氯沙坦鉀聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療2型糖尿病腎病大鼠腎組織中TGF-β1、CD68和MCP-1表達(dá)的影響

劉曉偉

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 延安 716000)

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氯沙坦鉀聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療2型糖尿病腎病大鼠腎組織中TGF-β1、CD68和MCP-1表達(dá)的影響

劉曉偉

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 延安 716000)

目的 探討氯沙坦鉀聯(lián)合環(huán)磷酰胺在治療2型糖尿病腎病大鼠時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、CD68和單核細(xì)胞趨化因子蛋白-1(MCP-1)表達(dá)的影響。方法 選擇45只雄性健康SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、2型糖尿病腎病模型組和氯沙坦鉀聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療組大鼠各15只。造模成功后，觀察三組大鼠的血生化指標(biāo)和腎臟病理學(xué)改變等，并采用免疫組化染色比較其TGF-β1、CD68和MCP-1的表達(dá)情況。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，模型組和治療組的體質(zhì)量較低，在尿蛋白、血糖、甘油三酯、膽固醇和肌酐等血生化指標(biāo)以及TGF-β1、CD68和MCP-1表達(dá)方面均顯著高于對(duì)照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)；治療組與模型組相比，甘油三酯、肌酐以及TGF-β1、CD68和MCP-1表達(dá)均較低(P<0. 05)。結(jié)論 氯沙坦鉀聯(lián)合環(huán)磷酰胺在治療2型糖尿病腎病大鼠時(shí)，可以通過降低腎組織中TGF-β1、CD68和MCP-1的表達(dá)水平來降低炎細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫反應(yīng)程度，從而延緩糖尿病腎病病情的進(jìn)展，但是否能用于臨床有待于進(jìn)一步研究。

氯沙坦鉀； 環(huán)磷酰胺； 糖尿病腎??； TGF-β1； CD68； MCP-1

糖尿病腎病是一種在糖尿病患者中常見的并發(fā)癥，易演變?yōu)榻K末期腎臟病，并增加心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[1]，因而及時(shí)延緩糖尿病腎病病情的進(jìn)程具有重要意義。研究表明，細(xì)胞因子、急性反應(yīng)蛋白等參與了糖尿病腎病中的炎癥反應(yīng)[2]，降低MCP-1等炎癥因子的表達(dá)對(duì)于改善病情具有重要意義。在本次研究中，探討了氯沙坦鉀聯(lián)合環(huán)磷酰胺在治療2型糖尿病腎病大鼠時(shí)對(duì)TGF-β1、CD68和MCP-1的表達(dá)影響和其對(duì)腎臟保護(hù)作用，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選擇45只6周齡SD雄性健康大鼠，體質(zhì)量200～220 g。按隨機(jī)數(shù)字表方法將45只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、2型糖尿病腎病模型組(模型組)和氯沙坦鉀聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療組(治療組)，每組15只。

1.2 主要試劑 氯沙坦鉀由杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)，注射用環(huán)磷酰胺由Baxter Oncology GmbH公司生產(chǎn)；鏈脲霉素(STZ)由美國Sigma公司提供，TGF-β1多克隆抗體由Santa Cruz公司生產(chǎn)，兔抗大鼠MCP-1由美國PeproTech公司生產(chǎn)，免疫組織化學(xué)試劑盒由上海拜力生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 動(dòng)物模型的建立和處理 采取常規(guī)嚙齒類飼料飼養(yǎng)對(duì)照組大鼠，并使其自由攝食進(jìn)水；治療組和模型組大鼠采取高脂高糖飼料配方(煉豬油、蔗糖、膽固醇和普通飼料按10%、20%、68%的比例配成)飼養(yǎng)。4周后按25 mg/kg劑量對(duì)兩組大鼠空腹注射鏈脲霉素混合檸檬酸緩沖液，對(duì)照組采取等量緩沖液注射，7 d后進(jìn)行空腹血糖和葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)，以此確定兩組的2型糖尿病大鼠；2型糖尿病大鼠在注射STZ后兩周檢測(cè)尿蛋白，若3次為陽性，則為糖尿病腎病大鼠。治療組的大鼠以氯沙坦鉀20 mg·kg-1·d-1劑量灌胃，并以30 mg·kg-1·d-1劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺。而正常對(duì)照組和模型組的大鼠的灌胃和注射采取等量生理鹽水，10周后處死所有大鼠。處死前收集大鼠24 h尿液，并采集4 mL靜脈血，離心后冰凍保存。切取雙側(cè)腎臟稱重，于腎皮質(zhì)處切取1 mm3腎組織并采用戊二醛固定，常規(guī)酒精梯度脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片。對(duì)腎臟切片進(jìn)行病理學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)染色。電鏡下隨機(jī)選擇4個(gè)視野，以此來計(jì)算0.02 mm2的陽性細(xì)胞數(shù)，取每個(gè)視野的平均值。檢測(cè)所有大鼠的血糖、血肌酐、尿素氮、膽固醇、甘油三酯等水平，大鼠24 h尿白蛋白測(cè)定采取酶免疫分析法。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠一般情況和血生化項(xiàng)目比較

