MicroRNAs對胎兒血紅蛋白表達的調(diào)控作用*

杜 萌， 朱寶生， 呂 濤, △

(1昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500； 2云南省第一人民醫(yī)院遺傳診斷中心，云南 昆明 650032)

·綜 述·

MicroRNAs對胎兒血紅蛋白表達的調(diào)控作用*

杜 萌1， 朱寶生2， 呂 濤1, 2△

(1昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2云南省第一人民醫(yī)院遺傳診斷中心，云南 昆明 650032)

(1MedicalFaculty,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,China;2GeneticDiagnosisCenter,TheFirstPeople’sHospitalofYunnanProvince,Kunming650032,China.E-mail:taolv851109@126.com)

β-地中海貧血； 胎兒血紅蛋白； γ-珠蛋白； 微小RNA

微小RNA(microRNAs，miRNAs，miRs)是指一群小于22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因、染色體構(gòu)象改變、細(xì)胞增殖、分化以及凋亡[1]。這些單鏈RNA分子在細(xì)胞質(zhì)中與其它蛋白結(jié)合形成miRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(miRNA-induced silencing complex，miRISC)，再結(jié)合到靶基因mRNA的3’-UTR抑制其翻譯，通過這種方式miRs對細(xì)胞功能產(chǎn)生巨大影響，參與調(diào)節(jié)了血液疾病、感染、子宮內(nèi)膜病變及多種癌癥等疾病穩(wěn)態(tài)和病態(tài)之間的平衡[2-4]。

β-地中海貧血(簡稱β-地貧)是一組嚴(yán)重威脅人類健康的致死、致殘的遺傳性血液病，主要致病原因是位于11p15.3上編碼β-珠蛋白的基因發(fā)生缺陷(點突變?yōu)橹鳎贁?shù)發(fā)生缺失)，導(dǎo)致構(gòu)成血紅蛋白的β-肽鏈合成障礙(缺失、減少或異常)，α-肽鏈和β-肽鏈的比例失衡,過剩的α-肽鏈形成包涵體，沉積于紅細(xì)胞膜上，使紅細(xì)胞變形的能力降低，通過毛細(xì)血管時容易破裂；其次，過剩的α-肽鏈會誘導(dǎo)紅細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷，細(xì)胞骨架連接蛋白被氧化，導(dǎo)致膜與細(xì)胞骨架連接受阻，紅細(xì)胞機械穩(wěn)定性下降；另外，紅細(xì)胞內(nèi)過剩的游離α-肽鏈在紅細(xì)胞膜上沉積還可以誘導(dǎo)膜蛋白的聚集和自身抗體、補體的結(jié)合，這一系列變化加劇了紅細(xì)胞在循環(huán)中被清除，導(dǎo)致釋放到末梢血中的紅細(xì)胞減少，臨床上表現(xiàn)為不同程度的進行性溶血性貧血。與此同時，骨髓造血功能代償性增強，而新產(chǎn)生的紅細(xì)胞通過以上機制周而復(fù)始地被破壞，出現(xiàn)原位溶血，這一過程即無效造血。重型β-地貧患者80%的紅系祖細(xì)胞在髓內(nèi)死亡(正常人為10%～20%)，患者紅細(xì)胞生成的速度可達正常人的10倍，但其中95%以上均屬于上述的無效造血[5-6]。

