甘草酸二銨對(duì)小鼠急性肝衰竭發(fā)生過程中HMGB1表達(dá)的影響

張留魯 羅新華 危敏

(貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

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甘草酸二銨對(duì)小鼠急性肝衰竭發(fā)生過程中HMGB1表達(dá)的影響

張留魯 羅新華△危敏

(貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

目的 探討甘草酸二銨對(duì)小鼠急性肝衰竭發(fā)生過程中小鼠肝組織高遷移率族蛋白B1(HMGB1)表達(dá)的影響。方法 取雄性昆明種小鼠72只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、急性肝功能衰竭組及甘草酸二銨治療組。模型組及治療組予D-Galn 500 mg/kg及LPS 10 μg/kg腹腔注射建立急性肝功能衰竭小鼠模型，并于建模1 h后予以甘草酸二銨70 mg/kg對(duì)治療組小鼠進(jìn)行灌胃處理，正常對(duì)照組及模型組予等量生理鹽水灌胃。以建模后4，8，12，24 h分別取靜脈血以常規(guī)生化方法檢測小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)水平，HE染色法檢查肝組織病理學(xué)變化，采用免疫組織化學(xué)法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測小鼠肝組織中HMGB1的蛋白表達(dá)量及mRNA水平。結(jié)果 模型組及治療組小鼠血清ALT和AST水平均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，且模型4，8 h組小鼠血清ALT和AST含量均高于相應(yīng)治療組(P<0.05)，模型8，12，24 h組及甘草酸二銨治療12，24 h組小鼠血清TBIL水平均顯著高于正常對(duì)照(P<0.05)。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型8，12，24 h組及治療8，12，24 h組小鼠肝組織中HMGB1蛋白表達(dá)水平較相應(yīng)正常對(duì)照組顯著增加(P<0.01)，且隨肝衰竭發(fā)展明顯增加，模型8，12 h組HMGB1蛋白表達(dá)量高于相應(yīng)甘草酸二銨治療組(P<0.05)。Real time-PCR結(jié)果顯示，模型組和治療8，12，24 h組小鼠肝組織HMGB1 mRNA表達(dá)量高于正常對(duì)照組(P<0.05)，模型8 h、12 h組HMGB1 mRNA表達(dá)量高于相應(yīng)治療組(P<0.05)。結(jié)論 HMGB1在小鼠急性肝功能衰竭過程中發(fā)揮了重要作用。甘草酸二銨可能通過抑制HMGB1的產(chǎn)生減輕肝損傷。

急性肝衰竭； HMGB1； RAGE； 甘草酸二銨

急性肝功能衰竭(acute liver failure,ALF)是由多種原因引起的肝細(xì)胞急性大量壞死和嚴(yán)重肝功能損傷所致的臨床綜合征。具有病情進(jìn)展快、治療難度大、并發(fā)癥多、死亡率高、預(yù)后極差的特點(diǎn)，是當(dāng)前肝病研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。在急性肝功能衰竭動(dòng)物模型中，K.Takano 等[1]發(fā)現(xiàn)血清 HMGB1水平在肝功能損害時(shí)明顯升高，予以HMGB1多克隆抗體降低血清HMGB1水平，可改善肝臟組織學(xué)損傷，并提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物短期生存率，提示HMGB1參與并介導(dǎo)了急性肝損傷的發(fā)病過程，中和血清HMGB1可有效阻斷急性肝功能損害進(jìn)程，為提高急性肝功能衰竭患者治愈率提出了一種新的可能。甘草酸(Glycyrrhizin)是甘草根莖的提取物，它是甘草次酸和葡萄糖醛酸的共軛化合物。研究證實(shí)[2]，甘草酸可以結(jié)合游離的 HMGB1、抑制 HMGB1的釋放，目前關(guān)于甘草酸制劑對(duì)小鼠急性肝衰竭發(fā)生過程中HMGB1表達(dá)的研究尚鮮有報(bào)道。本研究擬建立小鼠急性肝衰竭模型，以甘草酸二銨作為治療藥物，觀察甘草酸二銨對(duì)小鼠急性肝功能衰竭病程中HMGB1表達(dá)的影響。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性昆明種SCXK(黔)2012-001小鼠72只，體質(zhì)量(20±1.7)g。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為：正常對(duì)照組，肝衰竭模型4 h組、8 h組、12 h組及24 h組，甘草酸二胺治療4 h組、8 h組、12 h組、24 h組，每組各8只。在第4，8，12小時(shí)和第24小時(shí)(實(shí)驗(yàn)中18 h后死亡小鼠計(jì)入24 h組)眼球取血后、斷頸處死各組小鼠，留取血液及全部肝臟。血液4 ℃離心1 500 rpm ×10 min后,分離血清，置-80 ℃冰箱保存。取各小鼠右葉肝組織1.3 mm3大小固定于4%中性甲醛固定，其余肝組織置-80 ℃冰箱保存。

