LAMP技術研究進展及其在動物疫病檢測中的應用

徐淑菲，孔繁德，苗 麗，蔡振鴻，林振基，趙 冉

（1. 廈門出入境檢驗檢疫局，福建廈門 361026；2. 河南出入境檢驗檢疫局，河南鄭州 450003；3. 廈門市思明區(qū)市政管理中心，福建廈門 361010；4. 廈門市農產品質量安全檢驗測試中心，福建廈門 361000）

LAMP技術研究進展及其在動物疫病檢測中的應用

徐淑菲1，孔繁德1，苗 麗2，蔡振鴻3，林振基1，趙 冉4

（1. 廈門出入境檢驗檢疫局，福建廈門 361026；2. 河南出入境檢驗檢疫局，河南鄭州 450003；3. 廈門市思明區(qū)市政管理中心，福建廈門 361010；4. 廈門市農產品質量安全檢驗測試中心，福建廈門 361000）

本文從技術原理、研究進展及在動物疫病檢測中的應用三個方面對環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術進行了闡述。與普通PCR、熒光定量PCR相比，LAMP技術具有不需要精密儀器、肉眼即可判定、操作簡單、所用時間短、靈敏度高等優(yōu)點，在水生和陸生動物的細菌病、病毒病、寄生蟲病的檢測中得到廣泛應用。LAMP技術與其他技術的聯(lián)合應用以及LAMP檢測儀器的出現(xiàn)，更加促進了LAMP技術的發(fā)展和應用。

環(huán)介導等溫擴增技術；檢測；發(fā)展；應用

目前的動物疫病檢測方法包括傳統(tǒng)的形態(tài)學和生化方法、分離鑒定方法、免疫學方法、分子生物學方法、蛋白質指紋圖譜分析方法等。隨著基因組測序工作的完成，分子生物學方法作為一種快速檢測病原菌的手段得到廣泛應用，如核酸探針技術、PCR技術、熒光定量PCR方法、生物芯片技術、LAMP技術等。核酸雜交、PCR等方法應用廣泛，但在實際運用中，還存在一些難以克服的問題，如假陽性、引物二聚體非特異性擴增，以及片狀拖帶、涂抹帶，等等。

LAMP技術即環(huán)介導的等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplifcation，LAMP），因其不需要PCR儀和昂貴的試劑，目前已被廣泛應用于腫瘤篩選、植物病毒檢測、轉基因食品檢測、動物胚胎性別鑒定、水生和陸生動物的細菌性及病毒性疫病檢測等[1]。

與普通PCR、熒光定量PCR技術相比，LAMP的優(yōu)點突出：（1）不需要昂貴的精密儀器，恒溫狀態(tài)即可；（2）擴增效率高，能夠獲得大量擴增產物；（3）具有高特異性；（4）通過添加Loop引物，可以加快反應，縮短一半的時間；（5）因擴增產生大量的副產物焦磷酸鎂白色沉淀，肉眼即可觀察結果，也可借助于斑點雜交或橫向流動試紙條等方法輔助結果檢測。

1 LAMP原理

LAMP是2000年由日本研究人員Notomi等發(fā)明的一種新型的體外等溫擴增特異核酸片段的技術。其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60～65 ℃恒溫擴增，15～60分鐘左右即可實現(xiàn)109～1010倍的核酸擴增，具有操作簡單、特異性強、產物易檢測等特點。在DNA合成時，從脫氧核糖核酸三磷酸底物（dNTPs）中析出的焦磷酸離子與反應溶液中的鎂離子反應，產生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現(xiàn)白色，因此可以把渾濁度作為反應的指標，只用肉眼觀察白色渾濁沉淀，就能鑒定擴增與否，而不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。

1.1 LAMP引物的設計

基于靶基因3'端的F3c、F2c和Flc區(qū)，以及5′端的Bl、B2和B3區(qū)等6個不同的位點設計4種引物。

FIP（Forward Inner Primer）：上游內部引物，由F2區(qū)和F1c區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3′端的F2c區(qū)域互補，F(xiàn)1c區(qū)與靶基因5′端的Flc區(qū)域序列相同。

F3引物：上游外部引物（Forward Outer Primer），由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補。