目前，臨床上將提高胎兒血紅蛋白[fetal hemoglobin， HbF (α2γ2)]作為治療β-地貧的基本策略之一[6]。在正常人群中，HbF在胎兒時期含量高達90%，隨著胎兒出生，γ基因關(guān)閉，β基因開啟，HbF水平驟然下降，逐漸被成人血紅蛋白[adult hemoglobin， HbA (α2β2)]所替代，直至成人期基本低于0.6%[7]。對于β-地貧患者，β-珠蛋白基因缺陷是導(dǎo)致其發(fā)病的根本原因,而造成該病臨床癥狀的直接原因則是過剩的游離α-肽鏈沉積。而人γ-珠蛋白可以在一定程度上代替β-珠蛋白行使功能，若能激活γ基因表達，增加HbF含量，就能在功能上代償患者體內(nèi)β-珠蛋白不足的情況，達到平衡α-珠蛋白肽鏈/β-珠蛋白肽鏈的比例，改善組織供氧，緩解臨床癥狀的目的[8]。因此，尋找HbF相關(guān)的數(shù)量性狀靶標(biāo)是β-地貧治療策略的重點。近年來，隨著對miRs研究的不斷深入，miRs在地中海貧血等疾病過程中的表達情況和發(fā)揮的作用也逐漸揭示，一些研究通過對地中海貧血紅系分化過程中miRs表達譜的分析可以確定、篩選并鑒定出地中海貧血相關(guān)功能性miRs，目前已發(fā)現(xiàn)，miRs與珠蛋白基因表達關(guān)系密切，miRs可以在轉(zhuǎn)錄水平上直接或間接調(diào)節(jié)某些紅細(xì)胞特異基因[9-10]，在β-地貧和一些血紅蛋白病的治療中， 某些特異性的miRs通過調(diào)控KLF1、BCL11A和MYB等HbF相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，促使其與順式作用元件結(jié)合，激活γ珠蛋白基因，誘導(dǎo)HbF重新表達，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上對患者的血紅蛋白種類和含量進行調(diào)節(jié)，達到治療的作用[11-12]。這一系列的研究成果說明通過調(diào)節(jié)miRs表達水平，增加HbF含量，達到緩解β-地貧臨床癥狀的治療策略已成為這一領(lǐng)域的研究熱點。本文系統(tǒng)總結(jié)了β-地貧患者體內(nèi)miRs表達的變化以及miRs對γ-珠蛋白基因表達和HbF水平的影響，相關(guān)內(nèi)容詳述如下：

1 β-地貧相關(guān)microRNAs

有研究發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞特異的miR-144在β-地貧患者體內(nèi)高表達，它可以通過靶向轉(zhuǎn)錄因子GATA1, 增加γ-珠蛋白肽鏈的表達[13]。另一方面，β-地貧由于過剩的α-肽鏈形成包涵體，沉積于細(xì)胞膜上對紅細(xì)胞造成不同程度的損傷，因此，直接抑制α-珠蛋白基因表達的miRs可以緩解溶血性貧血的臨床表現(xiàn)。例如，miR-144，可以通過直接靶向轉(zhuǎn)錄因子KLFD(miR-144上的CACCC位點與KLFD以及α-珠蛋白基因啟動子相互結(jié)合，形成調(diào)控復(fù)合體)，從而達到阻止紅細(xì)胞裂解的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在β-地貧患兒體內(nèi)，miR-144負(fù)向調(diào)控了α-珠蛋白肽鏈/β-珠蛋白肽鏈的比例，這為通過抵消過剩的α-肽鏈沉積，緩解β-地貧臨床癥狀的治療方式提供了重要依據(jù)[14]。另外，miR-150是另一種抑制α-珠蛋白基因表達的候選miR，在紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨核細(xì)胞等細(xì)胞中承擔(dān)多項調(diào)節(jié)功能，它可以靶向轉(zhuǎn)錄因子MYB，調(diào)控紅系祖細(xì)胞的命運，目前已發(fā)現(xiàn)該miR在紅細(xì)胞分化及真性紅細(xì)胞增多癥中表達降低[15]。

地貧患者由于慢性溶血性貧血導(dǎo)致體內(nèi)長期缺氧，這種病理生理環(huán)境會引起機體一系列缺氧依賴的miRs過表達[16-17]，比如miR-210，有研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的β-地貧紅細(xì)胞及遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白增高癥(hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH)患者體內(nèi)miR-210均高表達，在缺氧誘導(dǎo)下的紅細(xì)胞生成中，miR-210可以增強轉(zhuǎn)錄因子GATA1、紅細(xì)胞Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子和血紅素生物合成的限速酶5-氨基酮戊酸合成酶2(5-aminolevulinate synthase 2，ALAS2)的表達，它還可以通過影響紅細(xì)胞分化過程中運鐵蛋白受體CD71和血型糖蛋白A的表達，增加γ-珠蛋白肽鏈合成，使得HbF含量升高，起到治療β-地貧的作用[18-19]。

