雞腺胃型傳染性支氣管炎的診治與基因序列分析

（廣東溫氏佳潤食品有限公司，廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東新興 527400）

雞腺胃型傳染性支氣管炎的診治與基因序列分析

邰 鏑，劉旭晨，周 全，李芳雯

（廣東溫氏佳潤食品有限公司，廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東新興 527400）

從廣東省某雞場疑似腺胃型傳染性支氣管炎病死雞的腺胃中分離到一株病毒，初步鑒定為QX型傳染性支氣管炎病毒（IBV）。通過疫苗免疫與其他輔助措施，疫病得到有效控制。但動(dòng)物回歸試驗(yàn)表明，IBV毒株單獨(dú)感染并不能導(dǎo)致雞產(chǎn)生腺胃炎癥狀。

腺胃型 ；傳染性支氣管炎；診治；序列分析

傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的急性、高度接觸性傳染病。由于IBV的易變性，不同地區(qū)、不同時(shí)期流行的IBV毒株差異很大。雖然1996年國內(nèi)首次報(bào)道了一種發(fā)生于肉用仔雞的“腺胃型”IB，但I(xiàn)BV感染是否是誘發(fā)腺胃炎的直接原因尚不能下定論。2016年1月廣東省某肉雞飼養(yǎng)場飼養(yǎng)的麻黃雞突然發(fā)生以雛雞采食量異常降低、腺胃腫脹、發(fā)育不良為臨床癥狀的疾病，并分離到IBV。為確定毒株是否是導(dǎo)致雛雞發(fā)生腺胃炎的原因，遂對(duì)其進(jìn)行纖突蛋白基因S1的測序、基因分型和動(dòng)物回歸試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 病料來源、臨床癥狀與解剖病變

病雞主要表現(xiàn)為9日齡雛雞采食量異常降低，羽毛松亂，干腳脫水，但死淘率正常，18日齡后料量恢復(fù)正常，但部分雞體型消瘦，發(fā)育不良，養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生大量弱小與殘次雞，占5%～20%比例不等，上市時(shí)料肉比上升0.3，長速較正常雞群慢4～7天。剖檢病死雞時(shí)發(fā)現(xiàn)腺胃腫脹、腺胃壁增厚水腫，擠壓腺胃乳頭有黃白色膿性分泌物，部分雞發(fā)生輸尿管尿酸鹽沉積，胸腺、法氏囊萎縮，胰腺壞死。

1.2 主要材料與試劑

Axy體液病毒DNA/RNA小量試劑盒與AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；一步法RT-PCR試劑盒，購自寶生物（大連）工程有限公司。

1.3 SPF雞胚和SPF雞

9～11日齡SPF雞胚與10日齡SPF雞胚，購自于廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司。

1.4 病毒分離與鑒定

無菌操作，取腫大嚴(yán)重的腺胃，沖洗后用勻漿器勻漿。按1:5比例加入滅菌生理鹽，并加入青霉素1 000 U/mL、鏈霉素1 000 ug/mL，37 ℃放置30 min，并在常溫與-20 ℃反復(fù)凍融3次。8 000 r/min離心15 min后收集上清液，用一次性過濾器過濾除菌。用此分離液接種10日齡SPF雞胚，尿囊腔接種，每胚接種0.2 mL，培養(yǎng)36～48 h，另設(shè)接種生理鹽水空白對(duì)照組，置于37 ℃ 溫箱孵育。將24 h內(nèi)的死胚棄去，120 h后觀察未死亡的雞胚變化；收集尿囊液，尿囊腔接種 10 日齡 SPF雞胚，觀察并記錄死亡與侏儒胚數(shù)量，盲傳6代。

1.5 雞胚半數(shù)感染量（ EID50）測定

取 20 枚 9～11日齡 SPF 雞胚分為 4 組。將盲傳第6代病毒液按10-3～10-6倍比稀釋，每個(gè)稀釋度接種5 枚 SPF 雞胚，0.1 mL/枚。在孵化箱中孵化6 d，接種24 h 后照蛋。接種后 24 h 內(nèi)死亡的雞胚判為非特異性死亡，以后每天照胚 2 次，觀察雞胚狀況并記錄死亡情況，死亡雞胚放在 4 ℃條件下保藏。24 h 后雞胚死亡為感染，同時(shí)觀察活雞胚胎，出現(xiàn)失水、蜷縮、發(fā)育小等特異性病痕為感染。按照 Read-Muench 方法計(jì)算該病毒的 EID50。

