自制沙眼衣原體、肺炎衣原體和肺炎支原體核酸檢測(cè)試劑的性能評(píng)價(jià)

王偉偉周林福鐘 磊*

（1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究室，浙江 杭州 310058；2 桐鄉(xiāng)市中醫(yī)醫(yī)院，浙江 桐鄉(xiāng) 314500）

自制沙眼衣原體、肺炎衣原體和肺炎支原體核酸檢測(cè)試劑的性能評(píng)價(jià)

王偉偉1周林福1鐘 磊2*

（1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究室，浙江 杭州 310058；2 桐鄉(xiāng)市中醫(yī)醫(yī)院，浙江 桐鄉(xiāng) 314500）

目的評(píng)價(jià)自主開(kāi)發(fā)針對(duì)嬰幼兒感染的沙眼衣原體、肺炎衣原體和肺炎支原體的多重核酸檢測(cè)試劑的性能。方法采用熒光定量PCR儀，進(jìn)行準(zhǔn)確度、靈敏度、最低檢測(cè)線及穩(wěn)定性的性能評(píng)價(jià)，與金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果通過(guò)臨床樣本檢測(cè)，對(duì)比金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序法，自主研發(fā)的試劑盒操作具有靈敏度高、準(zhǔn)確高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。結(jié)論試劑盒的指標(biāo)基本達(dá)到了國(guó)內(nèi)臨床診斷試劑所要求的主要性能指標(biāo)，可以滿足臨床樣本的診斷，是一種值得推廣的診斷試劑。

沙眼衣原體；肺炎衣原體；肺炎支原體；熒光定量PCR；檢測(cè)試劑

肺炎衣原體（chalamydia pneumoniae，C.pn）屬于嚴(yán)格的人類病原體，傳染途徑是呼吸道分泌物，擴(kuò)散較為緩慢，潛伏期長(zhǎng)（平均30 d），其感染可引起呼吸系統(tǒng)疾病，如肺炎、咽炎、喉炎、支氣管炎等。肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是一種常見(jiàn)的呼吸道病原體，通常導(dǎo)致輕微的上呼吸道感染，如喉嚨痛、咽喉炎和氣管炎，其引起的肺炎占非細(xì)菌性肺炎的50%，還可引起肺外并發(fā)癥，其潛伏期較長(zhǎng)（2～3周），通過(guò)飛沫以氣溶膠形式傳播，存留在鼻、喉、氣管和痰液中，密切接觸可能引起肺炎支原體的暴發(fā)。沙眼衣原體（chlamydia trachomatis，CT）引起多種疾病，如沙眼，人類泌尿生殖道疾病，還可以通過(guò)母嬰傳播新生兒眼結(jié)膜炎、肺炎，并可導(dǎo)致胎膜早破、早產(chǎn)、新生兒死亡等，也是導(dǎo)致嬰兒下呼吸道感染及黃疸的主要原因之一[1-2]。

本研究采用熒光PCR技術(shù)檢測(cè)沙眼衣原體、肺炎衣原體和肺炎支原體核酸，操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速、檢出率高，通過(guò)一次試驗(yàn)即可明確是否屬3種病原體感染及何種病原體感染，有利于疾病的及時(shí)診斷及合理選擇治療方案，與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)及血清學(xué)等檢測(cè)技術(shù)相比，提高了檢出效率、降低了漏檢率。

1 材料與方法

1.1 儀器：ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2 試劑：自主研發(fā)的沙眼衣原體、肺炎衣原體和肺炎支原體檢測(cè)試劑盒，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)合Taqman熒光探針，對(duì)人痰液樣本中沙眼衣原體、肺炎衣原體和肺炎支原體核酸進(jìn)行定性檢測(cè)。

1.3 臨床樣本：本研究所采用的兒童痰液樣本由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院提供；帶狀皰疹病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、鼻病毒為病毒培養(yǎng)物，由浙江疾病預(yù)防控制中心提供；鏈球菌、金黃色葡萄球菌和肺炎球菌為臨床陽(yáng)性樣本，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院提供；HCV為臨床陽(yáng)性樣本，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院提供；HBV為臨床陽(yáng)性樣本，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院提供。

1.4 測(cè)定方法：采用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，設(shè)置條件為50 ℃、2 min使UNG酶發(fā)揮作用；95 ℃、2 min進(jìn)行預(yù)變性；91 ℃、15 s，58 ℃、60 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在58 ℃、60 s階段收集熒光信號(hào)。

1.5 靈敏度分析：將Ct值相差2以內(nèi)的沙眼衣原體陽(yáng)性樣本、肺炎衣原體陽(yáng)性樣本和肺炎支原體陽(yáng)性樣本等體積混勻，采用生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別稀釋10倍和100倍，將試劑每一梯度進(jìn)行10次重復(fù)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)在ABI7500儀器上進(jìn)行，以分析產(chǎn)品的靈敏度。

1.6 最低檢測(cè)限確認(rèn)：抽提質(zhì)控品的質(zhì)粒DNA，Nonadrop儀器測(cè)DNA的濃度，換算得到拷貝數(shù)，將此DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后進(jìn)行擴(kuò)增，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到臨床樣本中病毒載量。將各樣本濃度稀釋至500 copies/mL左右，對(duì)此濃度的樣本進(jìn)行10次重復(fù)檢測(cè)。