1.2 檢測指標(biāo)及方法

1.2.1 血清ALT、AST、TBIL含量檢測 血清ALT、AST、TBIL含量測定采用Siemens Advia 1650全自動(dòng)生化分析儀，由貴州省人民醫(yī)院生化科嚴(yán)格按照試劑盒要求測定。

1.2.2 光鏡下觀察肝臟組織結(jié)構(gòu) 肝右葉組織浸于4%中性甲醛緩沖液中固定48 h以后，轉(zhuǎn)移到0.1 mol/L的PBS溶液中保存，常規(guī)石蠟包埋切片行HE染色。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測高遷移率蛋白(HMGB1)的表達(dá) 采用SP法，微波加熱抗原修復(fù)，以DAB顯色。兔抗人HMGB1單克隆抗體為武漢博士德生物技術(shù)公司產(chǎn)品。操作程序按說明書進(jìn)行。陰性對(duì)照以PBS替代一抗，用已知陽性標(biāo)本作陽性對(duì)照。染色結(jié)果判斷 光鏡下觀察：細(xì)胞呈棕黃色為陽性表達(dá)細(xì)胞，每張切片在高倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，分別按染色深度和陽性細(xì)胞的分布作如下評(píng)分：(1)無著色為 0 分，淡黃色為 1 分，棕黃色為 2 分，棕褐色為 3 分；(2)陽性范圍：沒有陽性細(xì)胞為 0 分，陽性細(xì)胞百分比<10%為 1 分，陽性細(xì)胞百分比11%～50%為2 分，陽性細(xì)胞百分比51%～80%為 3 分，陽性細(xì)胞百分比>80%為 4 分。以二者分?jǐn)?shù)乘積，通過兩者乘積結(jié)果進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 肝臟組織50 mg加入Trizol 1.0 mL充分勻漿后離心，取上清液，酶標(biāo)儀測定RNA 濃度。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄20 μL 體系(5×buffer 4 μL、10 mmol/L dNTP 2 μL、Olig DT 1 μL、RNase Inhibitor 1 μL、RNA 反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL、RNase-free H2O 9.0 μL、模板2 μL) ; 逆轉(zhuǎn)錄條件: 42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min、4 ℃保存; RT-PCR 20 μL 體系( 2 ×SYBR Green 10 μL、primer mix 1.0 μL、RNase-freeH2O 7.0 μL、模板2.0 μL); 循環(huán)參數(shù): 50 ℃ 120 s、95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s ，共40個(gè)循環(huán)。HMGB1引物序列: 上游5’ CCAGCGAAGGCTATCACAAG 3’，下游5’TCATAAAGGGACAAACCACAGT 3’。β-actin 序列: 上游5’ GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA 3’，下游5’ GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG 3’。所有引物均采用Primer 3.0 設(shè)計(jì)并經(jīng)過NCBI Blast 驗(yàn)證產(chǎn)物特異性。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清ALT、AST、TBIL濃度比較 小鼠注射D-GalN+LPS后, 模型組及治療組血清AST、ALT濃度逐漸升高，12 h達(dá)高峰，24 h維持在較高水平，模型組及治療組血清AST、ALT濃度顯著高于正常對(duì)照組小鼠(P<0.01)，且模型組4，8 h小鼠血清AST、ALT濃度較對(duì)應(yīng)治療組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝衰竭組及治療組，血清TBIL濃度逐漸升高，24 h達(dá)高峰，肝衰竭組8，12，24 h組及治療12，24 h組血清TBIL濃度高于相應(yīng)正常對(duì)照組小鼠(P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST、TBIL濃度

