yǎng)法的組織塊貼壁率為92%，從倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)組織塊呈淡黃色，邊緣處略顯透亮，4～7 d約90%可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，呈放射聚集性生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形或多角形。去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)，3～4 d后細(xì)胞可生長(zhǎng)達(dá)到融合狀態(tài)。15例中有13例培養(yǎng)成功，成功率為86.67%。傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)法的組織塊貼壁率約為45.33%，倒置顯微鏡下觀察組織塊呈褐黑色，15～20 d約50%可見(jiàn)細(xì)胞爬出，呈小聚落放射生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形或多角形。去除組織塊后繼續(xù)培養(yǎng)，8～10 d后細(xì)胞可達(dá)到融合狀態(tài)。15例中4例培養(yǎng)成功，成功率為26.67%。改良組織塊培養(yǎng)法的貼壁率約54.67%,倒置顯微鏡下組織塊呈現(xiàn)半透明狀，10～12 d約60%有細(xì)胞爬出，細(xì)胞大部分呈正常長(zhǎng)梭形狀，小部分細(xì)胞較正常形態(tài)更為細(xì)長(zhǎng)；在細(xì)胞的增殖過(guò)程中，有15%的細(xì)胞崩解凋亡，約8 d細(xì)胞基本達(dá)到80%融合狀態(tài)，基本可以傳代。15例中8例培養(yǎng)成功，成功率為53.33%。高血清結(jié)合改良組織塊培養(yǎng)法的成功率明顯高于其他兩種培養(yǎng)法，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

注：A.高血清結(jié)合改良法組5 d，大量細(xì)胞從組織塊邊緣爬出；B.改良法組12 d， 細(xì)胞爬出組織塊并生長(zhǎng)增殖；C.傳統(tǒng)法組16 d，少量細(xì) 胞從組織塊邊緣爬出；D.高血清組細(xì)胞爬出4 d后，周圍細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)(10×倒置顯微鏡拍攝)。圖1 HPDOCs三種培養(yǎng)方式的比較

2.2 細(xì)胞鑒定免疫組化染色 對(duì)第4代細(xì)胞免疫組化染色，鑒定抗波形蛋白呈陽(yáng)性，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量棕黃色顆粒，即可知細(xì)胞來(lái)源于上皮組織中胚層；鑒定抗角蛋白呈陰性，細(xì)胞內(nèi)無(wú)陽(yáng)性顆粒反應(yīng)，經(jīng)蘇木素染色呈淡藍(lán)，由此可判斷此細(xì)胞為牙周膜成纖維細(xì)胞，見(jiàn)圖2。

注：A.HPDLCs免疫組化染色，抗波形蛋白呈陽(yáng)性(40×)； B.HPDLCs免疫組化染色，抗角蛋白呈陰性(40×)。圖2 HPDLCs鑒別

2.3 HPDLCs生長(zhǎng)曲線 HPDLCs的生長(zhǎng)可分為3期，既緩慢期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期。接種后經(jīng)24 h后消化細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，因細(xì)胞剛經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化刺激，細(xì)胞數(shù)量較平時(shí)生長(zhǎng)速度明顯減慢，數(shù)量減少，隨后逐漸增加。從第3天開(kāi)始細(xì)胞的增殖速度明顯加快，進(jìn)入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，到第7天細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到頂峰。此后因細(xì)胞已長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，相互之間出現(xiàn)接觸抵觸，生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞不在進(jìn)行分裂、增殖，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入到平臺(tái)期。本實(shí)驗(yàn)的三種培養(yǎng)方式中，細(xì)胞的增殖速度相似，是呈緩慢期-對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期-平臺(tái)停滯期的形式，見(jiàn)圖3。

圖3 HPDLCs生長(zhǎng)曲線

3 討 論

牙周膜細(xì)胞的培養(yǎng)方法一般分為組織塊培養(yǎng)法及消化法兩種。傳統(tǒng)的組織塊培養(yǎng)法在操作上較為簡(jiǎn)易，不容易發(fā)生污染，成纖維細(xì)胞的同源性較高，且相較于消化法所需要的組織量也較少。但其缺點(diǎn)在于培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，從細(xì)胞爬出到細(xì)胞接近融合狀態(tài)需要2～4周，在本實(shí)驗(yàn)中組織塊貼壁率只達(dá)到約40%，這直接影響了細(xì)胞培養(yǎng)的成功率，15例的實(shí)驗(yàn)組中僅有4例成功培養(yǎng)出細(xì)胞，效率只達(dá)到約26.6%，這與文獻(xiàn)[3]報(bào)道的數(shù)據(jù)相符合。

