黑果腺肋花楸酵素的抗氧化活性研究

黃 海,王 瑩,郭云瑕,陶文靖,賈惜文,徐 艷

(1.欽州學(xué)院食品工程學(xué)院,廣西欽州 535011;2.廣西北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西欽州 535011; 3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266109)

?

黑果腺肋花楸酵素的抗氧化活性研究

黃 海1,2,王 瑩3,郭云瑕3,陶文靖3,賈惜文3,徐 艷3

(1.欽州學(xué)院食品工程學(xué)院,廣西欽州 535011;2.廣西北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西欽州 535011; 3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266109)

以黑果腺肋花楸(簡稱黑果)為原料,利用植物乳桿菌發(fā)酵制備黑果酵素,探討了黑果酵素發(fā)酵過程中總酚含量和體外抗氧化活性的變化及其對D-半乳糖致衰小鼠的抗氧化作用。結(jié)果表明，酵素發(fā)酵12 d后總酚含量、清除超氧陰離子能力、清除DPPH自由基能力較未發(fā)酵前分別提高了2.42、1.69、0.088倍,體外抗氧化活性顯著增強(qiáng)(p<0.05);與模型組、未發(fā)酵組相比,黑果發(fā)酵組小鼠體重增加量、免疫器官指數(shù)、血清和肝臟中T-SOD、CAT活力、對羥自由基的清除能力顯著提高(p<0.05),MDA的含量顯著下降(p<0.05)。綜上可知,黑果腺肋花楸酵素具有抗氧化作用。

黑果腺肋花楸,發(fā)酵,抗氧化

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa),又叫野櫻莓,不老莓,原產(chǎn)于美國東北部地區(qū)[1],是一種集食用、藥用、觀賞、生態(tài)價值于一體的薔薇科落葉灌木[2]。黑果的果實(shí)中含有花青素、黃酮、多酚、維生素、礦物元素等[3]。據(jù)Li J[4]等人研究,黑果的多酚含量是已知水果中最高的。目前歐美國家對黑果有較多的研究,有結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑果提取物具有緩解小鼠糖尿病、高血壓、抑制脂肪酶活等作用,并可以對腸道內(nèi)膽固醇起到很好的調(diào)節(jié)效果[5-8];發(fā)現(xiàn)黑果中的多酚與VE有協(xié)同抗氧化作用[9],但黑果果汁在單獨(dú)存放時易變質(zhì),使的抗氧化活性逐漸降低[10]。如何開發(fā)黑果產(chǎn)品并使其自身抗氧化活性在加工過程中不被破壞,是一個亟待解決的問題。

酵素是目前非常流行的一種新型保健食品。據(jù)報道酵素在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生各種對人體有益的酶,同時能夠?qū)⒋蠓肿愚D(zhuǎn)變成小分子營養(yǎng)物質(zhì),具有多種生理活性[11]。本文以黑果為原料,利用植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵得到黑果酵素。并通過建立D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性致衰小鼠模型,研究了該酵素的抗氧化作用,以期為其在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果腺肋花楸 開原市綠動園林苗木繁育基地;植物乳桿菌 無錫拜弗德生物科技有限公司;黃糖 佛山市南海葉氏恒發(fā)糖制品有限公司;雄性昆明種清潔級小鼠 體重(20±2) g,8周齡，青島大任富城畜牧有限公司,合格證號SCXKL(魯)20140007;D-半乳糖 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;MDA、T-SOD、GSH-Px、CAT、羥自由基試劑盒以及蛋白質(zhì)定量(考馬斯亮藍(lán)法)試劑盒 南京建成生物工程研究所;基礎(chǔ)飼料 山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

酵素發(fā)酵罐 青島也能家居用品有限公司;DU-800型紫外分光光度計 美國貝克曼公司;TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑果酵素的制備 取清洗干凈的黑果自然晾干,將其破碎,加入等質(zhì)量切碎黃糖,在無菌條件下按1%(w/w)接種量接入植物乳桿菌,混勻后密閉發(fā)酵15 d,過濾除去固體殘渣,在15 ℃條件下恒溫發(fā)酵1年即得酵素。將酵素離心后置于4 ℃冰箱冷藏待測備用[12]。

1.2.2 黑果酵素發(fā)酵過程的指標(biāo)測定

1.2.2.1 體外抗氧化活性測定 DPPH自由基清除能力、超氧陰離子清除能力測定方法參照文獻(xiàn)[13-15]。

1.2.2.2 總酚含量測定 參照文獻(xiàn)[16],采用Folin-Ciocalteau體系進(jìn)行測定。

1.2.3 小鼠的分組及飼喂 選取50只昆明種SPF級雄性小鼠,隨機(jī)分5組,分別為正常組、模型組、VC陽性對照組、黑果未發(fā)酵組和黑果發(fā)酵組,每組10只。