2.1.1 三組大鼠一般情況比較 正常對(duì)照組體質(zhì)量(485.19±21.25)g，腎臟重量(3.60±0.35) g，尿蛋白(0.06±0.02) g·24 h-1。模型組體質(zhì)量(426.64±29.75) g，腎臟重量(3.58±0.39) g，尿蛋白(0.16±0.03) g·24 h-1。治療組體質(zhì)量(461.51±30.35) g，腎臟重量(3.67±0.32) g，尿蛋白(0.07±0.06) g·24 h-1。治療組大鼠體質(zhì)量重于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。三組大鼠腎臟重量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.1.2 三組大鼠的血生化項(xiàng)目比較 模型組和治療組大鼠除尿素氮外，其他血生化指標(biāo)均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)。治療組的甘油三酯和肌酐含量低于模型組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 三組大鼠的血生化項(xiàng)目比較

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

2.2 腎臟病理學(xué)改變

2.2.1 腎臟光鏡改變 光鏡下對(duì)照組未見病理改變。2型糖尿病各組大鼠的腎小球基底膜變厚，系膜區(qū)擴(kuò)大，管腔較窄，大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。但治療組與模型組相比，程度較輕。見圖1。

圖1 模型組和治療組大鼠腎臟光鏡下形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2.2.2 腎臟電鏡改變 對(duì)照組大鼠未見病理改變。而2型糖尿病各組大鼠均有不同程度的內(nèi)皮細(xì)胞空泡樣變，腎小球基底膜皺縮，臟層上皮細(xì)胞肥大，發(fā)生足突融合，見圖 2。

圖2 模型組和治療組大鼠腎臟電鏡下形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2.2.3 三組大鼠腎臟TGF-β1、CD68和MCP-1表達(dá)的變化 TGF-β1、CD68和MCP-1主要在大鼠腎臟腎小管-間質(zhì)胞漿表達(dá)，若呈棕黃色則為陽性。模型組和治療組的TGF-β1、CD68和MCP-1表達(dá)水平較高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療組的各項(xiàng)表達(dá)低于模型組(P<0.01)。見表2。