1.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

10日齡 SPF 雛雞15只，分為2組。第1組10 只，通過滴鼻接種103EID50的病毒尿囊液1 mL/只；第2組5只，為空白對(duì)照組，滴鼻接種生理鹽水1 mL/只。2組雛雞分別放在2個(gè)隔離器中飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14 d，比較兩組雞群的臨床表現(xiàn)、發(fā)病情況以及死亡率，并進(jìn)行剖檢。

1.7 S1 基因RT-PCR 擴(kuò)增和序列測定

1.7.1 引物的設(shè)計(jì)與合成。參照GenBank 中公布的S1基因序列，設(shè)計(jì)并合成1對(duì)引物。預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小為 1 668 bp，由生工生物工程（上海）有限公司合成。上游引物（P1）：AAGACTGAACAAAAGACCGACT；下游引物（P2）：CAAAACCTGCCATAACTAACATA。

1.7.2 RNA 提取。具體方法參照Axy體液病毒DNA/RNA小量試劑盒說明書。

1.7.3 RT-PCR。參照TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR 的反應(yīng)條件為：94 ℃變性 1 min，52.5 ℃退火 1 min，72 ℃延伸2 min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。

1.7.4 序列測定。將純化的 PCR 產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體，送交大連寶生物工程有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離鑒定及EID50結(jié)果

將病料接種雞胚進(jìn)行盲傳的第1代未發(fā)現(xiàn)明顯病變，從第3代開始出現(xiàn)侏儒胚。隨著傳代次數(shù)的增加，雞胚病變現(xiàn)象越來越明顯，表現(xiàn)為侏儒胚，死亡雞胚出血、充血，死胚羊膜增厚，表面混濁，胚體蜷縮，趾爪緊抱頭部。第6代雞胚尿囊液EID50測定結(jié)果為10-4.3，毒價(jià)為104.3EID50/0.1 mL。

2.1 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

10只 10 齡 SPF 雛雞攻毒后，第4天出現(xiàn)拉稀，排黃白色水樣糞便，第6 天出現(xiàn)死亡，死亡率10%；剖檢腎臟出血腫大，并有嚴(yán)重的尿酸鹽沉積，但未發(fā)現(xiàn)有腺胃水腫病變。5只對(duì)照組正常。

2.2 S1 基因的克隆和序列分析

經(jīng)序列測定，克隆的 PCR 產(chǎn)物包含1 640 bp的完整閱讀框。經(jīng)序列同源性比對(duì)分析，該毒株S1基因與疫苗毒株W93、4/91、28/86、D90、H120、LDT3、M41和基因核苷酸序列同源性分別為 77.2%、78.1%、77.3%、94.3%、77.3%、85.2%和77.1%（圖1、圖2）。

圖1 S1基因的同源性比對(duì)分析

圖2 S1基因序列分析

3 綜合治療

采用下述方法治療7天后，未有新發(fā)病例出現(xiàn)，雞群采食量恢復(fù)正常；20天后弱小雛雞與殘次雞數(shù)量明顯減少；30天后全場恢復(fù)正常。

3.1 免疫程序調(diào)整與緊急免疫

為使育雛期雞群盡快獲得針對(duì)IBV的特異性抗體，在5日齡與10日齡，使用大華農(nóng)新勝威疫苗進(jìn)行常規(guī)免疫，滴眼1頭份/只；患病雞群進(jìn)行緊急免疫，滴眼1.5頭份/只

