2014—2016年華東地區(qū)某市活禽市場禽流感流行病學(xué)調(diào)查與分析

蔣文明，王 艷，李金平，侯廣宇，彭 程，劉 朔，王素春，黃保續(xù)，陳繼明

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135）

2014—2016年華東地區(qū)某市活禽市場禽流感流行病學(xué)調(diào)查與分析

蔣文明1，王 艷2，李金平1，侯廣宇1，彭 程1，劉 朔1，王素春1，黃保續(xù)1，陳繼明1

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135）

為了解華東地區(qū)某市活禽市場中禽流感病毒的污染狀況，2014—2016年對該市活禽市場的家禽進(jìn)行了禽流感流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示：該市活禽市場禽流感病毒污染面較廣，94.12%的市場存在禽流感病毒污染；H9N2亞型病毒感染率較高，樣品總體陽性率為22.66%，場點總陽性率為94.12%；H7N9亞型病毒感染率經(jīng)歷了一個升降過程，2015年上半年達(dá)到高峰，之后顯著降低；農(nóng)貿(mào)市場中的H7N9亞型病毒分離率顯著高于批發(fā)市場。本次調(diào)查未在活禽市場中檢出H5亞型高致病性禽流感病毒。這些數(shù)據(jù)為深入了解活禽市場中禽流感病毒的污染狀況和該病防控措施的制定提供了技術(shù)支持。

活禽市場；禽流感病毒；H7N9；H9N2

禽流感是由禽流感病毒（Avian infuenza virus，AIV）引起的高度接觸性傳染病。AIV為負(fù)鏈單股RNA病毒，根據(jù)表面血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）不同，可分為16種HA亞型和9種NA亞型[1]，根據(jù)致病力高低可分為高致病性AIV（HPAIV）和低致病性AIV（LPAIV）。HPAIV主要包括某些H5和H7亞型的病毒，其他亞型的病毒，如H9N2，都屬于LPAIV。

H9N2 AIV在世界范圍內(nèi)的家禽和野鳥中廣泛存在，也能夠感染一些哺乳動物。自1998年以來，已有多起人感染H9N2 AIV的報道[2]。此外，H9N2 AIV存在重組現(xiàn)象，可為形成跨種傳播的新型流感病毒提供條件。如，1997年感染人的H5N1病毒、2013年感染人的H7N9病毒，以及2014年感染人的H10N8病毒，其內(nèi)部基因均來源于H9N2病毒[3-5]。家禽中H7N9病毒屬于LPAIV，對家禽不致病，但與人感染的H7N9病毒高度相似，某些位點突變后可能會發(fā)生對人致病的可能。

研究發(fā)現(xiàn)，活禽市場是重要的AIV污染地[6-7]，也是與消費者密切接觸的場所。因此對活禽市場中的AIV進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查具有重要的公共衛(wèi)生意義。本研究于2014—2016年對華東某市的活禽市場進(jìn)行了AIV流行病學(xué)調(diào)查與分析，為深入了解該地區(qū)活禽市場中的AIV污染狀況和防控措施的制定提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與耗材

Qiaxtractor核酸提取工作站配套相關(guān)試劑、QIAxcel Advanced全自動毛細(xì)血管電泳分析儀配套試劑購自Qiagen公司；植絨拭子購自深圳麥瑞科林科技有限公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit購自Vazyme公司；SPF雞胚購自濟南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 樣品采集

2014—2016年，在華東某市的2個活禽批發(fā)市場和6個農(nóng)貿(mào)市場進(jìn)行了6次持續(xù)采樣（17場次），共采集檢測樣品4 233份（批發(fā)市場3 824份、農(nóng)貿(mào)市場409份）。其中，雞樣品3 600份、鴿樣品625份、環(huán)境樣品8份。

1.3 病毒分離

采集家禽的咽喉、泄殖腔雙拭子置于加抗生素（慶大霉素、左旋氧氟沙星、阿奇霉素）的PBS-甘油采樣液中（pH7.2～7.6），10 000 r/min離心10 min，取上清接種10～11日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，37℃孵化96 h。每隔24 h照胚一次，用1%的雞紅細(xì)胞測定雞胚尿囊液的血凝效價。

1.4 RNA提取

用Qiaxtractor核酸自動提取工作站，提取死胚及血凝陽性胚尿囊液中的病毒RNA，置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 HA和NA基因擴增

根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)，合成擴增HA和NA基因的引物[8]。按照HiScript II One Step RT-PCR Kit說明書配置44.0 μL RT-PCR預(yù)混液，包括25.0 μL 2×RT-PCR Buffer，引物各2.0 μL（10 μmol/L），2.5 μL Enzyme Mix，12.5 μL ddH2O，加入6.0 μL RNA模板。RT-PCR反應(yīng)條件為50℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行30個循環(huán)（94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min），最后72℃延伸7 min。利用QIAxcel毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)行片段分析，PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測序鑒定。

