負(fù)性共刺激分子免疫球蛋白BTLA的特點及其在肺結(jié)核病灶組織中的表達(dá)

程曉菊 周國旗

(遵義市第一人民醫(yī)院，貴州 遵義 563000)

負(fù)性共刺激分子免疫球蛋白BTLA的特點及其在肺結(jié)核病灶組織中的表達(dá)

程曉菊 周國旗

(遵義市第一人民醫(yī)院，貴州 遵義 563000)

目的 探討不同年齡段肺結(jié)核患者病灶組織中負(fù)性共刺激分子BTLA的表達(dá)情況。方法 設(shè)立老年肺結(jié)核組(15例)、青年肺結(jié)核組(13例)、對照組(10例)，分別利用免疫組織化學(xué)染色檢測各組肺組織中BTLA表達(dá)，同時常規(guī)進行血清炎癥指標(biāo)PCT、IL-6檢測、結(jié)核抗體檢測及γ-干擾素釋放實驗。結(jié)果 13例青年肺結(jié)核患者中有7例檢測出血清結(jié)核抗體，陽性率為54%；15例老年肺結(jié)核患者中有5例檢測出血清結(jié)核抗體，陽性率為33%；對照組中有1例檢測出血清結(jié)核抗體，陽性率為10%。兩個年齡組肺結(jié)核患者炎癥指標(biāo)PCT、IL-6水平較對照組增高(P<0.05)，而兩年齡組肺結(jié)核患者之間炎癥指標(biāo)PCT水平無明顯差異(P>0.05)。兩個年齡組肺結(jié)核患者肺組織中BTLA表達(dá)較對照組明顯增高(P<0.05)，并且青年肺結(jié)核患者肺組織中BTLA表達(dá)量高于老年肺結(jié)核患者(P<0.05)。13例青年肺結(jié)核患者中有12例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為92%；15例老年肺結(jié)核患者中有10例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為67%；對照組中有2例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為20%。結(jié)論 負(fù)性共刺激分子BTLA可能參與了不同年齡段肺結(jié)核的免疫調(diào)節(jié)，其可能成為肺結(jié)核研究的新靶點。

肺結(jié)核； B、T淋巴細(xì)胞衰減子； 免疫組化

我國是肺結(jié)核的高發(fā)地區(qū)，隨著老年化進程的不斷加劇，防控任務(wù)變得更加嚴(yán)峻。老年肺結(jié)核患者因受臨床癥狀不明顯，檢查結(jié)果不確切，治療依從性差等因素的影響，該人群診治面臨很大的困難。既往的研究已經(jīng)充分證實免疫病理損傷是肺結(jié)核發(fā)病的重要發(fā)病機制[1]，機體免疫功能衰退可能是老年肺結(jié)核患者臨床表現(xiàn)不同于青年患者的原因之一[2]。所以，充分研究老年肺結(jié)核患者的免疫學(xué)調(diào)節(jié)機制可能為該病的防治奠定理論基礎(chǔ)。B、T淋巴細(xì)胞衰減子(BTLA)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員，其與配體HVEM結(jié)合后產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)[3]。近來的研究發(fā)現(xiàn)BTLA可能參與了肺結(jié)核的免疫調(diào)節(jié)[4]，但未得到完全闡明，因此，進一步研究BTLA在肺結(jié)核患者機體中的表達(dá)可能為肺結(jié)核提供新的治療靶點。本文擬通過檢測不同年齡段肺結(jié)核患者病灶組織中BTLA的表達(dá)和分析臨床資料與之相關(guān)性探討B(tài)TLA表達(dá)對肺結(jié)核發(fā)病機制的影響。

1 資料與方法

1.1 納入對象 收集遵義市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科2014年1月至2015年1月住院的老年肺結(jié)核患者15例，其中男性7例，女性8例，平均年齡(71.4±7.6)歲，所有患者均排除糖尿病、腫瘤、肥胖和系統(tǒng)性炎癥疾??；同期住院的青年肺結(jié)核患者13例，其中男性9例，女性4例，平均年齡(26.1±2.5)歲；對照組10例，其中男性5例，女性5例，平均年齡(41.8±9.3)歲，系胸外傷肺葉切除患者，無吸煙史，無心臟病或其他基礎(chǔ)疾病病史。