研究發(fā)現(xiàn)，在β-地貧紅細(xì)胞中miR-503表達是下降的，CDC25A是miR-503的作用靶基因，與細(xì)胞周期、DNA損傷應(yīng)答密切相關(guān)，在正常情況下，miR-503通過抑制CDC25A，引導(dǎo)細(xì)胞周期靜止進而走向凋亡[20]。而在β-地貧患者體內(nèi)，miR-503表達下降，失去對CDC25A的抑制作用，與正常對照組相比，β-地貧突變細(xì)胞中CDC25A呈現(xiàn)1 000倍過表達，這正是造成無效造血的重要原因[21]。而誘導(dǎo)miR-503、miR-322/424或者某些缺氧依賴因子，比如miR-21、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21，都可以抑制CDC25A，從而達到阻止地貧紅系祖細(xì)胞和其它癌細(xì)胞增殖的目的[22]。

miR-451是調(diào)節(jié)紅細(xì)胞成熟的關(guān)鍵分子，在紅細(xì)胞生成中高表達，可以誘導(dǎo)CD133+細(xì)胞向紅細(xì)胞分化[23]，是另一種紅細(xì)胞特異性miR。在HbE/β-地貧細(xì)胞中，miR-451顯著高表達，可能參與了α-珠蛋白肽鏈、GPA和GATA1轉(zhuǎn)錄水平的降低，通過抑制GATA1, 增加γ-珠蛋白肽鏈合成，減緩地貧患者臨床癥狀[24]。除此之外，在其它血紅蛋白病和真性紅細(xì)胞增多癥中也發(fā)現(xiàn)了miR-451表達增加[25-26]。

基于以上miRs直接或間接與珠蛋白基因表達、紅細(xì)胞生成等密切相關(guān)，利用這些小的非編碼區(qū)的RNA調(diào)節(jié)地貧患者血紅蛋白組成及含量，改善其病理生理狀態(tài)、緩解臨床癥狀，可能成為新的地貧治療策略。

2 MicroRNA對γ-珠蛋白基因表達及胎兒血紅蛋白HbF水平的影響

血紅蛋白四聚體由分別位于16和11號染色體上的α、β-類珠蛋白基因編碼產(chǎn)生的α、β-珠蛋白肽鏈按1:1的比例結(jié)合構(gòu)成。α-珠蛋白基因簇上包括ζ2、α1、α2和幾個假基因，β-珠蛋白基因簇上包括γ、β、δ、ε和一個假基因。位于ε基因上游含有5個核酸內(nèi)切酶高敏位點的順式作用元件LCR及基因重排共同調(diào)控著β-珠蛋白基因簇基因間表達的轉(zhuǎn)換[27]。在胎兒發(fā)育過程中，β-珠蛋白基因表達發(fā)生了2次轉(zhuǎn)換，第一次是ε基因被γ基因取代，主要發(fā)生在孕周11周左右，首先在胎兒肝臟中產(chǎn)生HbF(α2γ2)；另一次是隨著胎兒的出生β基因逐漸取代了γ基因，致使HbF含量降低，HbA增加[28]。γ、β基因間起轉(zhuǎn)換調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子主要有KLF1、BCL11A和MYB，這些轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)了γ基因的沉默[29-30]。在造血干細(xì)胞發(fā)育成成熟紅細(xì)胞的過程中，miRs在不同階段表達差異較大，例如，在紅細(xì)胞分化過程中，miR-451表達升高，而miR-150/-155/-221/-222則下降，這些特異性的miRs對上述HbF生成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子直接或間接起到有效的調(diào)節(jié)作用[10]。

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，多年持續(xù)增加γ基因表達，提高β-地貧患者的HbF水平可以有效緩解這些病人臨床癥狀，目前，應(yīng)用較廣的治療藥物是羥基脲，有研究表明，它可以誘導(dǎo)體內(nèi)miR-26b/-151-3p/-148a/-494的表達，其中miR-26b和miR-151-3p介導(dǎo)了HbF的增加[12, 31]。

對臍帶血和成人外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞中miRs表達進行比較發(fā)現(xiàn)，二者在miR-96、 miR-888、 miR330-3p、 let-7a 和 miR-146a表達上均存在較大差異，其中miR-96可以有效抑制γ-珠蛋白基因的表達，在成人紅細(xì)胞中表達量很高，它與AGO2蛋白相互作用形成miRISC復(fù)合物阻止γ-珠蛋白mRNA的翻譯，在成人紅細(xì)胞生成中對HbF起重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[32]。