1.6 序列分析

利用Clustal W軟件將本試驗中各分離株的HA基因序列與參考株HA基因序列進(jìn)行比對，再用MEGA5.05軟件對其HA1亞單位的部分序列進(jìn)行譜系分析。譜系分析的參數(shù)設(shè)置如下：采用Neighbor-joining計算方法，核苷酸變異設(shè)為Kimura 2-parameter模式，各位點變異速率設(shè)為Gamma分布（Gamma參數(shù)為2.0）。Bootstrap值的計算設(shè)置為1 000個重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 各亞型禽流感毒株總體檢測結(jié)果

從8個場點采集的17個場次的4 233份樣品中，檢出AIV 1 072株，樣品總體陽性率為25.40%，場點陽性率為94.12%。1 072株AIV中包括H9亞型（89.46%）和H7亞 型（10.54%）2個HA亞型，其中H9N2亞型959份、H7N9亞型104份、H7N2亞型8份和H7N6亞型1份（表1）。

按樣品類型分，家禽拭子樣品AIV陽性率為25.32%（1 070/4 225），環(huán)境樣品陽性率為25.00%（2/8）。

按宿主分，雞樣品AIV陽性率為28.83%（1 038/ 3 600），鴿樣品陽性率為5.12%（32/625）。

表1 2014—2016年各亞型禽流感毒株陽性數(shù)及樣品來源

2.2 H7N9亞型病毒檢測結(jié)果

從8個場點采集的17個場次的4 233份樣品中，檢出104株H7N9亞型病毒。其中，89株來自雞樣品，15份來自鴿樣品。

上述104株H7N9病毒來自2個批發(fā)市場和3個農(nóng)貿(mào)市場（共12個場次），市場樣品H7N9病毒總體陽性率為2.46%（104/4 233），場點總陽性率為70.59%（12/17）。2014—2016年活禽市場的H7N9病毒總體陽性率變化趨勢見圖1。

圖1 2014—2016年不同時間活禽市場H7N9病毒樣品總體陽性率比較

按場點分，農(nóng)貿(mào)市場樣品平均陽性率為11.98%，約為活禽批發(fā)市場樣品平均陽性率（1.44%）的8.32倍，二者差異顯著（P＜0.05）。2014年上半年到2016年上半年，農(nóng)貿(mào)市場的樣品陽性率都顯著高于批發(fā)市場的樣品陽性率（P＜0.05）。農(nóng)貿(mào)市場和批發(fā)市場的樣品陽性率變化趨勢見圖2。

對H7N9病毒的HA序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，這些病毒與同期感染人的H7N9病毒HA氨基酸同源性較高（97.5%～99.1%），親緣關(guān)系較近（圖3）。HA裂解位點處的氨基酸為PEIPKGRG，為典型的低致病性禽流感分子特征。禽H7N9病毒與人H7N9病毒的受體結(jié)合位點一致，第226位氨基酸為酪氨酸（L），能夠結(jié)合α2，6-唾液酸受體，具有人樣受體特征。

圖2 2014—2016年不同時間活禽批發(fā)市場與農(nóng)貿(mào)市場H7N9病毒陽性率比較

圖3 2014—2016年華東某市活禽市場部分H7亞型AIV HA基因進(jìn)化分析

2.3 其他H7亞型病毒檢測結(jié)果

除H7N9病毒外，還檢出8份H7N2和1份H7N6病毒，均為弱毒。序列分析顯示，這些H7N2和H7N6病毒與H7N9病毒HA基因同源性較高，親緣關(guān)系較近（圖3）。

2.4 H9N2亞型病毒檢測結(jié)果

從8個場點采集的17個場次的4 233份樣品中，檢出959份H9N2病毒陽性樣品，樣品總體陽性率為22.66%，場點總陽性率為94.12%（16/17）。

按宿主分，雞樣品陽性率為26.11%（940/3 600），鴿樣品為2.72%（17/625），家禽環(huán)境樣品為25.00%（2/8）。

按場點分，活禽批發(fā)市場樣品陽性率為23.09%（883/3 824），場點陽性率為90.00%（9/10）；活禽零售市場樣品陽性率為18.58%（76/409），場點陽性率為100.00%（7/7）。

HA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，分離的病毒均屬于h9.2.4.5分支（圖4）。HA氨基酸序列分析顯示，裂解位點處的氨基酸為PSRSSRGLF，為典型的低致病性禽流感分子特征。第226位氨基酸為酪氨酸（L），能夠結(jié)合α2，6-唾液酸受體，具有人樣受體特征，具備了感染人的部分基因特征。

3 討論

從市場調(diào)查的結(jié)果來看，該市94.12%的活禽市場存在AIV感染，其中，94.12%的活禽市場存在H9N2病毒感染，70.59%的活禽市場存在H7亞型病毒感染，說明活禽市場的AIV污染面較廣，絕大多數(shù)市場存在AIV污染。其他研究者對部分省份活禽市場的調(diào)查結(jié)果也顯示，活禽市場是AIV的重要污染地[6-7]。