注:與正常組比較，#P<0.01，※P<0.05；與治療組比較，&P<0.05。

2.2 各組小鼠肝組織學(xué)變化 正常對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,模型組隨著給藥時(shí)間延長，肝組織發(fā)生的病理改變逐漸加重， 4 h可見肝細(xì)胞輕度腫脹,嗜酸性變，炎細(xì)胞浸潤,可見核內(nèi)包涵體，肝細(xì)胞呈點(diǎn)狀壞死；8 h肝細(xì)胞氣球樣變，匯管區(qū)及肝細(xì)胞間見炎細(xì)胞浸潤伴出血，可見核內(nèi)包涵體，肝細(xì)胞呈橋接壞死；12 h可見肝細(xì)胞片狀壞死融合，核溶解、碎裂，匯管區(qū)及肝細(xì)胞間見較多炎細(xì)胞浸潤伴少量出血；24 h肝細(xì)胞壞死更加明顯，大片狀壞死和少量出血，僅少量肝細(xì)胞殘存，散在分布，纖維網(wǎng)狀支架塌陷。治療組與模型組相比有好轉(zhuǎn)，4 h時(shí)仍可見多量嗜酸性變，炎細(xì)胞浸潤較模型組少；8 h仍可見多量嗜酸性變，出血，炎細(xì)胞浸潤較模型組少；12，24 h與模型組相比，壞死減輕，炎細(xì)胞浸潤較模型組少，見圖1。

正常組 (HE，×400) 模型8 h組(HE，×400) 治療24 h組 (HE，×400)圖1 各組小鼠肝組織HE染色結(jié)果

2.3 免疫組化各組小鼠肝組織中HMGB1蛋白表達(dá)變化結(jié)果 HMGB1蛋白表達(dá)：正常對(duì)照組主要為肝細(xì)胞胞漿及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞胞漿有弱表達(dá)，未見核陽性表達(dá)。小鼠注射LPS/D-GalN后表達(dá)陽性細(xì)胞主要為肝細(xì)胞，4 h及8 h胞漿表達(dá)明顯，12，24 h 表達(dá)呈強(qiáng)陽性，隨著肝細(xì)胞壞死的加重,壞死區(qū)陽性表達(dá)明顯增加。甘草酸二銨治療組各時(shí)間點(diǎn)與模型組比較陽性細(xì)胞表達(dá)減少。經(jīng)檢驗(yàn)，模型8，12，24 h 組和治療8，12，24 h 組較正常對(duì)照組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甘草酸二銨治療組8，12 h HMGB1蛋白表達(dá)與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，明顯受抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、表2。

正常組(SABC，×400) 治療8 h組(SABC，×400) 模型24 h組(SABC，×400)圖2 各組小鼠肝組織中HMGB1表達(dá)結(jié)果(箭頭所示為陽性表達(dá))

2.4 各組小鼠肝組織中HMGB1 mRNA 表達(dá)水平 小鼠注射LPS/D-GralN后4 h, 模型組和治療組小鼠肝組織內(nèi)HMGB1 mRNA表達(dá)開始上調(diào)，8 h達(dá)到高峰，之后有降低趨勢，但維持在較高水平，經(jīng)檢驗(yàn)，模型組4，8，12，24 h和治療組8，12，24 h的 HMGB1 mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加(P<0.05)；治療組8，12 h HMGB1 mRNA的表達(dá)較相應(yīng)模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠肝組織中HMGB1 mRNA 表達(dá)水平