3.2 使用抗生素防止繼發(fā)感染

IB可引起雞免疫力低下，抗病力下降，因此每日使用阿莫西林與硫酸新霉素，防止其繼發(fā)或并發(fā)細(xì)菌性疾病

3.3 增加采食量，加速尿酸鹽排泄

針對(duì)雞群采食量下降癥狀，使用大蒜素與益生素增加雞群采食量，并使用碳酸氫鈉加速尿酸鹽排泄，以緩解癥狀，同時(shí)補(bǔ)充維生素B與維生素A。

3.4 改善飼養(yǎng)環(huán)境

適當(dāng)降低飼養(yǎng)密度，做好通風(fēng)，減少應(yīng)激因素，保持雞舍溫度恒定，并提高1～2 ℃，將精神沉郁的病雞隔離飼養(yǎng)。

4 討論

目前，由于 IB 疫苗所帶來的免疫壓力，國內(nèi)流行的 IBV毒株在持續(xù)不斷地進(jìn)化[1]。根據(jù)研究報(bào)道，可引起腺胃型IB的基因型有Mass基因型[2]（如H95與ZJ971）、T3[3]與QX基因型[4]（如QXIBV、DYIBV與FCIBV）。目前QX 型毒株已經(jīng)成為國內(nèi)流行的主要基因型，并且仍有進(jìn)一步擴(kuò)大的趨勢。該型毒株感染雞群后，根據(jù)臨床癥狀和解剖病變可表現(xiàn)為呼吸型、腎型與腺胃型。但迄今為止國內(nèi)外對(duì)腺胃型IB發(fā)生的原因尚無定論[5]。根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)，可能導(dǎo)致該病的因素包括生物學(xué)因素（如，傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒、淋巴細(xì)胞白血病病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒等）和非生物學(xué)因素（如，低纖維素日糧、真菌毒素等）兩大類。

本病例以雛雞腺胃腫脹、腺胃乳頭潰瘍?yōu)樘卣?，主要表現(xiàn)為喂料量異常減少、生長發(fā)育不良等癥狀。實(shí)驗(yàn)室診斷表明本病例為QX型IBV感染，并通過調(diào)整免疫程序與其他輔助措施，疾病得到良好的控制與治療。但通過動(dòng)物回歸試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)感染IBV并不能導(dǎo)致腺胃炎的發(fā)生。雖然在攻毒之前進(jìn)行外源病毒檢查時(shí)并未發(fā)現(xiàn)有其他常見病原體的污染，但并不能完全排除其他未知病原在致病過程中的潛在作用，對(duì)此仍需要深入研究。

[1] AWAD F，CHHABRA R，GANAPATHY M B K. An overview of infectious bronchitis virus in chickens[J]. Worlds Poultry Science Journal，2014，70（2）：375-384.

[2] XIAO C T，LIU R，SONG Z Y，et al. Genomic characterization of a proventriculitis-associated infectious bronchitiscoronavirus[J]. virus Genes，2010，40（3）：421-422.

[3] YU L，JIANG Y，LOW S，et al. Characterization of three infectious bronchitis virus isolates from China associated with proventriculus in vaccinated chickens[J]. Avian Diseases，2001，45（2）：416-424.

[4] 王玉東，王永玲，張國中，等. 三株腺胃型傳染性支氣管炎病毒分離毒株對(duì)雞的致病性試驗(yàn)[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2015，45：195-201.

[5] 張小榮，程靖華，陳啟穩(wěn)，等. 雞腺胃分離的傳染性支氣管炎病毒基因型與致病性研究[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2014，33（4）：6-9.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Diagnosis and Treatment of Proventriculus Type Infectious Bronchitis and Its Gene Sequence Analysis

Tai Di，Liu Xuchen，Zhou Quan，Li Fangwen
（Guangdong Wen's Jagreen Foodstuffs Co.，Ltd，Guangdong Key Laboratory for Animal Health and Environmental Control，Xinxing，Guangdong 527400）

In a chicken farm of Guangdong province，one strain of virus was isolated from the proventriculus of a dead chicken，the death reason of which was suspected to be proventriculus-type infectious bronchitis. According to the preliminary identifcation，this strain was proventriculus type infectious bronchitis virus（QX IBV）. Then the disease was controlled through vaccination and other supplementary measures. However，animal regression test results showed that the avian proventriculitis could not be induced by IBV infection alone.

proventriculus type；infectious bronchitis；diagnosis and treatment；sequence analysis

book=94,ebook=100

S852.23

B

1005-944X（2017）01-0094-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.01.026