正常組、模型組小鼠按15 mL/(kg·d bw)灌胃生理鹽水,VC陽性對照組按100 mg/(kg·d bw)灌胃VC,并使其灌胃量與正常組、模型組相同,黑果未發(fā)酵組與發(fā)酵組按15 mL/(kg·d bw)的量分別灌胃黑果未發(fā)酵的自流汁與酵素。除正常組外,其他組按100 mg/(kg·d bw)皮下注射D-半乳糖,正常組注射等體積的生理鹽水。

小鼠飼養(yǎng)溫度為18～22 ℃,自然光照,自由進(jìn)食和飲水。每日定時灌胃、皮下注射一次,連續(xù)飼喂7周,記錄小鼠體重增加量。

1.2.4 小鼠血清和肝臟的制備 血清的制備:在最后一次灌胃、皮下注射小鼠后,將小鼠禁食12 h,稱重。摘除眼球取血致死,加入抗凝劑抗凝血,靜置3 h后,血樣在4 ℃下3000 r/min離心10 min,收集上清液,即為血清樣品[17]。

肝臟組織勻漿的制備:解剖小鼠,迅速取出肝臟、胸腺、脾臟,用生理鹽水清洗,用濾紙吸干,記錄胸腺、脾臟重量。并將肝臟研磨,以制備10%勻漿液，在4 ℃下4000 r/min離心10 min后除去細(xì)胞碎片,取上清液備用。

1.2.5 抗氧化活性的測定 小鼠的體內(nèi)抗氧化活性測定包括血清和肝臟對羥自由基的清除率,T-SOD、GSH-Px、CAT酶活力及MDA含量確定。測定方法按照試劑盒方法操作。

1.2.6 免疫器官指數(shù)測定 免疫器官指數(shù)的計算式為：

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果酵素發(fā)酵過程中體外抗氧化指標(biāo)變化

2.1.1 黑果酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化 參照1.2.2.2方法測定總酚含量變化,結(jié)果見圖1。

圖1 總酚含量變化曲線Fig.1 The curve of total phenols content 注:不同字母代表有顯著差異(p<0.05);圖2、圖3同。

從圖1可以看出,隨著發(fā)酵時間的增加,黑果酵素中總酚含量顯著增加,發(fā)酵12 d時總酚含量達(dá)到1.85 mg/g,之后趨于穩(wěn)定。黑果酵素發(fā)酵12 d后總酚含量較發(fā)酵前提高了2.42倍。

2.1.2 黑果酵素對超氧陰離子自由基清除能力的變化 參照1.2.2.1方法測定黑果酵素對超氧陰離子自由基的清除率,結(jié)果見圖2。

圖2 超氧陰離子自由基清除能力的變化曲線Fig.2 The curves of superoxide anion free radical scavenging ability

從圖2可以看出,隨著發(fā)酵時間的增加黑果酵素對超氧陰離子自由基清除能力逐漸增強(qiáng),發(fā)酵15 d時發(fā)酵液對超氧陰離子的清除能力達(dá)到58.3%,較發(fā)酵前提高了1.69倍。本實(shí)驗(yàn)以0.5 mg/mL的VC作為陽性對照,其對超氧陰離子的清除率為55.1%,小于發(fā)酵后的黑果酵素,說明黑果酵素具有很好的清除超氧陰離子自由基的能力。

2.1.3 黑果酵素對DPPH自由基清除能力的變化 參照1.2.2.1方法測定黑果酵素對DPPH自由基的清除率,結(jié)果見圖3。

圖3 DPPH自由基清除能力Fig.3 The curves of DPPH scavenging ability

從圖3可以看出,在發(fā)酵初期,隨著發(fā)酵時間的增加,黑果酵素對DPPH自由基的清除能力顯著增強(qiáng)。發(fā)酵12 d時發(fā)酵液對DPPH自由基的清除能力達(dá)到98.4%,較發(fā)酵前提高了0.088倍。本實(shí)驗(yàn)以0.75 mg/mL的VC作為對照,其對DPPH的清除率為92.45%,小于發(fā)酵后的黑果酵素,說明黑果酵素具有很好的清除DPPH自由基的能力。