另有一些miRs可以正調(diào)控γ-珠蛋白基因的表達，BCL11A是γ-珠蛋白基因抑制子，在γ、β-珠蛋白表達轉(zhuǎn)換中起重要的開關(guān)作用，Lin28B，可以通過抑制BCL11A，上調(diào)了γ-珠蛋白基因的表達，和let-7家族相互作用共同參與了胎兒至成人紅細(xì)胞的發(fā)展過程[33]。miR-486-3p也可以與BCL11A的3’UTR結(jié)合起到直接的抑制作用，從而阻止了γ-珠蛋白基因的沉默，因此，Lin28B和miR-486-3p都是通過轉(zhuǎn)錄后抑制BCL11A表達促進了成人紅細(xì)胞HbF合成的[34]。

有研究偶然發(fā)現(xiàn)，13-三體綜合征患者體內(nèi)miR-15a/16-1表達升高，會引起HbF負(fù)調(diào)節(jié)子MYB表達的下調(diào)，有效地維持了HbF持續(xù)性表達，延長了胎兒期至成人期血紅蛋白種類的轉(zhuǎn)換。這說明，在早起紅細(xì)胞發(fā)育階段，miR-15a/16-1可以通過抵抗轉(zhuǎn)錄因子MYB消除其對γ-珠蛋白基因的抑制作用，從而達到增加HbF表達的作用[35]。因此，MYB被認(rèn)為是β-地貧一個重要的治療靶點，而對其起到調(diào)節(jié)作用的miRs為下一步針對診療β-地貧和某些血紅蛋白病的藥物開發(fā)提供了新思路[36]。

SP/KLF家族是一大類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,典型結(jié)構(gòu)特征是在其羧基端具有3個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及胚胎發(fā)育等多個生命活動的調(diào)控，可與DNA上CACCC/GC/GT序列特異結(jié)合調(diào)節(jié)紅細(xì)胞分化和珠蛋白基因表達[37-38]。其中，SP1和KLF3可以與β-珠蛋白基因簇上游的LCR區(qū)結(jié)合，是特異性調(diào)節(jié)β-珠蛋白基因簇表達的轉(zhuǎn)錄因子。過表達的SP1可以下調(diào)ε、γ-珠蛋白基因的表達，而SP1是miR-23a的下游靶標(biāo)，miR-23a能夠通過抑制SP1的表達而引起ε、γ-珠蛋白基因表達的增加。KLF3是紅細(xì)胞生成的負(fù)調(diào)節(jié)子，對γ-珠蛋白基因存在抑制作用，它也是miR-23a的下游靶標(biāo)，同時還受miR-27調(diào)控。因此，miR-23a/27a可以通過顯著抑制2種β-珠蛋白基因簇的負(fù)調(diào)節(jié)子SP1和KLF3，達到激活γ-珠蛋白基因、上調(diào)HbF表達的作用[39]。

有研究發(fā)現(xiàn)，在紅細(xì)胞生成過程中，Kit配體(Kit ligand，KL)濃度和HbF合成間存在直接的正向關(guān)系，KL可以通過重新激活HbF合成來調(diào)控不同血紅蛋白表達的轉(zhuǎn)換[40]。miR-221/-222以與Kit 3’-UTR區(qū)結(jié)合的方式靶向Kit，抑制KL介導(dǎo)的HbF合成，減慢紅細(xì)胞增殖及分化[41]。相反地，如果對β-地貧患者采用外源KL或miR-221/-222的拮抗劑，則可以增加γ-珠蛋白肽鏈的表達，促進HbF生成，進一步說明了miR-221/-222是通過抑制KL而達到對HbF合成的負(fù)調(diào)節(jié)作用[42]。

