通用引物擴(kuò)增甲型流感病毒基因組及其高通量測序

王楷宬，邱 源，紀(jì)海旺，彭 程，莊青葉，王 通，王素春，于建敏，許榮強(qiáng)，陳繼明

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 嶗山區(qū)王哥莊街道農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，山東青島 266105）

通用引物擴(kuò)增甲型流感病毒基因組及其高通量測序

王楷宬1，邱 源1，紀(jì)海旺2，彭 程1，莊青葉1，王 通1，王素春1，于建敏1，許榮強(qiáng)1，陳繼明1

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 嶗山區(qū)王哥莊街道農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，山東青島 266105）

為探索使用高通量測序方法測定甲型流感病毒的基因組，設(shè)計(jì)了一對通用引物進(jìn)行甲型流感病毒全基因組的RT-PCR擴(kuò)增，并分析了該方法的敏感性。結(jié)果顯示，該方法能夠擴(kuò)增的甲型流感病毒多種亞型的全部8個節(jié)段的基因，其擴(kuò)增敏感性為100 pg RNA。

甲型流感病毒；通用引物；基因組；高通量測序

甲型流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬，為有包膜分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA 病毒。其基因組由8個單股負(fù)鏈RNA片段組成，每個基因在3′末端和5′末端都帶有12～13個保守核苷酸序列。這8個片段可編碼10種蛋白，其中8個蛋白（HA、NA、PB1、PB2、NP、M1、M2和PA）為結(jié)構(gòu)蛋白，NS1和NS2為非結(jié)構(gòu)蛋白，位于宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中[1]。根據(jù)HA 和NA 抗原性的差異，甲型流感病毒可分為若干亞型，迄今已發(fā)現(xiàn)有18種HA亞型（H1～H18）和11種NA亞型（N1～N11）[2-4]。任何一對HA 和NA 均可組合成一個亞型，如H1N1、H5N1、H7N9等。

甲型流感病毒能產(chǎn)生低保真RNA聚合酶。其可引起流感病毒的高突變率以及基因重組，可使流感病毒呈現(xiàn)分子多樣性，使每個病毒亞型可進(jìn)化為多個分支[5]。由于甲型流感病毒亞型多、突變率高、易發(fā)生重配，因此對流行毒株進(jìn)行基因組分析尤為重要。隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，采用高通量測序方法進(jìn)行甲型流感病毒基因組的測定[6]，已被科研人員廣泛接受。已經(jīng)有研究人員報道，在1個RT-PCR反應(yīng)中，使用1對通用引物擴(kuò)增甲型流感病毒所有8個基因節(jié)段的方法，從而使得流感病毒全基因組的測序更為簡單[7]。傳統(tǒng)測序方法雖然經(jīng)濟(jì)高效，但僅能測定某一特異性擴(kuò)增片段，且不能測定準(zhǔn)種[8]。而我國現(xiàn)在用于高通量測序平臺的甲型流感病毒基因組擴(kuò)增試劑主要依賴進(jìn)口，購買該試劑的費(fèi)用較高。本文參照文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)了1對通用引物進(jìn)行甲型流感病毒全基因的RT-PCR擴(kuò)增，并分析了該方法的敏感性。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

Ion Xpress Plus Fragment Library Kit、Ion PGM Template OT2 200 Kit、Ion PGM Sequencing 200 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2% Agarose、Ion 318 Chip Kit V2、 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Ion Xpress Batcode Aaptors、Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑，均購自Life technologies公司；超凈工作臺（Forma Scientifc）；移液器（Eppendorf）；孵化器（德州誠信孵化設(shè)備有限公司）；高速臺式離心機(jī)（Heraeus Biofuge primoR）；PCR擴(kuò)增儀（Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600）。

1.2 毒株和核酸提取

各亞型甲型流感毒株由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心禽病監(jiān)測室保存，毒株詳細(xì)信息見表1。病毒株接種9～11日齡雞胚，72小時內(nèi)收取雞胚尿囊液進(jìn)行病毒核酸RNA提取。按照說明書操作，使用RNA提取試劑盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit，Qiagen）提取病毒RNA，并使用Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑測定RNA濃度。

表1 禽流感病毒株信息

1.3 引物合成

按 照 文 獻(xiàn)[6]合 成 引 物。MBTuni-12：5'-ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG；MBTuni-13：5'-ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG。

1.4 甲型流感病毒基因組擴(kuò)增

使 用 PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2（Takara）進(jìn)行甲型流感病毒全基因擴(kuò)增，反應(yīng)體系：2×1 Step Buffer 25 μL，MBTuni-12（10 pM）和MBTuni-13（10 pM）各2 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL，RNA 10 μL，RNase Free dH2O 9 μL。反應(yīng)條件 ：45 ℃反轉(zhuǎn)錄1 h；95 ℃4 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳進(jìn)行鑒定。

