miR-10b、miR145及miR155在乳腺癌患中的表達(dá)及臨床意義

俞進(jìn)友 仇建玲 朱正峰 周迎 谷文龍

(南通大學(xué)附屬建湖醫(yī)院腫瘤中心腫瘤內(nèi)科，江蘇 南通 224700)

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miR-10b、miR145及miR155在乳腺癌患中的表達(dá)及臨床意義

俞進(jìn)友 仇建玲 朱正峰 周迎 谷文龍△

(南通大學(xué)附屬建湖醫(yī)院腫瘤中心腫瘤內(nèi)科，江蘇 南通 224700)

目的 探討microRNA-10b(miR-10b)、microRNA-145(miR-145)及microRNA-155(miR-155)在乳腺癌患者病理組織及血清中的表達(dá)水平，進(jìn)而評(píng)價(jià)其在乳腺癌診斷中的價(jià)值。方法 收集100例正常健康志愿者，150例乳腺癌患者血液和39例乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織，提取血液和組織中的microRNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-10b、miR-145及miR-155表達(dá)水平，分析其與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性,并繪制ROC曲線分析其在乳腺癌診斷中的價(jià)值。結(jié)果 治療前乳腺癌患者血清中的miR-10b，miR-145和miR-155表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，三者表達(dá)水平均與腫瘤轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與年齡、組織學(xué)特征、ER表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)miR-10 b與臨床分期顯著相關(guān)(P<0.05)，miR-10b的ROC曲線下面積為0.936，miR-145的ROC曲線下面積為0.904，miR-155的ROC曲線下面積為0.91。miR-10b，miR-145，miR155在Ⅲ級(jí)乳腺癌患者腫瘤組織的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)乳腺癌患者癌組織的表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)論 血清中miR-10 b、miR-145及miR-155有可能作為乳腺癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。

microRNA； 乳腺癌； 腫瘤分期

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤。我國(guó)新診斷乳腺癌患者占世界乳腺癌患者12.2%[1]，嚴(yán)重危害婦女健康。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展涉及諸多因素，而基因水平的表達(dá)變化則是最為重要的調(diào)控因素[2]，miRNA在微觀水平上調(diào)控著乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼的小RNA ，廣泛存在于動(dòng)物、植物和病毒中，通過(guò)與目標(biāo)mRNA的3'UTR序列互補(bǔ)配對(duì)，調(diào)控靶基因的表達(dá)或翻譯，參與生物體的發(fā)育、炎癥、腫瘤等多種生理、病理過(guò)程[3]。最近發(fā)現(xiàn)miRNA在乳腺癌中表達(dá)譜的研究提示其可能成為一種新的疾病診斷、分類和預(yù)后判斷的工具。miR-10b作為miRNA家族中的一員，在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤組織中均存在異常表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。miR-145在乳腺癌組織中表達(dá)異常，且與病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小有關(guān)。miR-155是最早被發(fā)現(xiàn)的具有促癌活性的miRNA，不僅在乳腺癌內(nèi)表達(dá)增高，而且可以促進(jìn)體內(nèi)外乳腺癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[4]。血漿中也存在miR-155，其能夠?qū)购颂呛怂崦傅慕到舛３址€(wěn)定性，這表明血液循環(huán)中的miR-155有可能成為新一代的乳腺癌腫瘤標(biāo)志物[5]。然而這三個(gè)miRNA在中國(guó)人群中研究不多，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)中國(guó)人群血清中miR-10b、miR-145及miR-155的表達(dá)水平，分析其與乳腺癌臨床病理特征之間是否存在可靠的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 以2014年6月至2014年12月于我院就診的150例乳腺癌患者作為病例組，抽取外周血樣本，其中39例另有蠟塊切片樣本，所有病例均經(jīng)過(guò)病理學(xué)診斷證實(shí)，并附有詳細(xì)的病理資料。取這一時(shí)段內(nèi)至醫(yī)院體檢健康人外周血樣本100份作為對(duì)照組。病例組中，年齡22～75歲，平均年齡52歲，兩組樣本在性別、年齡等人口學(xué)資料上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。乳腺癌患者均按 WHO乳腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)分型，在采集血液標(biāo)本前均未經(jīng)手術(shù)，未經(jīng)放、化療，且無(wú)炎癥等合并癥。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司； All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit試劑盒購(gòu)于廣州復(fù)能基因有限公司；Real-Time PCR試劑盒購(gòu)自Promega公司；miR-10b、miR-145、miR-155引物購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司(has-miR-10b-5p引物貨號(hào)HmiRQP0034，hsa-miR-145-5 p引物貨號(hào)HmiRQP0192，hsa-miR-155-5 p引物貨號(hào)HmiRQP0221)。人miRNA外參及外參檢測(cè)引物購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司(miRNA外參貨號(hào)CR100-01，miRNA外參檢測(cè)引物貨號(hào)CD100-01)。