研究[4]認(rèn)為傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)法更容易掌握，所以此法得到廣泛的運(yùn)用。但因?yàn)閭鹘y(tǒng)的培養(yǎng)法獲得的細(xì)胞量少且培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)過(guò)久，使得效率降低，有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了改良，即是將原有消化法中的“雙酶”改為了只用Ⅰ型膠原酶消化牙周膜組織，使得組織連接部分分離，這樣可以將原有消化法中兩種酶對(duì)細(xì)胞的損傷盡量降低，同時(shí)也可以使細(xì)胞更快地從已經(jīng)過(guò)“半消化”的組織塊中分離出來(lái)，所以此方法是目前運(yùn)用最廣泛的培養(yǎng)法。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，改良組織塊培養(yǎng)法的培養(yǎng)周期雖相對(duì)縮短，但組織塊的貼壁率只達(dá)到約60%，這對(duì)原代細(xì)胞培養(yǎng)的成功率也出現(xiàn)了直接的影響，如無(wú)法提高組織塊的貼壁率，但就改良消化的方式來(lái)說(shuō)并不能真正的提高原代細(xì)胞培養(yǎng)的效率。

現(xiàn)已有研究[5]表明，含有高濃度血清的培養(yǎng)基有助于組織塊貼壁效率，可以為細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。胎牛血清(FBS)的作用：(1)提供對(duì)維持細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)的激素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒(méi)有或量很少的營(yíng)養(yǎng)物，以及主要的低分子營(yíng)養(yǎng)物；(2)提供結(jié)合蛋白，能識(shí)別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)變它們所結(jié)合物的活力；(3)有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起到解毒作用；(4)是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來(lái)源；(5)起酸堿度緩沖液作用；(6)提供蛋白酶抑制劑，使在細(xì)胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受傷害[6]。

對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)的血清濃度問(wèn)題目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者均無(wú)明確答案，不同類型的細(xì)胞其差異很大，因血清成分復(fù)雜，過(guò)多應(yīng)用血清易引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠，且血清是酸性，對(duì)也細(xì)胞生長(zhǎng)不利。在大部分的原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，大多使用15%～20%的FBS，傳代后使用10%的FBS繼續(xù)培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)中的高血清培養(yǎng)法將FBS含量提高至40%，傳代后使用20%的FBS繼續(xù)培養(yǎng)。15例中有13例培養(yǎng)成功，效率可達(dá)到86.7% ，明顯比另外兩種培養(yǎng)法的成功效率高。因此，40%的FBS提供了豐富的結(jié)合蛋白和促進(jìn)組織塊貼壁的黏附因子，與另外兩種培養(yǎng)法相比較，其組織塊貼壁率達(dá)到90%，明顯高于另外兩種，說(shuō)明此血清濃度可以很好地促進(jìn)組織塊貼壁。本實(shí)驗(yàn)中4～7 d約90%可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，呈放射聚集性生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形或多角形。去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)后，因?yàn)檠逄峁┝溯^高的養(yǎng)分，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛、均勻，使得3～4 d后細(xì)胞可生長(zhǎng)達(dá)到融合狀態(tài)，速率明顯高于另兩種培養(yǎng)方式。本實(shí)驗(yàn)采取的高血清結(jié)合改良組織塊培養(yǎng)法，將兩種方法結(jié)合不僅僅可以降低消化酶對(duì)細(xì)胞的損傷，同時(shí)運(yùn)用高血清濃度提高組織塊貼壁率這一效果，使得原代細(xì)胞培養(yǎng)的速率及效率都得到了提高。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用的FBS濃度是常用濃度的2倍，從倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及增值狀況，顯示都趨于正常，這說(shuō)明高濃度的血清并不影響細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的三種培養(yǎng)方式，我們認(rèn)為高血清結(jié)合改良組織塊培養(yǎng)法的成功率較高、操作較已掌握、不容易發(fā)生污染，同時(shí)縮短了培養(yǎng)時(shí)間，獲得相對(duì)較大數(shù)量的細(xì)胞，是一種較為適用、高效的HPDLCs的原代培養(yǎng)方式。

[1] 侯睿,陳新民,巢永烈,等.體外不同動(dòng)態(tài)力學(xué)應(yīng)變對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖和功能活性的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(2):252-256.

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Study on the various culture methods of periodontal ligament fibroblast cell

WuYou，ZhangJunmei△.

GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,China.

Objective To improve the successful rate of primary culture of periodontal fibroblast cells and tissue block adherence rate, reduce culture time and increase cell production. Methods Culture primary HPDLCs by combining high serum and improved tissue block, which was compared with traditional tissue block method and improved block method. Recognize the source of cell by immunity group, draw the growing curve of cell, and make comparison of successful rate, adherence rate and production rate of three methods. Results The primary cells cultured by three methods are all normal. The cells look like fusiform and multi-angle shape, vimentin positive, Keratin negative, which conform of normal morphology of HPDLCs and biological characteristics. The successful rate of improved tissue block with high serum totals 86.7%, obviously higher than that of other two groups (P<0.01). Conclusion The method of high serum improved tissue block obviously is increased the successful rate of primary cultivation, which shall be applied in clinical cases.

Primary culture； Improve the successful rate of primary culture； Human periodontal ligament cells

R781

A

1000-744X(2016)05-0469-03

2015-10-25)

△通信作者，E-mail:zjm46688@126.com