1.7 準(zhǔn)確度分析：采用與金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序的方法來(lái)驗(yàn)證試劑的準(zhǔn)確度，選擇沙眼衣原體樣本、肺炎衣原體樣本和肺炎支原體樣本各3例，將本自主研發(fā)的試劑和測(cè)序進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行準(zhǔn)確度分析。

1.8 特異性分析：本試劑在ABI7500儀上進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)臨床陰性樣本，另檢測(cè)具有相同感染部位或相似臨床癥狀的病毒樣本，如皰疹病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、鼻病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、鏈球菌、金黃色葡萄球菌和肺炎球菌等。

1.9 精密度分析：將Ct值相差2以內(nèi)的、較低濃度的沙眼衣原體陽(yáng)性樣本、肺炎衣原體陽(yáng)性樣本和肺炎支原體陽(yáng)性樣本等體積混勻，用該自主研發(fā)的試劑對(duì)此混合樣本進(jìn)行10次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算變異系數(shù)，以確定批間和批內(nèi)精密度。

1.10 抗干擾試驗(yàn)：本試劑在ABI7500熒光定量PCR儀上，對(duì)痰液樣本中可能存在的干擾物質(zhì)進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。

根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)發(fā)布的《社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南》。目前，對(duì)于支原體和衣原體的感染治療，臨床應(yīng)用較多的藥物是大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類，因此，選用阿奇霉素、阿莫西林和羅紅霉素作為可能存在的治療藥物進(jìn)行驗(yàn)證，藥物濃度分別為0.15 g/L、0.2 g/L、0.03 g/L。另，選擇樣本中較常見(jiàn)的異常病理成分血和膿液進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，即在樣本中添加10%的血清和5%的膿液進(jìn)行抗干擾試驗(yàn)。

1.11 四色熒光相互干擾試驗(yàn)：本試劑需要采用FAM、VIC、CY5和ROX四種熒光進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中，CY5指示內(nèi)標(biāo)，F(xiàn)AM熒光指示沙眼衣原體（CT），VIC熒光指示肺炎支原體（MP），ROX熒光指示肺炎衣原體（CP）。為驗(yàn)證4種熒光之間是否存在相互干擾，采用該試劑在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 靈敏度分析：本試劑使用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)樣本的Ct值＞35左右時(shí)，10次重復(fù)不能100%檢出陽(yáng)性。

2.2 最低檢測(cè)限確認(rèn)：將各樣本濃度稀釋至500 copies/mL左右，對(duì)此濃度的樣本使用試劑在ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行10次重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，10次重復(fù)能夠100%檢出。

2.3 準(zhǔn)確度分析：將選擇的每個(gè)病原體陽(yáng)性樣本3例，使用試劑在ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，然后樣本經(jīng)過(guò)測(cè)序所得序列經(jīng)Blast比對(duì)，樣本對(duì)應(yīng)的肺炎衣原體、肺炎支原體還是沙眼衣原體，與試劑檢測(cè)結(jié)果符合率100%。

2.4 特異性分析：本試劑分別在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)50份臨床陰性樣本，陰性符合率是100%，另檢測(cè)具有相同感染部位或相似臨床癥狀的病毒樣本，如皰疹病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、鼻病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、鏈球菌、金黃色葡萄球菌和肺炎球菌等，檢測(cè)結(jié)果均是陰性。

2.5 精密度分析：選用三批試劑，對(duì)內(nèi)標(biāo)、CT、CP和MP分別進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)10次，計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、批內(nèi)精密度、批間精密度。檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)得出，批間變異系數(shù)在3.25%～7.64%，批內(nèi)變異系數(shù)在0.58%～2.12%，說(shuō)明了本試劑盒具有良好的批間和批內(nèi)精密度。

2.6 抗干擾試驗(yàn)：臨床樣本均為痰液樣本，將不添加任何物質(zhì)的樣本的原始樣本，分別添加血液、膿液、阿奇霉素、羅紅霉素和阿莫西林[3-4]。計(jì)算添加了干擾物的樣本的檢測(cè)值與原始樣本的檢測(cè)值之間的平均值。從結(jié)果可以看出，0.15 g/L的阿奇霉素、0.2 g/L阿莫西林、0.03 g/L羅紅霉素、10%血清和5%膿液對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均沒(méi)有顯著影響。

2.7 四色熒光相互干擾試驗(yàn)：將Ct值相差2以內(nèi)的肺炎支原體陽(yáng)性樣本、肺炎衣原體陽(yáng)性樣本和沙眼衣原體陽(yáng)性樣本等體積混合后進(jìn)行檢測(cè)，單一樣本用2倍體積同類型陰性樣本稀釋后檢測(cè)。各種不同濃度梯度的樣本混合后進(jìn)行檢測(cè)，與單一樣本檢測(cè)之間的CV值在6%以內(nèi)，表示沒(méi)有顯著差異，即各種熒光之間沒(méi)有干擾。

3 討 論

自開(kāi)發(fā)的試劑，通過(guò)臨床樣本檢測(cè)，對(duì)產(chǎn)品性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，自主研發(fā)的試劑盒操作具有靈敏度高、準(zhǔn)確高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，達(dá)到了國(guó)內(nèi)臨床診斷試劑所要求的主要性能指標(biāo)，可以滿足臨床樣本的核酸診斷，是一種值得推廣的診斷試劑。

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1671-8194（2017）20-0031-02

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