注:與正常組比較，※P<0.05；與治療組比較，&P<0.05。

3 討 論

ALF可由包括藥物、毒物、病毒感染等多種原因引起，病理生理學(xué)上表現(xiàn)為肝細(xì)胞大量壞死、凋亡，導(dǎo)致肝臟合成、解毒、轉(zhuǎn)運(yùn)和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙，繼而出現(xiàn)以嚴(yán)重消化道癥狀、極度乏力、凝血功能障礙、深度黃疸、肝性腦病、腹水等臨床癥候群[3]。急性肝功能衰竭具有起病急、預(yù)后差及病死率高的特點(diǎn)，迄今仍無有效治療，是肝臟疾病研究的熱點(diǎn)之一。

H.Wang[4]等首次報(bào)道HMGB1作為新的潛在的晚期炎癥介質(zhì),參與了膿毒癥的發(fā)病過程,是內(nèi)毒素致死效應(yīng)的晚期重要炎癥介質(zhì)。臨床研究[5]發(fā)現(xiàn)急性重型胰腺炎病人的血清HMGB1水平可顯著增高，且與病情嚴(yán)重程度顯著相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[6]發(fā)現(xiàn)高壓氧致小鼠肺損傷模型中，氣道內(nèi)HMGB1顯著增加，通過抑制HMGB1可減輕病變部位中性粒細(xì)胞聚集、水腫以及早期炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。在大鼠和小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型中，應(yīng)用HMGB1抗體或抑制劑，可明顯減輕關(guān)節(jié)炎癥狀[7]。 因此，HMGB1作為一種重要的晚期炎癥因子可參與多種疾病炎癥反應(yīng)及器官損害 。

目前在多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中證實(shí)甘草酸類制劑的肝臟保護(hù)作用[8]，臨床上廣泛應(yīng)用于慢性乙肝和丙肝的治療[9]。甘草酸不僅可以抑制HMGB1的釋放，還可以結(jié)合胞外游離的HMGB1，從而作為 HMGB1的一個(gè)抑制劑，減輕由HMGB1 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究以昆明種小鼠為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以D-氨基半乳糖和脂多糖成功復(fù)制了陳恩強(qiáng)等[10]建立的動(dòng)物急性肝功能衰竭模型。隨肝細(xì)胞損傷程度加重，免疫組化檢測HMGB1在壞死區(qū)域內(nèi)的表達(dá)量出現(xiàn)明顯的升高。實(shí)時(shí)定量PCR等方法檢測HMGB1在mRNA水平的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示急性肝衰竭8 h組HMGB1mRNA在肝臟組織中的相對(duì)含量達(dá)到高峰，之后有降低趨勢，但12，24 h組HMGB1在肝臟組織中的相對(duì)含量仍維持在較高水平。本研究中ALT、AST及肝臟組織學(xué)提示在研究開始的前12 h中，肝細(xì)胞以炎性損害為主，部分肝細(xì)胞仍有活性及功能，此時(shí)肝細(xì)胞合成的HMGB1 mRNA以維持HMGB1蛋白表達(dá)；但在12 h以后肝組織學(xué)也表現(xiàn)出了片狀壞死，此時(shí)，存活肝細(xì)胞的數(shù)量銳減，HMGB1 mRNA合成大量減少，但壞死區(qū)域內(nèi)的HMGB1蛋白仍可持續(xù)作用于炎癥反應(yīng)過程。而甘草酸二銨治療組小鼠肝組織內(nèi)HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平在相同時(shí)間點(diǎn)均較相對(duì)應(yīng)治模型低，說明甘草酸二銨治療組小鼠HMGB1在基因和蛋白水平均受到了不同程度的抑制，同時(shí)HE染色發(fā)現(xiàn)，肝臟炎癥壞死的程度較模型組明顯減輕，小鼠的一般臨床狀況有好轉(zhuǎn)。而且血清ALT、AST及TBIL水平下降，說明肝功能好轉(zhuǎn)，肝細(xì)胞壞死減少。

甘草酸二胺在肝衰竭過程中通過結(jié)合游離的 HMGB1和抑制 HMGB1的釋放，進(jìn)而抑制HMGBl表達(dá)減輕了急性肝衰竭過程中肝臟進(jìn)行性損傷。

[1] Takano K, Shinoda M, Tanabe M, et al. Protective effect of high-mobility group box 1 blockade on acute liver failure in rats[J]. J Shock,2010,34(6):573-579.