1.2.2 提取血液總RNA 每份取200 μL血清，加入等量的人miRNA外參，嚴(yán)格按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，按RNA量加入DEPC水溶解RNA。核酸蛋白定量?jī)x上測(cè)定RNA溶液D260/D280吸光值，計(jì)算RNA濃度和純度，D260/D280比值介于1.8～2.0方可用于cDNA合成。2%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。取少量定量后的RNA稀釋為1 μg/μL用于逆轉(zhuǎn)錄。其余RNA立即存放于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 miRNA的逆轉(zhuǎn)錄 使用All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。模板RNA 濃度調(diào)至40 ng/μL管加入2.5 U/μL Poly A Polymerase 1 μL、RTase Mix 1 μL、5×PAP/RT Buffer 5 μL、RNase/Dnase free water補(bǔ)足至25μL體系。PCR儀中設(shè)定以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：Step1：37 ℃，60min；Step2：70 ℃，15min。

1.2.4 miRNA 的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè) 用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法檢測(cè)miR-10b、miR-145、miR-155及外參在血清中的表達(dá)情況。熒光定量PCR采用20 μL的反應(yīng)體系，每孔加入2×Mix 10 μL、特異引物2 μL、通用引物(2 μM) 2 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 4 μL。每管設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，Tm-2 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 microRNA的相對(duì)表達(dá)量以 2-ΔΔCt法計(jì)算，公式: ΔΔCt =[(樣本 CtmicroRNA-樣本 Ct外參)-(對(duì)照組 CtmicroRNA-對(duì)照組Ct外參)]。組間比較采用t檢測(cè)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用受試者工作曲線(ROC曲線)及曲線下面積(AUC)評(píng)價(jià)miR-10b、miR-145及miR-155作為一種診斷方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1 miR-10b、miR-145及miR-155在乳腺癌患者與健康人血清中表達(dá)差異 熒光定量PCR檢測(cè)乳腺癌患者與健康對(duì)照組血清中的miRNA的表達(dá)水平，三種miRNA在乳腺癌患者血清中表達(dá)水平均上升，miR-10 b在病例組患者血清中的表達(dá)水平為[(6.824±0.194)，對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化為1]，miR-145在病例組患者血清中的表達(dá)水平為[(10.110±0.305),對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化為1]，miR-155在病例組患者血清中的表達(dá)水平為[(13.233±0.641)，對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化為1]，與對(duì)照組相比，P均<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 ROC曲線分析血清miR-10b、miR-145及miR-155對(duì)乳腺癌患者的診斷價(jià)值 以靈敏度為縱坐標(biāo)，誤診率(100-特異度)為橫坐標(biāo)在SPSS軟件上繪制ROC曲線圖，然后計(jì)算曲線下面積(AUC)。miR-10 b ROC曲線中AUC=0.936; miR-145 ROC曲線中AUC=0. 904，miR-155 ROC曲線中AUC=0.91，miR-10b、miR-145及miR-155對(duì)乳腺癌的診斷均有很好的準(zhǔn)確性。

2.3 miR-10b、miR-145及miR-155的表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 乳腺癌患者血清中miR-10 b相對(duì)表達(dá)量與臨床TNM分期有顯著相關(guān)性(P<0.05)， M期患者血清中miR-10b相對(duì)表達(dá)量高于T、N期;而乳腺癌患者血清中miR-145與miR-155相對(duì)表達(dá)量與臨床TNM分期無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清中miR-10b、miR-145和miR-155的相對(duì)表達(dá)水平高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0. 05) ; 乳腺癌患者血清中miR-10b、miR-145和miR-155相對(duì)表達(dá)量與年齡、組織學(xué)特征、雌激素受體狀態(tài)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 血清 miR-10b、 miR-145、miR-155表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病例參數(shù)的關(guān)系

2.3 miR-10b、miR-145及miR-155在不同病理分級(jí)乳腺癌組織中的表達(dá) 熒光定量PCR檢測(cè)乳腺癌病理組織中miR-10b、miR-145、miR-155的相對(duì)表達(dá)量，Ⅲ級(jí)乳腺癌病理組織中miR-10b、miR-145、miR-155相對(duì)表達(dá)量高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)患者，呈正相關(guān)，其中miR-155與病理分級(jí)相關(guān)性最好，病理分級(jí)越高，表達(dá)量越高。