BIP引物：下游內部引物（Backward Inner Primer），由B1c和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3’端的B2c區(qū)域互補，B1c域與靶基因5’端的Blc區(qū)域序列相同。

B3引物：下游外部引物（Backward Outer Primer），由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補。

1.2 擴增原理

60～65 ℃是雙鏈DNA復性及延伸的中間溫度，DNA在65 ℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)。因此，DNA在此溫度下合成是可能的。利用4種特異引物，依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)。擴增分兩個階段，即第1階段為啞鈴狀模板構造的形成過程，第2階段為擴增循環(huán)延伸階段。

1.3 環(huán)引物的應用

環(huán)引物雖不影響反應的特異性，但增強了反應敏感性，并起到加速反應的作用。Loop引物結合到反應中間產物環(huán)狀物F1、F2（或者B1c、B2c）之間的區(qū)域上，通過某種機制，可使反應時間至少縮短一半[2]。

2 LAMP技術的發(fā)展

2.1 LAMP檢測儀器的發(fā)展

隨著LAMP技術的發(fā)展，相關技術公司逐步研發(fā)出相關儀器設備，取代人工肉眼觀察或者電泳檢測產物，克服肉眼觀察或者電泳帶來的誤差和污染，使結果判定更準確。

LAMP實時濁度儀是日本榮研研發(fā)的設備。此裝置可以完成從基因擴增到檢驗的整個過程。LAMP實時濁度儀在等溫條件（60～65 ℃）下孵化，通過測定擴增基因時出現(xiàn)的副產物——焦磷酸鎂的混濁度，來判斷是否存在目標基因，其最大可以同時擴增測定32個樣本，并可提前設定Loopamp試劑配套所需的測定條件，實時測定每個樣本的濁度，所得結果可在電腦中通過圖表顯示。此設備可大大減少手動操作產生的氣溶膠，減少污染，并可實時監(jiān)測濁度，提高了準確率。

等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)是一套開放式系統(tǒng)。其以IAT（核酸等溫擴增技術）為基礎，結合熒光檢測技術，在恒溫條件下，通過添加雙鏈結合熒光染料，實時監(jiān)控擴增過程，快速完成核酸擴增；通過實時擴增曲線和產物溶解曲線，判定陰陽性并分析實驗結果，無需開蓋或其他擴增后處理，可應用于環(huán)介導核酸等溫擴增技術（LAMP，LOOPLAMP）、滾環(huán)擴增技術（RCA）、單引物等溫擴增 （SPIA）、交叉引物擴增技術（CPA）等各類型等溫擴增反應，也兼容多種熒光指示劑，如生物熒光、熒光染料、鈣黃綠素和熒光探針等。此系統(tǒng)有配套核酸檢測試劑盒，反應試劑可直接擴增DNA和RNA樣本，且RNA樣本無需進行逆轉錄。該系統(tǒng)除可使用配套試劑外，還可使用其他同原理配比試劑。

2.2 LAMP檢測技術的發(fā)展——熒光LAMP技術

LAMP是一種快速靈敏的檢測方法，不需要特定的PCR儀器，其靈敏性可以和PCR相媲美，甚至超越PCR。PCR技術靠加熱使雙鏈DNA解鏈，LAMP技術則是依靠酶的活性。LAMP在鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，引物退火結合到靶序列上并延伸。LAMP反應十分迅速，在Loop引物的加速作用下，最低5 min即可完成反應。

一般的LAMP技術只能進行單一的靶基因檢測，限制了LAMP的應用。使用熒光標記或嵌合染料的實時檢測方法，以前采用的都是非特異性淬滅。非特異性淬滅降低了實時檢測方法的靈敏性，也限制了多重檢測技術熒光團的選擇。

美國Nathan等[3]研究人員，在LAMP基礎上，優(yōu)化了引物，可進行多重LAMP反應，同時進行多個靶基因（多達4個）的檢測。

將FIP（F1c+F2）引物5′標記淬滅基團或熒光基團，另外合成F1c的互補序列Fd；Fd的3′端標記淬滅基團或熒光基團、3′端修飾的Fd退火結合到5′端修飾的FIP序列上，形成Q-FIP/Fd復合引物。F1c片段一般為20～25個堿基，其Tm值大于60 ℃，因此Q-FIP/Fd復合引物仍能在63～65 ℃穩(wěn)定地退火結合到靶序列上，在沒有鏈置換DNA聚合酶的作用下不會出現(xiàn)熒光信號。在LAMP反應過程中，當BIP引物結合到含有Q-FIP/Fd復合引物的單鏈DNA模板上進行鏈擴增反應時，標記熒光基團的Fd引物解離，熒光基團發(fā)出的熒光不能被淬滅基團吸收，從而使熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與LAMP產物的形成完全同步。