GATA1是介導(dǎo)血細(xì)胞(血小板、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞及紅細(xì)胞等)生成的重要轉(zhuǎn)錄因子。在胚胎期，GATA1通過影響細(xì)胞分裂、凋亡及成熟相關(guān)基因的表達，對紅細(xì)胞生成的晚期階段起到重要的調(diào)控作用[43]。研究發(fā)現(xiàn)，在紅細(xì)胞生成過程中，轉(zhuǎn)錄因子GATA1的表達受一些特定的miRs調(diào)控，比如，在紅細(xì)胞成熟階段，它受表達量增多的miR-26b/-144/-451的調(diào)節(jié)[44]。相較γ-珠蛋白基因，miR-451對α、β-珠蛋白基因表達的調(diào)控更有效，而miR-26b則特異性地增加了β、γ-珠蛋白基因表達[13]。

另外，在缺氧環(huán)境下，伴隨紅系祖細(xì)胞分化成紅細(xì)胞以及缺氧誘導(dǎo)因子1的生成，miR-210表達增加，它可以通過激活成熟紅系祖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，建立缺氧環(huán)境與紅細(xì)胞生成間的聯(lián)系，促使γ-珠蛋白基因表達[18]。因此，這種缺氧依賴的miR可以作為誘導(dǎo)HbF生成，緩解β-地貧癥狀的藥物靶點[16, 45]。

3 總結(jié)及展望

地中海貧血是一種由珠蛋白基因缺失或點突變所致的典型的單基因遺傳病，不同程度地流行于全球60%的國家，全球地貧流行最嚴(yán)重的地區(qū)為東南亞、印度半島東南部、中東和非洲環(huán)撒哈拉地區(qū)。在我國，地貧以云南、貴州、四川、廣西、廣東 和海南等地發(fā)病率較高，目前國內(nèi)外治療方法局限性較大。隨著高通量測序技術(shù)和miRs芯片分析技術(shù)的發(fā)展，miRs在地貧治療中的作用受到越來越多的重視，通過以上方法可以篩選出疾病相關(guān)異常表達miRs，再通過大樣本量實時熒光定量PCR驗證和后續(xù)靶基因預(yù)測分析及靶蛋白表達的檢測等分子生物學(xué)技術(shù)，能夠更深入地揭示地中海貧血相關(guān)miRNA的表達情況和相關(guān)機制，本文針對β-地貧，涉及多種miRs及其作用靶點，以及對珠蛋白基因表達的影響，如表1所示，miRs對不同階段珠蛋白基因表達的調(diào)控至關(guān)重要。通過技術(shù)手段特異性地調(diào)節(jié)相關(guān)miRs，從而直接或間接重新激活γ-珠蛋白基因，在轉(zhuǎn)錄后水平上提高患者體內(nèi)HbF的生成，代償性地上調(diào)β-類珠蛋白肽鏈不足的情況，有望更加有效地緩解和改善由β-珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致的地貧及血紅蛋白病患者的臨床癥狀，miRs對γ-珠蛋白基因表達及HbF水平影響方面的研究進展將為這一治療策略的深入研究及廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Regulatory role of microRNAs in fetal hemoglobin level

DU Meng1, ZHU Bao-sheng2, Lü Tao1, 2

MicroRNAs (miRs) play an important role in regulating diverse cellular processes. It has been reported that miRs are associated with the formation and maturation of erythrocytes, and the expression of globin genes at post-transcriptional level. Compared with normal human enrythrocytes, various miRs are altered in the patients with thalassemia. These changes also happen in the patients with diverse clinical manifestations. In this paper, we systematically summarized the recent progress about the expression dysregulation of miRs in β-thalassemia and their roles in regulating the levels of γ-globin and fetal hemoglobin. During β-like globin gene expression, miRs directly or indirectly regulate the levels of erythroid-specific transcription factors through post-transcriptional action, such as B-cell lymphoma 11A (BCL11A), myeloblastosis oncogene (MYB), specificity protein 1 (Sp1), Kruppel-like factor 3 (KLF3) and GATA1. These effects subsequently regulate the switch between γ- and β-globin gene expression and affect fetal hemoglobin production. Targeting miRs might be a novel therapeutic strategy for β-thalassmeia.

β-Thalassmeia； Fetal hemoglobin； γ-Globin； MicroRNAs

1000- 4718(2017)05- 0956- 05

2016- 10- 25

2017- 03- 17

云南省科技計劃項目(No. 2014FB096)；昆明理工大學(xué)自然科學(xué)研究基金資助項目(No. KKZ3201460022)

R556； R363.2+1; R394

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.032

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