該市活禽市場中的H9N2亞型病毒感染率較高。從基因上分析，大部分H9N2病毒具備結(jié)合人樣流感受體的能力，對人具有一定的潛在威脅，以前的試驗也驗證了這一點[9]。Jiang等[10]發(fā)現(xiàn)79%的H9N2病毒能夠結(jié)合α2，6-唾液酸受體。Matrosovich等[10]發(fā)現(xiàn)，從香港活禽市場分離到的H9N2 AIV也能夠結(jié)合α2，6-唾液酸受體，進(jìn)一步證明其具有感染人的能力。H9N2亞型病毒雖然屬于LPAIV，但近年來已報到多起人感染H9N2病毒病例。而且，2013年的人H7N9病毒和2014年的人H10N8病毒，其內(nèi)部基因皆來自H9N2亞型AIV，所以H9N2病毒的潛在威脅和公共衛(wèi)生意義值得進(jìn)一步關(guān)注。

圖4 2014—2016年華東某市活禽市場部分H9N2亞型AIV HA基因進(jìn)化分析

H7N9亞型AIV感染率經(jīng)歷了一個先上升后下降的過程，2015年上半年達(dá)到高峰，2015年下半年，感染率開始顯著降低，與同期感染人的H7N9病毒數(shù)據(jù)一致。這可能與該市各級政府采取的休市、消毒等措施緊密有關(guān)。H7N9病毒以后的走勢值得進(jìn)一步關(guān)注。

農(nóng)貿(mào)市場中的H7N9病毒分離率顯著高于批發(fā)市場，提示在家禽從批發(fā)市場轉(zhuǎn)到農(nóng)貿(mào)市場過程中及之后，H7N9病毒在家禽群體中也有一個顯著擴增和擴散過程，對外擴散風(fēng)險增高，且存在繼續(xù)擴大、循環(huán)放大的風(fēng)險。

2014—2016年，未在該市的活禽批發(fā)市場和農(nóng)貿(mào)市場中檢出H5亞型HPAIV，說明該市H5亞型AIV感染率較低。

家禽從養(yǎng)殖到餐桌一般要經(jīng)歷“養(yǎng)殖場—批發(fā)市場—農(nóng)貿(mào)市場（零售市場）—消費者”4個環(huán)節(jié)。這4個環(huán)節(jié)中，批發(fā)市場和農(nóng)貿(mào)市場，尤其是農(nóng)貿(mào)市場，是與消費者密切接觸的環(huán)節(jié)。調(diào)查表明，批發(fā)市場的家禽大都來自規(guī)?；B(yǎng)禽場，相對比較干凈，攜帶病毒較少。待家禽進(jìn)入農(nóng)貿(mào)市場后，家禽攜帶的病毒量大大增加，這可能與市場環(huán)境有相當(dāng)大的關(guān)系。

基于以上結(jié)果和分析，建議繼續(xù)加強對活禽市場的禽流感流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測監(jiān)管，有條件的地方盡早取締活禽市場，大力發(fā)展冰鮮禽等替代品。短期內(nèi)難以取締活禽市場的地方，需要加強活禽市場的綜合衛(wèi)生防疫管理，建立嚴(yán)格的清洗、消毒、休市和家禽分區(qū)隔離制度，控制家禽在活禽市場中的停留時間和活動范圍，推進(jìn)入市活禽當(dāng)日宰殺制度，以確保公共衛(wèi)生安全。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Epidemiological Survey and Analysis on Avian Influenza Virus in Live Bird Markets in a City of Eastern China during 2014—2016

Jiang Wenming1，Wang Yan2，Li Jinping1，Hou Guangyu1，Peng Cheng1，Liu Shuo1，Wang Suchun1，Huang Baoxu1，Chen Jiming1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135）

In order to recognize the contamination situation of avian influenza virus（AIV）in live bird markets（LBMs）in a city of eastern China，an epidemiological investigation on AIV towards poultry in LBMs was carried out during 2014—2016. The results showed that there was a wide range of AIV contamination in LBMs，and 94.12% of the investigated LBMs were infected by AIV. Among them the infection rate of H9N2 virus was relatively high（an overall positive rate of 22.66%），and at the farm level the positive rate was 94.12%.The infection rate of H7N9 virus has presented a rise-and-fall process，it reached the peak in the frst half year of 2015，then decreased obviously. The isolation rate of H7N9 subtype in retail markets was signifcantly higher than that in wholesale markets. In addition，the H5 subtype highly pathogenic avian influenza virus wasn’t detected during this investigation. In a conclusion，theses data will provide technical supports for deeply understanding the contamination of AIV in LBMs，as well as establishing appropriate prevention and control measures for AI.

live bird markets（LBMs）；avian infuenza virus（AIV）；H7N9；H9N2

book=14,ebook=20

S852.65

A

1005-944X（2017）01-0014-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.01.004

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項（2012FY111000）；中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心創(chuàng)新基金（2015IF-0003YM）；青島市科技計劃（14-2-4-105-jch）

陳繼明