將等摩爾數(shù)的Q-FIP、Fd混合，加熱至98 ℃，然后緩慢冷卻至室溫，就可使Q-FIP、Fd退火結合形成Q-FIP/Fd復合引物。然而，Q-FIP/Fd復合引物完全取代FIP會抑制LAMP擴增反應，等摩爾數(shù)的Q-FIP/Fd復合引物、FIP引物混合物將大大減弱Q-FIP/Fd復合引物對擴增的抑制作用。與使用野生型Bst DNA polymerase相比，如果LAMP反應使用Bst 2.0 DNA polymerase或Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase，那么效果會更好。

單重熒光LAMP反應可以推廣至多重熒光LAMP反應，總的引物濃度不變。每種多重引物的濃度根據檢測模板的數(shù)量調整，為1/n（n為熒光LAMP反應的模板數(shù)）。在多重熒光LAMP反應中，優(yōu)先選擇熒光信號更強的熒光基團。ROX是熒光信號最強的熒光基團，Cy5、Cy5.5、HEX次之，6-FAM信號較弱，難以和背景熒光信號區(qū)分開。

2.3 LAMP檢測技術的發(fā)展——Stem Primers在LAMP中的應用

LAMP 6條引物的設計，需要選擇8個引物位點，每條引物的位點和方向都有限制。為了克服這種局限性，Gandelman等[4]建立了一種替代方法STEM-LAMP，用Stem Primers替代Loop Primers。在反應速度和特異性上，STEM-LAMP和LOOP-LAMP類似，但STEM-LAMP更具優(yōu)越性、靈活性，體現(xiàn)在：①引物設計區(qū)域更廣，局限性更??；②Stem primers不會結合到DNA環(huán)狀區(qū)域，無方向性；③可進行多重反應；④沒有置換引物也可以完成反應；⑤不僅可以用于定性檢測，也可以用于定量檢測。而LOOP-LAMP 需要6條引物 ：2條環(huán)生成引物（FIP、BIP）、2條鏈置換引物（F3、B3）、2條加速引物（LoopF、LoopB）。引物設計時需選擇靶基因上8段不同的區(qū)域，環(huán)生成引物（FIP、BIP）、鏈置換引物（F3、B3）、加速引物（LoopF、LoopB）位置嚴苛，只能單向與靶基因結合；LoopF、LoopB必須分別在F1、F2和B1、B2之間，才能易形成引物二聚體（一般FIP、BIP的長度大于40 bp，更易形成引物二聚體）。

3 LAMP在疫病檢測中的應用

3.1 LAMP在人類疫病檢測中的應用

由于LAMP技術的快速特異，其被廣泛應用于臨床疾病的檢測，給患者提供及時有效的醫(yī)療方案。此技術已被成功用于放線桿菌、人類皰疹病毒6型、人類皰疹病毒7型、肺炎鏈球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢測和多種分枝桿菌的區(qū)別等。

3.2 LAMP在動物疫病檢測中的應用

3.2.1 用于細菌的檢測。LAMP最 初 被Maruyama[5]應用于檢測大腸桿菌O157：H7的stxA2基因，通過原位法檢測stx基因，取得了理想的結果。Akemi Yano等[6]2007年建立了檢測產腸毒素大腸桿菌LT1、ST1基因的LAMP方法。該方法特異性強，靈敏度高。LT1的檢測限量為4 CFU/管，ST1的檢測限量為40 CFU/管，比傳統(tǒng)的PCR方法敏感性高10倍，是診斷產腸毒素大腸桿菌的簡單快速高效的方法。Masashi Okamura等[7]運用LAMP技術建立了沙門菌菌株O9群的鑒定方法，比普通PCR方法靈敏度高1 000倍。ShaoYanchun等[8]建立了同時檢測牛奶中沙門菌和志賀氏菌的多重LAMP-RFLP方法，擴增基因分別為invA和ipaH。該方法可根據不同梯形DNA條帶和限制性酶切分析，即可鑒別沙門菌和志賀氏菌。還有用于檢測產毒素霍亂弧菌、副溶血弧菌、抗青霉素的金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌等的報道。