[2] Girard,Jean-Philippe.A Direct Inhibitor of HMGB1 cytokine[J].Chem Biol,2007,14(4)：345.

[3] Whitehouse T，Wendon J.Acute liver failure[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol，2013，27(5):757-769.

[4] Wang H, Bloom O, Zhang M, et al.HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice[J].Science,1999, 285(5425):248-251.

[5] Szabolcs P,Hofner T，Takács G,et al.Plasma Concentrations of high-mobility group box protein 1, soluble receptor for advanced glycation end-Products and Circulating DNA in Patients with acute pancreatitis[J].Pancreatology, 2009，9(4) : 383-391.

[6] Entezari M，Javdan M，Antoine DJ，et al.Inhibition of extracellular HMGB1 attenuates hyperoxia-induced inflammatory acute lung injury[J].Redox Biol,2014 (2):314-322

[7] Luis Ulloa，F(xiàn)ranak M，Batliwalla UA，et al.High mobility group box chromosomal protein 1 as a nuclear protein, cytokine, and potential therapeutic target in arthritis[J].Arthritis and Rheumatism, 2003,48(4) :876-881.

[8] Ikeda T，Abe K，KlJroda N，et a1．The inhibition of apoptosis by glycyrrhizin in hepatic injury induced by injection of lipopolysaccharide/D-galactosamine in mice[J].Arch Histol Cytol，2008，71(3):163-178.

[9] Iino S, Tango T,Matsushima T, et al.Therapeutic effects of stronger neominophagenC at different doses on chronic hepatitis and liver cirrhosis[J].Hepatol Res,2001，19(1):31-40.

[10] 陳恩強(qiáng),王麗春,唐紅,等.脂多糖聯(lián)合D-氨基半乳糖誘導(dǎo)急性重癥肝炎小鼠模型的建立[J].華西醫(yī)學(xué),2009, 24(1):129-131.

Expression influence of transcription factor HMGB1 in the process of acute liver failure induced by Glycyrmizinate acid diamine to mice

ZhangLiulu,LuoXinhua,WeiMing.

GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,China.

Objective To observe the expression influence of transcription factor HBGB1 in the process of acute liver failure induced by D-GalnandLPS, and explore the possible role of transcription factor HMGB1 in the pathogenesis of mice acute hepatic failure. Methods Total of 72 male mice was randomly divided into normal control group, acute liver failure model group, and glycyrmizinate acid diamine therapy group. Each group except the normal group was injected with D-GalN 500mg/kg and LPS 10μg/kg intraperitoneally, and after one hour, the diammonium glycyrmizinate group was fed with the glycyrrhizic acid diamine 70 mg/kg and other two groups were fed with normal saline (NS). Liver tissue was taken and detected by using HE staining method to check liver tissue pathological changes after 4 h, 8 h, 12 h, 24 h. The expression of HMGB1 protein in hepatic tissue was detected by immunohistochemistry and the expression of HMGB1 mRNA was determined by real time-PCR. Results Immunohistochemistry results was shown that model group and therapy group mice liver tissue HMGB1 protein expression at 8 h, 12 h, and 24 h were higher than normal control group, and there were statistical significance differences (P<0.01), and the model group of HMGB1 protein expression at 8 h and 12 h was higher than therapy group (P<0.05). Real time PCR results was shown that model and therapy groups's HMGB1mRNA expression at 8 h,12 h, and 24 h were higher than normal control group (P<0.05), and the model group's HMGB1mRNA expression at 8 h, 12 h was higher than the therapy group (P<0.05). Conclusion HMGB1 in the mice with acute liver failure model may play in a key role. Glycyrrhizic acid diamine can inhibit HMGB1of the liver cell to protect liver.

Acute liver failure; HMGB1； RAGE； Glycyrmizinate

R-332，R575.3

A

1000-744X(2016)05-0456-04

2015-09-27)

△通信作者，E-mail:luoxh09@163.com