1.5 文庫構(gòu)建

使用AMPure XP核酸純化磁珠（Beckman）對擴(kuò)增得到的甲型流感病毒基因組進(jìn)行擴(kuò)增，將純化后的全基因cDNA稀釋成35 μL中含有200 ng DNA的溶液，使用Ion Xpress Plus Fragment Library Kit將病毒全基因組DNA打斷為200 bp的片段，加入含有Barcode的接頭，構(gòu)建為PGM測序儀可識別的DNA文庫。

1.6 測序

將DNA文庫稀釋為26 pM，應(yīng)用Ion PGM Template OT2 200 Kit對DNA文庫進(jìn)行測序前的樣品處理。將處理后的樣品加樣至Ion 318 芯片，置于PGM測序儀進(jìn)行測序。將測序序列經(jīng)PGM自帶的FluAnalysis（v4.0）軟件進(jìn)行序列拼接。

1.7 敏感性試驗(yàn)

以A/avian/China/A32/2012的基因組RNA為模板，稀釋成含有1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、0.1 pg/μL和0.01 pg/ μL的RNA溶液，使用PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2） 和 引 物MBTuni-12/ MBTuni-13進(jìn)行甲型流感病毒的全基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 流感病毒全基因組擴(kuò)增及文庫構(gòu)建

使用該對引物能夠擴(kuò)增出9個毒株（8個HA亞型和3個NA亞型）的目的條帶，得到該病毒全基因的所有節(jié)段擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）。純化后的cDNA濃度均能滿足測序文庫構(gòu)建的需要，經(jīng)稀釋后構(gòu)建成含有Barcode接頭的200 bp DNA文庫。

圖1 甲型流感病毒基因組擴(kuò)增結(jié)果

2.2 測序數(shù)據(jù)分析

測序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，該方法能夠完成這些亞型的全基因組測序，測序數(shù)據(jù)拼接后可覆蓋甲型流感病毒的所有8個節(jié)段。各毒株每個節(jié)段的平均測序深度見表2。包括各節(jié)段的5′和3′端序列，所有毒株的節(jié)段至少平均被測199次（A/avian/China/P174/2013的PA基因）。綜合分析所有9個毒株8個節(jié)段的平均測序深度發(fā)現(xiàn)：M基因的平均測序深度最大，為5 533；PA基因的平均測序深度最小，為1 497。通過FluAnalysis（v4.0）軟件對各毒株的HA和NA亞型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除第8和第9株通過高通量測序鑒定的亞型與常規(guī)檢測結(jié)果不同外，其余均一致（表2）。

表2 毒株各節(jié)段的測序深度

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

不同濃度的A/avian/China/A32/2012的基因組RNA，經(jīng)使用PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2和引物MBTuni-12/ MBTuni-13進(jìn)行甲型流感病毒全基因擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳結(jié)果見圖2。由圖2可見，反應(yīng)體系中加入10 μL濃度為10 pg/μL的RNA（100 pg）仍能檢測到清晰的所有流感病毒節(jié)段的條帶。

圖2 不同濃度的引物RT-PCR檢測甲型流感病毒敏感性的比較

3 討論

甲型流感病毒全基因測序?qū)α私饬鞲胁《镜姆肿由飳W(xué)特性、基因重配機(jī)制、準(zhǔn)種分析[14]等具有十分重要的意義。甲型流感病毒全基因測定的傳統(tǒng)方法常是采用每個基因的特異性引物擴(kuò)增的方法，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)直接測序或克隆測序得到全基因序列。這種方法操作繁瑣，且針對某些亞型的甲型流感病毒需要采用亞型特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。這在毒株亞型未知的情況下，更會加大工作量。為了解決這些問題，使用通用的一對引物，一步RT-PCR擴(kuò)增全部亞型的全基因方法被逐步建立和應(yīng)用[1，9]，但將全部8個節(jié)段的擴(kuò)增產(chǎn)物在一個反應(yīng)體系中進(jìn)行測序仍是一項(xiàng)復(fù)雜工作。隨著高通量測序的發(fā)展，這種混合樣品的測序問題被逐步得到解決，從而使得甲型流感病毒的全基因測序技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展[6]。采用高通量測序，可以開展甲型流感病毒的監(jiān)測[10]、亞型鑒定[11]、全基因測序與進(jìn)化分析[12]，以及突變頻率[13]和準(zhǔn)種分析[14]等工作。

我國用于甲型流感病毒全基因高通量測序的配套試劑全部依賴進(jìn)口，國內(nèi)鮮見有關(guān)通用引物擴(kuò)增甲型流感病毒全基因的報道。本文依據(jù)文獻(xiàn)報道，建立了此種通用引物擴(kuò)增方法。結(jié)果顯示，所采用的建庫與測序方法能夠測定甲型流感病毒的全基因，并且測序深度較大，能滿足序列分析的需要。本實(shí)驗(yàn)在一次測序中完成了9種亞型甲型流感病毒的全部8個基因的測序，并分析出各毒株的HA和NA亞型。但常規(guī)測序判定為H10和H11的兩株病毒，在本實(shí)驗(yàn)中卻被分別分析為H1和H10，此結(jié)果產(chǎn)生的原因?qū)谙乱徊降难芯恐蟹治?。此?xiàng)技術(shù)的建立，將提高我國甲型流感病毒監(jiān)測和分析的能力和效率，減少我國相關(guān)試劑的購買費(fèi)用，待技術(shù)成熟后，可向科研院所和疾病防控機(jī)構(gòu)推廣。

[1] HOFFMANN E，STECH J，GUAN Y，et al. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses [J]. Arch Virol，2001，146（12）：2275-2289.