3.2.2 用于病毒的檢測。Anne-Lie Blomstrom等[9]報道了一步法RT-LAMP，檢測豬水泡病病毒，其在30～60 min內，即可通過電泳或者肉眼觀察結果。Qu等[10]采用LAMP方法檢測豬細小病毒，試驗結果表明LAMP方法既可應用于豬細小病毒的實驗室檢測，也可用于養(yǎng)殖場檢測。Dukes等[11]2006年建立了檢測口蹄疫（FMD）的RTLAMP方法。其與熒光定量PCR相比毫不遜色，適用于野外檢測及發(fā)展中國家口蹄疫的監(jiān)控。Chen等[12]建立了檢測H9亞型禽流感病毒的RTLAMP方法。該方法比PCR方法靈敏度高10倍，且與其他亞型的禽流感病毒、新城疫病毒無交叉反應。在112份臨床樣品檢測中，RT-LAMP檢測出了所有陽性樣品，而RT-PCR卻有7陽性樣品沒有被檢出。Hang Minh Pham等[13]設計了新城疫病毒的融合蛋白基因的LAMP引物，建立了檢測新城疫病毒的RT-LAMP方法。該方法可以直接對分離培養(yǎng)物及臨床樣品進行檢測，其靈敏度和特異性與巢式PCR相當，并具有快速、費用低、簡單易操作的優(yōu)點。

3.2.3 用于動物源性成分的檢測。歐洲國家食品法規(guī)定，無論是生肉，還是加工產業(yè)鏈中其他產品，都必須貼標簽，因此需要一個快速準確的肉品種鑒定方法。Amir Abdulmawjood等[14]建立了檢測鴕鳥成分的LAMP方法。該方法的檢測限量為1 pg DNA。加工肉類中常含有的鹽分、香料、食用油等，雖然會影響PCR的檢測，但是不影響LAMP的檢測。

3.3 LAMP在水生動物疫病檢測中的應用

LAMP是檢測魚類及甲殼類病原的新的技術方法。早期診斷對于水生動物疫病的預防具有重要的作用，而快速檢測是預防水生動物疫病的最重要一環(huán)。免疫熒光技術（FAT）、酶聯(lián)免疫吸附技術（ELISA）、分子檢測技術（PCR、RFLP、AFLP、RAPD等）已經被用來檢測各種水生動物病原。LAMP方法因其較高的特異性、敏感性，在水生動物疫病檢測中得到廣泛應用。

在水產養(yǎng)殖中，關于遲緩愛德華氏菌、鮰愛德華氏菌、鯰魚愛德華氏菌、黃鰣魚諾卡氏菌、白斑綜合征病毒、傳染性皮下壞死病毒、真鯛虹彩病毒、錦鯉皰疹病毒等，都有LAMP檢測方法的報道，均證實LAMP是一種簡單快速靈敏的診斷方法。

Tomoya Kono等[15]將LAMP技術應用于水生動物白斑病的檢測，檢測限量為1 fg，1 h就可完成病毒檢測，但靈敏度比巢式PCR低10倍。對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）和傳染性皮下組織和造血器官壞死病毒（IHHNV）為影響世界養(yǎng)蝦業(yè)的兩大重要病毒。He Lin等[16]于2011年建立了同時檢測對蝦WSSV和IHHNV的多重LAMP方法。根據WSSV的VP28基因和IHHNV的NS1基因分別設計LAMP引物，在FIP的F2、F1c及BIP的B2、B1c的接合處均插入限制性內切酶，其敏感性比巢式PCR高100倍，比普通PCR高1 000倍。Teng等[17]2006年將RT-LAMP和斑點雜交（DBH）兩種方法結合，建立了檢測桃拉病毒的方法。RT-LAMP反應結束后，采用斑點雜交檢測靶基因的信號。該方法簡單有效，適用于現(xiàn)場診斷。Gunimaladevi等[18]根據錦鯉皰疹病毒的tk基因，設計4條引物，建立了LAMP方法。其敏感度和PCR相同，檢測時間LAMP 60～90 min，而PCR需要3～4 h，LAMP優(yōu)越性很明顯。