1.2 方法 (1)血清炎癥指標(biāo)PCT、IL-6及結(jié)核抗體檢測：所有納入對象空腹抽取靜脈血2 mL，置于無菌常規(guī)管中，凝固后于常溫3 000 r/min離心5 min，留取血清于-20 ℃保存待查。PCT、IL-6檢測采用免疫發(fā)光法定量檢測試劑盒測定，正常參考值分別為<0.046 ng/mL、<7 pg/mL；結(jié)核抗體檢測采用膠體金法，正常參考值陰性。(2)γ-干擾素釋放實驗：①樣品采集與制備：用肝素鋰抗凝采血管采集待檢者外周血，將血液與預(yù)熱至室溫的RPMI1640不完全培養(yǎng)液按照體積比1∶1混合均勻；按照混勻血樣與淋巴細(xì)胞分離液的體積比為2～3∶1的比例，離心后收集中間的白色細(xì)胞層，即PBMC。洗滌后將細(xì)胞重懸于2 mLAIM培養(yǎng)液中，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×106個/mL。②檢測：按實驗室方法規(guī)范操作。③結(jié)果的判定：當(dāng)陰性對照孔斑點數(shù)為0～5，若TB刺激物孔比陰性孔紫色斑點數(shù)≥5個，則判為陽性，反之，判為陰性；當(dāng)陰性孔紫色斑點數(shù)≥6個時，若TB刺激物孔是陰性孔紫色斑點數(shù)的2倍，則判為陽性，反之，判為陰性。(3)免疫組織化學(xué)染色：免疫組織化學(xué)染色采用PV二步法檢測盒(中杉金橋生物有限公司，中國)，根據(jù)說明書操作：3～5 μm組織切片常規(guī)脫蠟至水,1% H2O2處理后高壓修復(fù)2 min，然后按1∶150濃度稀釋鼠抗人BTLA單克隆(Origene，美國)一抗4 ℃孵育過夜，充分PBS沖洗后滴加二抗37℃孵育，最后DAB顯色和蘇木精復(fù)染。圖像分析：利用計算機圖像分析軟件IPWin32采集系統(tǒng)，每張切片隨機采集5個不同視野；根據(jù)文獻(xiàn)[5]的評分標(biāo)準(zhǔn)HIS=A×B(注：A為陽性細(xì)胞數(shù)分級,0%～1%=0,2%～10%=1,11%～50%=2,51%～80%=3,81%～100%=4；B為陽性細(xì)胞顯色強度分級，0為陰性，1為弱陽，2為陽性，3為強陽性)進行免疫組織化學(xué)染色評分，半定量分析BTLA蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 檢測結(jié)果數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用t檢驗。用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析。

2 結(jié) 果

13例青年肺結(jié)核患者中有7例檢測出血清結(jié)核抗體，陽性率為54%；15例老年肺結(jié)核患者中有5例檢測出血清結(jié)核抗體，陽性率為33%；對照組中有1例檢測出血清結(jié)核抗體，陽性率為10%。兩個年齡組肺結(jié)核患者炎癥指標(biāo)PCT、IL-6水平較對照組增高(P<0.05)，而兩個年齡組肺結(jié)核患者之間炎癥指標(biāo)PCT、IL-6水平無明顯差異(P>0.05)。兩個年齡組肺結(jié)核患者肺組織中BTLA表達(dá)較對照組明顯增高(P<0.05)，且青年肺結(jié)核患者肺組織中BTLA表達(dá)量高于老年肺結(jié)核患者(P<0.05)。13例青年肺結(jié)核患者中有12例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為92%；15例老年肺結(jié)核患者中有10例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為67%；對照組中有2例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為20%。見表1。

表1 各組檢查結(jié)果比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與老年肺結(jié)核組比較，#P< 0.05。