2.2 黑果酵素對小鼠體重、脾臟、胸腺指數(shù)的影響

從表1可以看出,各組小鼠體重均有增長,但模型組小鼠體重增長量顯著小于正常組和VC陽性對照組,說明模型組小鼠衰老速度明顯高于其他組,建模成功。比較免疫器官指數(shù)指標(biāo)發(fā)現(xiàn),黑果發(fā)酵組與未發(fā)酵組明顯高于模型組,且黑果發(fā)酵組高于未發(fā)酵組,說明黑果酵素具有潛在增強(qiáng)小鼠免疫力的作用。

表1 小鼠體重、脾臟、胸腺指數(shù)的對比

注:同列不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05),表2～表6同。

2.3 黑果酵素對小鼠血清和肝臟MDA含量的影響

從表2可以看出,模型組小鼠血清、肝臟中MDA含量較正常組小鼠顯著升高。與模型組相比,黑果未發(fā)酵組與黑果發(fā)酵組小鼠MDA含量均有降低,且發(fā)酵組的效果顯著好于未發(fā)酵組,因?yàn)榘l(fā)酵組可使小鼠血清中MDA含量回歸到正常水平,使肝臟中MDA含量顯著低于正常組,說明黑果酵素能夠顯著降低小鼠體內(nèi)MDA含量。

表2 小鼠血清和肝臟MDA含量

2.4 黑果酵素對小鼠血清和肝臟清除羥能力的影響

從表3可以看出,模型組小鼠血清、肝臟對羥自由基的清除能力要顯著低于其他組,黑果發(fā)酵組與黑果未發(fā)酵組較模型組相比,清除羥自由基的能力均有顯著提高,且發(fā)酵組顯著高于未發(fā)酵組,說明黑果酵素可以提高小鼠機(jī)體清除羥自由基的能力,起到抗氧化的效果。

表3 小鼠血清和肝臟清除羥自由基能力

2.5 黑果酵素對小鼠血清和肝臟T-SOD活力的影響

從表4看出,模型組小鼠血清、肝臟中T-SOD活力較正常組小鼠顯著降低。與模型組相比,黑果未發(fā)酵組與黑果發(fā)酵組小鼠血清和肝臟中T-SOD酶活力較模型組顯著增強(qiáng),并且發(fā)酵組小鼠的T-SOD酶活力較未發(fā)酵組顯著提高。

表4 小鼠血清和肝臟T-SOD活力

2.6 黑果酵素對小鼠血清和肝臟GSH-Px活力的影響

從表5看出,模型組小鼠血清、肝臟中GSH-Px活力較正常組小鼠顯著降低。與模型組相比黑果發(fā)酵組小鼠血清和肝臟中GSH-Px活力顯著升高,說明黑果酵素具有提高小鼠體內(nèi)GSH-Px活力的作用。

2.7 黑果酵素對小鼠血清和肝臟CAT活力的影響

從表6看出,模型組小鼠血清和肝臟中CAT活力較正常組小鼠顯著降低,黑果未發(fā)酵組與黑果發(fā)酵組小鼠血清和肝臟中CAT活力較模型組顯著提高,且發(fā)酵組酶活力要高于未發(fā)酵組。說明黑果可以提高小鼠CAT活力,且發(fā)酵后提高CAT活力效果更佳。

表5 小鼠血清和肝臟GSH-Px活力

表6 小鼠血清和肝臟CAT活力

3 結(jié)論

3.1 對模型組小鼠連續(xù)7周注射D-半乳糖后,與空白組相比,小鼠血清與肝臟中MDA含量顯著升高,清除羥自由基能力、CAT、T-SOD、GSH-Px活力顯著下降,說明D-半乳糖誘導(dǎo)的致衰老模型構(gòu)建成功。

3.2 黑果酵素發(fā)酵12 d后具有良好的體外抗氧化能力,能有效清除DPPH、超氧陰離子,并且總酚含量顯著增加。黑果發(fā)酵組小鼠的免疫器官指數(shù)較模型組、未發(fā)酵組均顯著升高,血清和肝臟中T-SOD、GSH-Px、CAT活力顯著提高,MDA的含量顯著下降,且對羥自由基的清除能力顯著增強(qiáng),說明黑果酵素可以起到抗氧化、延緩衰老的效果。本文可為黑果酵素抗氧化機(jī)理的研究提供一定的參考,但關(guān)于黑果酵素的抗氧化機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

[1]劉芳芳,魯亞星,于帥，等.黑果腺肋花楸花青素的提取工藝及其穩(wěn)定性[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報,2015,37(3):196-201.

[2]韓文忠,馬興華.黑果腺肋花楸的生物學(xué)特性和應(yīng)用價值[J].遼寧林業(yè)科技,2005(4):40-42.

[3]玄永浩,金英善.黑果腺肋花楸化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2009(20):101-102,104.

