藥用野生稻胚拯救后代YF2快繁技術(shù)

王 芳，原文霞，鮑根良，錢長根，黃 堅，劉 健，楊 勇，嚴成其，陳劍平*

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 寧波 315040； 2.嘉興職業(yè)技術(shù)學院，浙江 嘉興 314000;3.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021)

藥用野生稻胚拯救后代YF2快繁技術(shù)

王 芳1，原文霞3，鮑根良3，錢長根2，黃 堅1，劉 健1，楊 勇3，嚴成其3，陳劍平3*

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 寧波 315040； 2.嘉興職業(yè)技術(shù)學院，浙江 嘉興 314000;3.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021)

取藥用野生稻胚拯救后代的幼芽1～2 cm，經(jīng)70%酒精消毒30 s，0.1%升汞搖動消毒8 min及無菌水洗3～5次后，將其放在誘導培養(yǎng)基MS+2, 4-D 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 0.1～0.5 mg·L-1中培養(yǎng)，胚性愈傷組織的誘導率為31%；然后轉(zhuǎn)入MS+IAA 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 2.0～4.0 mg·L-1+KT 1.0～2.0 mg·L-1分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，成苗率為62%。成苗后轉(zhuǎn)入1/2 MS+IAA 0.02～0.5 mg·L-1生根培養(yǎng)基中，生根率達到99%。煉苗7 d后移栽到苗床，成活率達到90%。短期內(nèi)可實現(xiàn)胚拯救后代YF2組培苗健康及快繁生長，為創(chuàng)制水稻新種質(zhì)和研究抗病蟲新基因克隆和利用奠定基礎。

藥用野生稻； 胚拯救； 組織培養(yǎng)； 快繁

野生稻是一種寶貴的自然資源，它含有栽培稻所沒有的或已經(jīng)丟失的豐富的優(yōu)異基因，藥用野生稻是我國現(xiàn)存的3種野生稻之一，前期研究結(jié)果表明，藥用野生稻對灰飛虱具有很強的抗性和排驅(qū)性[1-4]。由于藥用野生稻和普通栽培稻分屬不同物種，藥用野生稻染色體組CC型，栽培稻染色體組AA型，用常規(guī)的有性雜交方法不結(jié)實[5]。為了充分利用藥用野生稻資源，課題組采用藥用野生稻和栽培稻通過胚拯救技術(shù)獲得了胚拯救后代YF2，實現(xiàn)藥用野生稻的遺傳物質(zhì)向栽培稻轉(zhuǎn)移。為挖掘具有自主產(chǎn)權(quán)的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆、養(yǎng)分高效等重要優(yōu)良品種資源奠定基礎[6-8]。

但是在具體的研究中缺少遺傳背景一致的藥用野生稻胚拯救后代，難以進行抗性基因的研究和新種質(zhì)的育種利用，組培快繁技術(shù)增殖速度快，生產(chǎn)周期短，繁殖系數(shù)高，可在短期內(nèi)實現(xiàn)遺傳性一致的藥用野生稻胚拯救后代規(guī)模化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

藥用野生稻胚拯救后代YF2來源于浙江省農(nóng)業(yè)科學院病毒學與生物技術(shù)研究所溫室。

1.2 方法

1.2.1 材料的采集與消毒

取藥用野生稻胚拯救后代YF2幼芽1～2 cm，經(jīng)70%乙醇消毒30 s，0.1%氯化汞加1滴，搖動消毒8 min，然后無菌水洗3～5次。

1.2.2 愈傷組織的誘導和胚性細胞的形成

取消毒后的藥用野生稻胚拯救后代YF2幼芽，剪成0.1～0.2 mm，置于誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷組織。通常每隔3周挑選胚性愈傷組織或質(zhì)量好的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)。預培養(yǎng)、誘導和繼代培養(yǎng)基均為MS+2, 4-D 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 0.1～0.5 mg·L-1，在(25±2)℃暗培養(yǎng)。適量增加糖、瓊脂的濃度，并添加谷氨酰胺。部分非胚性愈傷組織能誘導胚性愈傷組織。

1.2.3 胚性細胞分化成小苗

將誘導出的胚性細胞接種在MS+2, 4-D 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 2.0～4.0 mg·L-1+KT 1.0～2.0 mg·L-1分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，光強2 000～3 000 lx，光照16 h·d-1。

1.2.4 生根培養(yǎng)

將小苗接種于1/2 MS+IAA 0.3～1.0 mg·L-1培養(yǎng)基，置于25 ℃，光照強度2 000 lx，光照時間16 h·d-1的環(huán)境中培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計植株高度、葉片數(shù)、根數(shù)等生長情況。

1.2.5 煉苗及移栽

待小苗在培養(yǎng)基中長至10 cm后，直接打開培養(yǎng)瓶蓋，加入少量純凈水，水量以高過培養(yǎng)基2 cm為宜，定時觀察續(xù)水；7 d后用溫水將小苗充分洗凈，然后置于內(nèi)含10 mL 1/2 MS+0.3 mg·L-1IAA水溶液的三角瓶中，7 d后移栽到苗床。苗床要求：移栽前充分泡水保證有機質(zhì)、氮、磷、鉀養(yǎng)分充足。移栽后覆膜保濕，7 d內(nèi)每天中午揭膜透氣，后期可逐步揭開，15 d后移栽至大田。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導和胚性細胞的形成