3 討 論

肺結(jié)核是嚴(yán)重威脅人類健康的常見傳染性疾病，在中低收入國家肺結(jié)核的患病人數(shù)占全球患病總?cè)藬?shù)的95%以上[6]。我國是結(jié)核病的高發(fā)區(qū)，每年有很大數(shù)量的肺結(jié)核新發(fā)病例出現(xiàn)及因該病所致死亡和喪失勞動力者；加上人類免疫缺陷病毒的蔓延，耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，人口結(jié)構(gòu)和生活環(huán)境的改變，給肺結(jié)核的防控帶來極大挑戰(zhàn)，形勢十分嚴(yán)峻[7]。雖然衛(wèi)生行政部門通過健康體檢等方式加大了對肺結(jié)核易患人群的監(jiān)控，但是作為特殊人群的老年患者往往因衛(wèi)生和居住條件的限制而使監(jiān)控變得非常困難；同時，老年肺結(jié)核患者有癥狀不典型、檢查結(jié)果變異性大，治療效果不確切等特點，這使臨床診治面臨很大困難，容易導(dǎo)致疾病的誤診。因此，明確不同年齡段肺結(jié)核患者免疫反應(yīng)狀態(tài)可能為該疾病的診治提供新的線索。

目前感染性疾病常用的炎癥標(biāo)記物有血清PCT和IL-6水平的檢測，肺結(jié)核作為一種特異性炎癥反應(yīng)，低水平PCT和IL-6已被臨床應(yīng)用于肺結(jié)核與社區(qū)獲得性肺炎的鑒別診斷[8]。本組結(jié)果顯示兩個年齡組肺結(jié)核患者炎癥指標(biāo)PCT、IL-6水平較對照組增高，而兩個年齡組肺結(jié)核患者之間炎癥指標(biāo)PCT、IL-6水平無明顯差異。因此，血清炎癥標(biāo)記物PCT和IL-6水平的檢測也可以作為老年肺結(jié)核患者鑒別診斷的重要指標(biāo)。

眾所周知，肺結(jié)核的診斷主要根據(jù)病原學(xué)依據(jù)和典型的病理學(xué)特點進行確診，近年來一些新的實驗室檢查有助于提高肺結(jié)核的診斷率，如血清結(jié)核抗體檢測和γ-干擾素釋放實驗[9]。本資料結(jié)果顯示，13例青年肺結(jié)核患者中有7例檢測出血清結(jié)核抗體，陽性率為54%，15例老年肺結(jié)核患者中有5例檢測出血清結(jié)核抗體，陽性率為33%，對照組中有1例檢測出血清結(jié)核抗體，陽性率為10%；同時，13例青年肺結(jié)核患者中有12例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為92%，15例老年肺結(jié)核患者中有10例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為67%，對照組中有2例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為20%。雖然血清結(jié)核抗體檢測和γ-干擾素釋放實驗提高了肺結(jié)核的診斷率，但我國是結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，肺結(jié)核隱形感染的人數(shù)較多以至以上兩項結(jié)果出現(xiàn)假陽性率明顯增加，因此，如果單純使用血清結(jié)核抗體檢測或γ-干擾素釋放實驗作為肺結(jié)核的診斷指標(biāo)可能增加誤診率的發(fā)生。

BTLA是一種免疫球蛋白相關(guān)性膜蛋白，其作為HVEM的配體之一能與HVEM結(jié)合后活化抑制性信號通路。既往的研究已經(jīng)證實BTLA主要表達(dá)在各種類型的免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞[10]。大量的動物實驗結(jié)果表明BTLA發(fā)揮抑制效應(yīng)，但這些實驗主要集中在研究免疫相關(guān)性疾病上，如病毒性肝炎等。近來的研究表明BTLA可能與感染性疾病的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)， 比如Steinberg等[11]的研究證實BTLA在腸道炎癥的預(yù)防方面起到重要的作用，同時Zeng等的研究表明BTLA在αβ T細(xì)胞上的表達(dá)與機體對抗結(jié)核桿菌感染有關(guān)。本組資料結(jié)果顯示，兩個年齡組肺結(jié)核患者肺組織中BTLA表達(dá)較對照組明顯增高，且青年肺結(jié)核患者肺組織中BTLA表達(dá)量高于老年肺結(jié)核患者。由此，我們推測BTLA可能參與了結(jié)核分枝桿菌對肺組織的免疫損傷過程，并且不同年齡段肺結(jié)核患者肺組織BTLA的表達(dá)可能存在差異，BTLA的表達(dá)可能間接地反映機體的免疫狀態(tài)，深入研究負(fù)性共刺激分子BTLA在肺結(jié)核的免疫機制可能為肺結(jié)核的研究提供一條新的思路。

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