[4]Li J,Deng Y,Yuan CH,et al. Antioxidant and Quinone Reductase-Inducing Constituents ofBlackChokeberry(Aroniamelanocarpa)Fruits[J]. Journal of Agricultural and Food

Chemistry,2012,60(46):11551-11559.

[6]Worsztynowicz P,Napieraa M,Biaas W,et al. Pancreaticα-amylase and lipase inhibitory activity of polyphenolic compounds present in the extract ofBlackChokeberry(AroniamelanocarpaL.)[J]. Process Biochemistry,2014,49(9):1457-1463.

[7]Ciocoiu M,Badescu L,Miron A,et al. The involvement of a polyphenol-rich extract ofBlackChokeberryin oxidative stress on experimental arterial hypertension[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2013,2013:1-8.

[8]Kim B,Park Y,Wegner CJ,et al. Polyphenol-richBlackChokeberry(Aroniamelanocarpa)extract regulates the expression of genes critical for intestinal cholesterol flux in Caco-2 cells[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry,2013, 24(9):1564-1570.

[9]Graversen HB,Becker EM,Skibsted LH,et al. Antioxidant synergism between fruit juice andα-tocopherol. A comparison between high phenolicBlackChokeberry(Aroniamelanocarpa)and high ascorbic blackcurrant(Ribes nigrum)[J]. European Food Research and Technology,2008,226(4):737-743.

[10]Hwang SJ,Yoon WB,Lee O,et al. Radical-scavenging-linked antioxidant activities of extracts from blaBlackChokeberryand blueberry cultivated in Korea[J]. Food Chemistry,2014,146(1):71-77.

[11]陳宏運(yùn),崔紅燕,吳彬彬,等. 植物發(fā)酵液對D-半乳糖致衰老模型小鼠的抗氧化活性研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2015(8):7-11,17.

[12]艾學(xué)東,胡麗娜. 水果植物復(fù)合酵素飲料的研制[J]. 食品與發(fā)酵科技,2015(2):105-108.

[13]Li YH,Jiang B,Zhang T,et al. Antioxidant and free radical-scavenging activities of chickpea protein hydrolysate[J]. Food Chemistry,2008,106(2):444-450.

[14]楊明琰,張曉琦,沈儉，等.超氧化物歧化酶兩種鄰苯三酚自氧化測定活力方法的比較[J].微生物學(xué)雜志,2006,26(3):40-42.

[15]文鏡,賀素華,楊育穎,等. 保健食品清除自由基作用的體外測定方法和原理[J].食品科學(xué),2004,5(11):190-194.

[16]蔣增良,毛建衛(wèi)，黃俊，等. 葡萄酵素在天然發(fā)酵過程中體外抗氧化性能的變化[J]. 中國食品學(xué)報,2014(10):29-34.

[17]王瑩. 巖藻聚糖硫酸酯酶產(chǎn)生菌的篩選、酶學(xué)性質(zhì)研究及酶解產(chǎn)物抗氧化活性預(yù)測系統(tǒng)的建立[D].青島：中國海洋大學(xué),2013.

Antioxidant activity ofAroniamelanocarpaenzyme

HUANG Hai1,2,WANG Ying3,GUO Yun-xia3,TAO Wen-jing3,JIA Xi-wen3，XU Yan3

(1.College of Food Engineering,Qinzhou University,Qinzhou 535011,China; 2.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Development and High-value Utilization of Beibu Gulf Seafood Resource,Qinzhou 535011,China; 3.Qingdao Agricultural University,College of Food Science and Enginnering,Qingdao 266109,China)

TheAroniamelanocarpaenzyme was fermented by Lactobacillus,the changes of total phenols,antioxidant activities during fermentation process and anti-aging effect were investigated by the aging mice induced by D-galactose. The result showed that comparing with before fermentation,with the increase of fermentation time the content of total phenols,superoxide anion scavenging activity and DPPH·scavenging activity increased 2.42,1.69,0.088 times,theinvitroantioxidant activity ofAroniamelanocarpaenzyme was significantly enhanced(p<0.05). Compared with the model group and unfermented group,the index of body weight and immune organs,activities of T-SOD,CAT,scavenging ratio of ·OH radicals in plasma and liver of fermented group were significantly increased(p<0.05). In addition,the content of MDA significantly reduced(p<0.05). The results showed that theAroniamelanocarpaenzyme had anti-oxidant effect on aging model mice.

Aroniamelanocarpa;fermentation;anti-oxidant

2016-05-20

黃海(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：從事食品科學(xué)方面的研究,E-mail:1240578407@qq.com。

廣西高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目(KY2016YB493)。

TS218

A

1002-0306(2016)22-0336-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.057