將剪成0.1～0.2 mm的藥用野生稻胚拯救后代接種到MS+2, 4-D 1.0～3.0 mg·L-1+6-BA 0.1～0.5 mg·L-1誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)。1個月后不同程度地誘導出愈傷組織，初次誘導出的愈傷組織，有些是非胚性的。若繼代培養(yǎng)基中糖和瓊脂的濃度分別超過35、9 g·L-1，同時添加350 mg·L-1谷氨酰胺，能使部分愈傷組織轉(zhuǎn)變成小顆粒狀、易碎的胚性愈傷組織。

在同一培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)2個月左右能誘導出胚性愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)可建成分散性好、色澤鮮黃、細胞質(zhì)濃、具有旺盛分裂能力的胚性細胞。其中，最佳誘導胚性細胞的配方是MS+2.5 mg·L-12, 4-D+0.3 mg·L-16-BA，誘導率達到31%。

2.2 不同激素濃度對胚拯救后代胚性細胞再生苗的影響

設10組含有不同濃度激素的MS培養(yǎng)基，每組培養(yǎng)基接50個胚性細胞，60 d后觀察結(jié)果(表1)。結(jié)果表明，MS+0.5～4.0 mg·L-1IAA+0.5～4.0 mg·L-16-BA+0.5～2.6 mg·L-1KT均可誘導成苗，成苗率達到4%～62%，其中最佳培養(yǎng)基配方為MS+3.0 mg·L-1IAA+3.0 mg·L-16 BA+2.0 mg·L-1KT，其成苗率可達62%。

2.3 生根培養(yǎng)

將再生的小苗接種至1/2 MS+1.0～3.0 mg·L-1IAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均能長出根莖葉完整的水稻植株，30 d后生根率達到99%，但是生長在1/2 MS+1.0 mg·L-1IAA培養(yǎng)基的水稻再生植株徒長，最佳的生根培養(yǎng)基應該是1/2 MS+3.0 mg·L-1IAA。

2.4 煉苗及移栽

由于組培苗在形態(tài)和生理結(jié)構(gòu)上與自然生長苗存在一定差異，為了適應移栽后的自然環(huán)境，需要由異養(yǎng)逐步過渡到自養(yǎng)，生長環(huán)境由無菌變?yōu)橛芯?，溫光條件也發(fā)生顯著變化。

研究表明，煉苗7 d后，10～15 cm的再生小植株直接移栽到保持濕度的苗床中，1周后成活率達90%。

3 小結(jié)與討論

植物生長調(diào)節(jié)劑是影響水稻愈傷組織誘導和胚性細胞形成的關(guān)鍵因素之一，2, 4-D是誘導水稻組織產(chǎn)生愈傷組織不可缺少的關(guān)鍵激素成分。但是，當2, 4-D濃度大于4 mg·L-1或小于1 mg·L-1時都不利于水稻拯救后代愈傷和胚性細胞的形成。已建成的胚性細胞，繼代時間過長時，胚性會減弱，表現(xiàn)為部分細胞團開始解體，細胞團周邊細胞的表面變得粗糙，出現(xiàn)不規(guī)則顆粒狀突起，甚至有非胚性的細胞。初次誘導出的愈傷組織，有些是非胚性的，若繼代培養(yǎng)基中糖、瓊脂的濃度大于35和10 g·L-1，同時添加350 mg·L-1谷氨酰胺，能使愈傷組織轉(zhuǎn)變成小顆粒狀、易碎的胚性愈傷組織。愈傷組織的色澤、外表對再生頻率有影響，一般色澤淺白、花菜形狀、結(jié)構(gòu)緊密的胚性愈傷組織容易變綠，長出綠芽。小植株在移栽之前必須經(jīng)過煉苗，苗床煉苗時間不宜過長，否則組培苗生長過大、根系過長，移栽至大田時容易構(gòu)成二次損傷。

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[2] 胡婷婷, 王健康, 丁成偉, 等. 粳稻花培苗移栽技術(shù)及田間管理措施[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學, 2015, 43(7): 79-80.

[3] 董巖, 錢長根, 張維林, 等. 藥用野生稻體細胞雜交后代對條紋葉枯病的抗性鑒定[J]. 生物技術(shù)通訊, 2013 (5): 682-684.

[4] ZHANG W, DONG Y, YANG L, et al. Small brown planthopper resistance loci in wild rice (Oryzaofficinalis)[J]. Molecular Genetics and Genomics, 2014, 289(3): 373-382.

[5] 翁錦屏, 謝關(guān)林, 諸葛根樟,等. 浙江省水稻白葉枯病病菌區(qū)系分布及其分化的研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學, 1985 (2): 70-76.

[6] 陳劍平, 袁群英, 孫麗萍. 依靠科技進步提高浙江省糧食生產(chǎn)能力的對策建議[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學, 2014 (9): 1317-1322.

[7] YAN C Q, QIAN K X, YAN Q S, et al. Use of asymmetric somatic hybridization for transfer of the bacterial blight resistance trait fromOryzameyeriana L. toO.sativaL. ssp.japonica[J]. Plant Cell Reports, 2004, 22(8): 569-575.

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(責任編輯：侯春曉)

2017-01-20

浙江省自然科學基金(2014C140001)；浙江省重大攻關(guān)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)多抗水稻新品種選育項目(2012C12901-2)；寧波市重大科技項目(2016C11017)

王 芳(1981—)，女，浙江寧波人，農(nóng)藝師，從事良種生物育種與推廣工作，E-mail: wangfang811028@163.com。

陳劍平，研究員，博士，E-mail: jpchen2001@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170430

S511

B

0528-9017(2017)04-0642-02

文獻著錄格式：王芳，原文霞，鮑根良，等. 藥用野生稻胚拯救后代YF2快繁技術(shù)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2017，58(4)：642-643，647.