[2] FREIDL GS，BINGER T，MULLER MA，et al. Serological evidence of influenza a viruses in frugivorous bats from Africa [J]. PLoS One，2015，10（5）：e0127035.

[3] TONG S，LI Y，RIVAILLER P，et al. A distinct lineage of infuenza A virus from bats [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（11）：4269-4274.

[4] TONG S，ZHU X，LI Y，et al. New world bats harbor diverse infuenza A viruses [J]. PLoS Pathog，2013，9（10）：e1003657.

[5] GHEDIN E，SENGAMALAY NA，SHUMWAY M，et al. Large-scale sequencing of human infuenza reveals the dynamic nature of viral genome evolution [J]. Nature，2005，437（7062）：1162-1166.

[6] KAMPMANN ML，F(xiàn)ORDYCE SL，AVILA-ARCOS MC，et al. A simple method for the parallel deep sequencing of full infuenza A genomes [J]. J Virol Methods，2011，178（1/2）：243-248.

[7] ZHOU B，DONNELLY ME，SCHOLES DT，et al. Singlereaction genomic amplifcation accelerates sequencing and vaccine production for classical and Swine origin human infuenza a viruses [J]. J Virol，2009，83（19）：10309-10313.

[8] DOMINGO E，BARANOWSKI E，RUIZ-JARABO CM，et al. Quasispecies structure and persistence of RNA viruses [J]. Emerg Infect Dis，1998，4（4）：521-527.

[9] INOUE E，WANG X，OSAWA Y，et al. Full genomic amplifcation and subtyping of infuenza A virus using a single set of universal primers [J]. Microbiol Immunol，2010，54（3）：129-134.

[10] MCGINNIS J，LAPLANTE J，SHUDT M，et al. Next generation sequencing for whole genome analysis and surveillance of infuenza A viruses [J]. J Clin Virol，2016，79：44-50.

[11] LIN Z，F(xiàn)AROOQUI A，LI G，et al. Next-generation sequencing and bioinformatic approaches to detect and analyze infuenza virus in ferrets [J]. J Infect Dev Ctries，2014，8（4）：498-509.

[12] HOECKE S V D，VERHELST J，VUYLSTEKE M，et al. Analysis of the genetic diversity of infuenza A viruses using next-generation DNA sequencing [J]. BMC Genomics，2015，16：79.

[13] LI X，SHI J，GUO J，et al. Genetics，receptor binding property，and transmissibility in mammals of naturally isolated H9N2 Avian Infuenza viruses [J]. PLoS Pathog，2014，10（11）：e1004508.

[14] KURODA M，KATANO H，NAKAJIMA N，et al. Characterization of quasispecies of pandemic 2009 infuenza A virus（A/H1N1/2009） by de novo sequencing using a nextgeneration DNA sequencer [J]. PLoS One，2010，5（4）：e10256.

[15] GAO R，CAO B，HU Y，et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A（H7N9） virus [J]. N Engl J Med，2013，368（20）：1888-1897.

[16] XIONG C，ZHANG Z，JIANG Q，et al. Evolutionary characteristics of A/Hangzhou/1/2013 and source of avian influenza virus H7N9 subtype in China [J]. Clin Infect Dis，2013，57（4）：622-624.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Genome Amplification of Influenza A Virus by Universal Primers and Sequencing by High-throughput Sequencing

Wang Kaicheng1，Qiu Yuan1，Ji Haiwang2，Peng Cheng1，Zhuang Qingye1，Wang Tong1， Wang Suchun1，Yu Jianmin1，Xu Rongqiang1，Chen Jiming1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Agricultural Service Center of Wanggezhuang Street in Laoshan District，Qingdao，Shandong 266105）

To sequence the genome of infuenza A virus by high-throughput sequencing，a pair of universal primers was designed to amplify the genome by RT-PCR. The sensibility of the method was also analyzed. The results showed that all the 8 genes of several subtypes infuenza A virus could be amplifed，and the lowest detection limit was 100 pg RNA.

infuenza A virus；universal primers；genome；high-throughput sequencing

book=90,ebook=96

S851.3

A

1005-944X（2017）01-0090-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.01.025

科技部科技基礎(chǔ)性專項(xiàng)（SQ2012FY3260033）；中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心創(chuàng)新基金（2015IF-0004FF）

陳繼明