3 討 論

miRNA是一類長(zhǎng)約22～25 bp的核糖核酸分子，miRNA能夠識(shí)別靶基因的3’UTR區(qū)，負(fù)向調(diào)控靶基因mRNA的降解，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的功能。血液中循環(huán)miRNA具有很好的穩(wěn)定性，可作為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物。

miRNA在多種惡性腫瘤中都有差異性表達(dá)，而且表達(dá)水平與組織病理學(xué)特征以及疾病的不同階段之間存在著密切關(guān)系。血液循環(huán)中的miRNA是由腫瘤細(xì)胞選擇性分泌的，腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞之間miRNA的表達(dá)譜存在巨大差異。miRNA在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起到類似于癌基因或抑癌基因的作用，腫瘤細(xì)胞中miRNA表達(dá)水平上調(diào)，則視為癌基因，反之則視為抑癌基因。本實(shí)驗(yàn)選取的三個(gè)miRNA在血清中表達(dá)水平均上調(diào)，而腫瘤組織中miR-155與腫瘤的病理分級(jí)呈正相關(guān)，在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中有正向調(diào)節(jié)作用。因?yàn)閙iRNA 在組織及血液中相對(duì)表達(dá)量甚微，實(shí)驗(yàn)選取的三指標(biāo)上調(diào)，相對(duì)于負(fù)向調(diào)節(jié)作用的miRNA，更容易被檢測(cè)到，為miR-10b、miR-145和miR-155成為乳腺癌腫瘤標(biāo)記物提供了幫助。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用添加miRNA外參檢測(cè)的方法，排除了常見(jiàn)內(nèi)參(U6)的差異帶來(lái)的影響，增加了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，miR-10b、miR-145和miR-155在乳腺癌患者血清中表達(dá)均明顯上調(diào)，三種miRNA表達(dá)水平均與腫瘤轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，但與年齡、組織學(xué)特征、ER表達(dá)無(wú)相關(guān)性，表明三種miRNA參與到腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中，但需要增加檢測(cè)臨床樣本量，同時(shí)詳盡的分子機(jī)制有待后續(xù)研究[7]。本研究還發(fā)現(xiàn)miR-10b與臨床分期顯著相關(guān)，M期乳腺癌患者血清中miR-10b的相對(duì)表達(dá)量明顯高于T、N期患者，但miR-145和miR-155卻與臨床分期無(wú)相關(guān)性。miR-145的ROC曲線下面積為0.936，miR-155的ROC曲線下面積為0.904，miR-10b的ROC曲線下面積為0.91，均高于0.9，表明三種miRNA具有很高的診斷價(jià)值。同時(shí)我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-10b，miR-145和miR-155在病理Ⅲ級(jí)乳腺癌患者腫瘤組織的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ-Ⅱ級(jí)乳腺癌患者癌組織的表達(dá)水平(P<0.05)，miR-155在乳腺癌患者腫瘤組織的表達(dá)水平與分期相關(guān)，病理分級(jí)越高，miR-155相對(duì)表達(dá)水平越高。miR-10 b、miR-145和miR-155的在乳腺癌患者血清中表達(dá)水平與乳腺癌的臨床病理標(biāo)本并不一致。綜上所述，miR-10b、miR-145和miR-155可能成為新一代的乳腺癌腫瘤標(biāo)志物。

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Clinical significance and expression level of microRNA-10b and microRNA-145 and microRNA-155 in the patients with breast cancer

YuJinyou,QiuJianling,ZhuZhengfeng,ZhouYing,GuWenlong.

DepartmentofInternalMedicine,AffiliatedofJianhuHospitalTumorCenter,NantongUniversityinJiangsu.Nantong224700,Jiangshu,China.

Objective To investigate the expression level of microRNA-10b(miR-10b), microRNA-145(miR-145)and microRNA-155(miR-155)in the pathological tissue and serum of patients with breast cancer, and to evaluate its value in the diagnosis of breast cancer. Methods Peripheral blood was collected from 100 healthy volunteers and 150 patients with breast cancer, and cancer tissue and adjacent tissue in 39 patients with breast cancer were collected. The expression levels of miR-145 and miR-10b were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. Then the correlation between the trend of miR-10b，miR-145 and miR-155 in serum and in tumor tissue was analyzed. Results The expression level of miR-10b, miR-145 and miR-10b in serum of patients with breast cancer was significantly higher than that in control group (P<0.05). The expression of three microRNAs were associated with tumor metastasis and not correlated with age, histological features and the expression of ER. The expression of miR-10b was significantly correlated with the clinical staging (P< 0.05), the area under ROC curve of miR-10b, miR-145 and miR-155 was respectively 0.936, 0.904 and 0.91. The expression of miR-10b, miR-145 and miR-155 in the breast cancer tumor tissue with stage Ⅲ was significantly higher than that of breast cancer tissue with Ⅰ～Ⅱ stage. Conclusion miR-10b, miR-145 and miR-155 may be used as tumor markers in early diagnosis of breast cancer.

microRNA； Breast cancer； Tumor stage

江蘇省衛(wèi)計(jì)委2014年重大課題招標(biāo)項(xiàng)目 (項(xiàng)目編號(hào)YG201418)

R737.9

A

1000-744X(2016)07-0683-03

2016-04-07)

△通信作者