表2 三組大鼠腎臟TGF-β1、CD68和MCP-1表達(dá)的變化

注：與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，▲▲P<0.01。

3 討 論

糖尿病腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，發(fā)病較為隱匿，早期臨床表現(xiàn)輕微[3]，而糖尿病亦是導(dǎo)致終末期腎病和心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此尋找有效的治療方法有著重要意義。糖尿病腎病的起病原因仍不明確，但有研究表明，受到個(gè)體血糖水平、蛋白尿情況和細(xì)胞因子等影響，被認(rèn)為是炎癥、免疫反應(yīng)和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)相互作用的結(jié)果[4]。TGF-β1是腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化過程中的重要細(xì)胞因子，起到趨化、激活單核巨噬細(xì)胞并造成細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的作用，可視為炎癥發(fā)生的標(biāo)志，其機(jī)制是通過TGF-β/Smad通路與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合從而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄[5]。有文獻(xiàn)[6]報(bào)道，MCP-1是動(dòng)脈粥樣硬化初期炎癥過程的關(guān)鍵因子，可加速腎臟纖維化的發(fā)展，在糖尿病腎病的病情進(jìn)展中起著重要作用。因而抑制腎皮質(zhì) TGF-βmRNA表達(dá)或下調(diào)MCP-1的表達(dá)，可以有效降低單核巨噬細(xì)胞局部聚集，減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積。所以TGF-β1、CD68和MCP-1可作為評(píng)估糖尿病腎病進(jìn)展的依據(jù)。研究[7]表明，氯沙坦鉀具有降低腎血流灌注壓、防止腎小球硬化等作用，因而可以阻止糖尿病腎病病情的進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)[8-9]，氯沙坦鉀有著降低腎組織MCP-1表達(dá)的作用，因而對(duì)糖尿病腎病病變大鼠的腎臟起到保護(hù)作用。有研究[10]表明，環(huán)磷酰胺通過抑制免疫系統(tǒng)細(xì)胞的分化、增殖進(jìn)而影響機(jī)體的免疫反應(yīng)，廣泛用于炎癥及免疫反應(yīng)參與的疾病。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組和氯沙坦鉀聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療組的血糖、24 h尿蛋白明顯較高，說明建模成功。模型組和治療組的TGF-β1、CD68和MCP-1表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。與模型組相比，治療組大鼠24 h尿蛋白降低，延緩了腎臟損傷。治療組TGF-β1、CD68和MCP-1表達(dá)明顯低于模型組(P<0.05)。治療組甘油三酯和肌酐含量低于模型組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過觀察模型組和治療組的光鏡和電鏡圖片，可以發(fā)現(xiàn)盡管治療組的大鼠腎組織仍存在病理改變，但其基底膜增厚情況、巨噬細(xì)胞和炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度等方面均較輕。提示在氯沙坦鉀聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療后，阻止了巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，腎損傷程度明顯降低，說明其具有保護(hù)腎小球?yàn)V過膜完整性和糖尿病大鼠腎臟的作用。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氯沙坦鉀聯(lián)合環(huán)磷酰胺可以降低2型糖尿病腎病大鼠腎組織中TGF-β1、CD68和MCP-1的表達(dá)水平，降低炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度和免疫反應(yīng)，從而延緩糖尿病腎病病情的進(jìn)展，但在臨床上能否用于治療仍需進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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Effects of the expressions of TGF-β1, CD68 and MCP-1 by united in Losartan Potassium and CTX therapy in the type 2 diabetic nephropathy renal tissue

LiuXiaowei.

AffiliatedHospitalofYananUniversity,Yuanan716000,Shanxi,China.

Objective To investigate the effects of the expressions of TGF-β1, CD68 and MCP-1 by united in Losartan Potassium and CTX therapy in the type 2 diabetic nephropathy renal tissue. Methods Total of 45 SD male rats were randomized into three groups which were the normal control group, type 2 diabetic nephropathy group and Losartan Potassium combined with CTX treatment group (each group was 15 SD). The serum biochemical parameters and renal pathologic featuresin of three groups were observed. The expressions of TGF-β1, CD68 and MCP-1 in the renal tissue were detected by immunohistochemistry staining. Results The body weight of the rats in the model group and treatment group was significantly less than control group (P<0.05). There were statistical significantly differences in the urinary protein, blood glucose, triglyceride, creatinine, cholesterol and the expression of TGF-β1, CD68 and MCP-1 between the observation and control groups (P<0.05). And there were statistical significantly differences in triglyceride, creatinineand the expression of TGF-β1, CD68 and MCP-1 between the model group and treatment group (P<0.05). Conclusion Losartan Potassium and CTX protects the kidney of diabetic nephropathy rats through inhibiting the expression of TGF-β1, CD68 and MCP-1 in the kidney and restraining macrophage infiltration and the degree and extent of immunoreaction, however, whether it can be used in the clinic that need future research.

Losartan Potassium； CTX； Diabetic nephropathy； TGF-β1； CD68； MCP-1

R-332；R589.1

A

1000-744X(2016)07-0689-03

2016-02-13)