3.4 LAMP在寄生蟲檢測中的應用

以LAMP為基礎的檢測技術已廣泛應用于原生動物寄生蟲的檢測。Hiroshi Iseki等[19]根據棒狀體蛋白1基因設計了同時檢測牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲的多重LAMP引物。研究結果表明多重LAMP方法比PCR方法更靈敏。另外，運用LAMP技術檢測錐蟲、瘧原蟲、隱孢子蟲等動物寄生蟲的報道也屢見不鮮。

3.5 GenieII實時熒光等溫擴增檢測系統(tǒng)的應用

史秀杰等[20]、何俊強等[21]在GenieII實時熒光等溫擴增檢測系統(tǒng)的基礎上，建立了檢測傳染性鮭魚貧血癥病毒、傳染性造血器官壞死病毒的LAMP方法。安元龍等[22]運用GenieII實時熒光等溫擴增檢測系統(tǒng)，以LAMP法熒光檢測為基礎，建立了對病毒性出血性敗血癥病毒進行熒光實時反轉錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法。侯東君等[23]選定一套可在牛羊肉中特異并靈敏的檢測出摻雜肉成分的引物對，以動物細胞色素b基因組為模板，可在恒溫63 ℃特異性擴增出豬等基因片段而無其他擴增片段影響。

LAMP技術還應用于胚胎性別鑒定、轉基因檢測等各個檢測領域，其在適用性、特異性、敏感性方面均具有優(yōu)勢。

4 結論與展望

從最初2003年LAMP方法的應用到現(xiàn)在，LAMP方法已被成功用于細菌、病毒、真菌、寄生蟲等病原的分子生物學檢測和診斷，以及胚胎性別鑒定、轉基因檢測、各種疫病的檢測，等等。LAMP技術本身也在改進和提高，并與其他技術合并應用，如橫向流動試紙條法（LFD）、限制性內切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）[8]、斑點雜交（DBH）[17]等。LAMP技術多數(shù)只能用于檢測一個靶目標，但經過研究者們精心的設計和試驗，LAMP技術結合限制性酶切分析，可進行雙重LAMP檢測[16，19]，這推動了LAMP的發(fā)展。

在LAMP檢測儀器方面，也取得了很大成就，從單純的檢測產物渾濁度的濁度儀到可以進行實時檢測的實時熒光等溫擴增檢測系統(tǒng)，可見研究者們對LAMP方法的認可。在其他輔助條件下（其他方法和儀器），LAMP方法將有更多更廣泛的應用。

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（責任編輯：朱迪國）

Research Progress of LAMP Technology and Its Application in Animal Diseases Detection

Xu Shufei1，Kong Fande1，Miao Li2，Cai Zhenhong3，Lin Zhenji1，Zhao Ran4
（1. Xiamen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen，F(xiàn)ujian 361026；2. Henan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhengzhou，Henan 450003；3. Xiamen Siming District Municipal Administration Center，Xiamen，F(xiàn)ujian 361010；4. Xiamen Agriculture Product Quality and Safety Test Centre，Xiamen，F(xiàn)ujian 361000）

In this article，the Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）technology was introduced in three aspects：technical principle，research progress and its application in animal diseases detection. Compared with the general PCR and fuorogenic quantitative PCR，the LAMP method has many advantages，including no need of precision instruments，judging results only by naked eyes，easy operation，costing less time and high sensitivity. Based on these advantages，the LAMP has been widely applied to the detection of bacterial，viral and parasitic diseases of aquatic and terrestrial animals. The development and application of LAMP are further facilitated by the combined application between LAMP and other techniques，as well as the emergence of the LAMP detecting instrument.

Loop-mediated isothermal amplifcation（LAMP）；detection；development；application

book=75,ebook=81

S851.3

A

1005-944X（2017）01-0075-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.01.022

國家質檢總局科技計劃項目（2014IK089）；福建省科技計劃引導項目（2015Y0031）；廈門市科技計劃項目（3502Z20154079）