白及多糖的超聲-微波協(xié)同提取工藝及其抗氧化活性研究

蔡錦源,熊建文,黃燕芬,趙耀胤,張彩云,劉煒煒,韋坤華,*

(1.廣西科技大學(xué)鹿山學(xué)院,食品與化學(xué)工程系,廣西柳州 545616;2.廣西藥用植物園,廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530023;3.平南中等職業(yè)技術(shù)學(xué)校,廣西平南 537300)

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白及多糖的超聲-微波協(xié)同提取工藝及其抗氧化活性研究

蔡錦源1,2,熊建文1,黃燕芬2,趙耀胤3,張彩云1,劉煒煒1,韋坤華2,*

(1.廣西科技大學(xué)鹿山學(xué)院,食品與化學(xué)工程系,廣西柳州 545616;2.廣西藥用植物園,廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530023;3.平南中等職業(yè)技術(shù)學(xué)校,廣西平南 537300)

超聲-微波協(xié)同提取,白及,多糖,抗氧化活性

中藥白及為蘭科植物白及(Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.)的干燥塊莖,具有收斂止血、消腫生肌之功效,臨床上廣泛用于治療咳血、吐血、潰瘍疼痛、手足皸裂等癥,具有抑菌、抗腫瘤等生物活性[1-5]?，F(xiàn)代研究表明白及的主要藥用成分為白芨膠,又稱白及多糖[6]。目前白及多糖主要以提取為主,提取方法主要有熱水浸提法[7]、超聲波提取法[8]和酶提取法[9]和紅外輻射提取法[10],這些提取方法存在提取時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)品品質(zhì)低和提取率低等缺點(diǎn)。Qu Y[10]和芮海云等[11]對(duì)白及多糖的抗氧化活性進(jìn)行了研究,但研究結(jié)果存在較大差異,有必要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

文獻(xiàn)報(bào)道超聲-微波協(xié)同提取技術(shù)可有效提高有效成分的提取效率[12-14],但目前尚未有關(guān)白及多糖的超聲-微波協(xié)同提取的研究報(bào)道。本研究旨在以白及多糖得率為指標(biāo),采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選白及多糖的超聲-微波協(xié)同提取工藝條件,并對(duì)白及多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行研究,以期為優(yōu)選白及多糖的提取方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白及 購自玉林藥材市場(chǎng),經(jīng)廣西藥用植物園林楊助理研究員鑒定為蘭科植物白及的塊莖;苯酚、濃硫酸、乙醇、石油醚、葡萄糖、VC、雙氧水、1,1-二苯基-2-苦肼基、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、硫酸亞鐵、水楊酸等 國產(chǎn)分析純。

UV-5100紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;JY1002(0.01 g)電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;FW100高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀 超聲波功率/頻率:50W(固定)/40 kHz,微波功率/頻率:0～1000W(任意可調(diào))/2450 MHz,上海新拓分析儀器科技有限公司;HH-S21-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;TDL-80-2B低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白及多糖的提取工藝路線 白及→干燥(50 ℃)→預(yù)處理(石油醚脫脂為2倍體積回流提取2 h,脫色為2倍體積80%乙醇，常溫浸泡3 h后干燥)→粉碎→過篩(60目)→稱量→超聲-微波協(xié)同提取(超聲功率為50 W)→真空抽濾→濃縮→醇沉(加4倍95%乙醇)→離心(3000 r/min,20 min)過濾后復(fù)溶脫蛋白→二次醇沉得粗多糖。

1.2.2 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(苯酚-硫酸法) 采用苯酚-硫酸法[15]測(cè)定總糖濃度。以吸光度為縱坐標(biāo),總糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為:A=66.61429X-0.014,R2=0.9999。表明線性關(guān)系良好,線性范圍為0.0025～0.0175 mg/mL。

1.2.3 白及多糖的含量測(cè)定及其得率的計(jì)算方法 將白及粉末(2.00 g)按方法“1.2.1”進(jìn)行提取,制備的粗多糖溶解并定容,按方法“1.2.2”,以空白校正零點(diǎn),于490 nm處測(cè)定其吸光度,根據(jù)總糖標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算總糖濃度,按式(1)計(jì)算總糖含量,多糖得率按式(2)計(jì)算[16]:

W=N×X/1000

式(1)

Y(%)=W/M×100

式(2)

其中:W為總糖含量,g;N為稀釋倍數(shù);X為總糖濃度,mg/mL;Y為白及多糖得率,%;M為白及投料質(zhì)量,g。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 精密稱取2.00 g白及樣品粉末,開啟超聲開關(guān),超聲波功率為50 W,其余4個(gè)因素條件設(shè)定為液料比20∶1 mL/g,浸泡時(shí)間8 min,微波功率250 W和微波時(shí)間4 min,固定其中3個(gè)因素條件,分別考察各因素對(duì)白及多糖得率的影響,各因素考察水平分別為液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g),浸泡時(shí)間(0、2、4、6、8、10、12 min),微波功率(50、100、150、200、250、300 W),微波時(shí)間(2、3、4、5、6、7 min)。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交設(shè)計(jì)表L9(34)對(duì)超聲-微波協(xié)同提取的影響因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.2.6 相互作用方式分析 在正交設(shè)計(jì)優(yōu)選的最優(yōu)工藝條件的基礎(chǔ)上,將超聲-微波協(xié)同提取與單獨(dú)超聲波輔助、單獨(dú)微波輔助提取進(jìn)行比較[12],分析協(xié)同提取高效的原因。具體參數(shù)設(shè)置如表2所示。

1.2.7 白及多糖體外抗氧化活性的測(cè)定

1.2.7.1 ·OH的清除率的測(cè)定 采用Fenton法[17-18]分別測(cè)定白及多糖和VC對(duì)·OH的清除率,即配制不同質(zhì)量濃度(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)的多糖樣品溶液,在試管中依次加入0.09 mol/L FeSO4溶液、0.09 mol/L水楊酸-乙醇溶液,搖勻后加入

表2 白及多糖超聲-微波協(xié)同提取相互作用分析

質(zhì)量濃度不一樣的多糖溶液,最后加入0.08 mol/L H2O2溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng),37 ℃水浴1 h。冷至室溫后定容到10 mL,用蒸餾水調(diào)零,在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)吸光度,每組做3個(gè)平行樣,取平均值。在其他條件不變的情況下,改動(dòng)三種試劑做相應(yīng)實(shí)驗(yàn):以蒸餾水替換多糖溶液做空白對(duì)照;以VC替換多糖溶液作為陽性對(duì)比;以蒸餾水替換H2O2溶液測(cè)多糖本底液吸光度。按式(3)計(jì)算·OH清除率。

清除率(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100

式(3)

式中:A0-空白對(duì)照吸光度;Ax-樣品溶液吸光度;Ax0-樣品本底液吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

將得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用Excel、正交設(shè)計(jì)助手V3.1和Origin7.5對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)多糖得率的影響 由圖1可知,隨著液料比從10∶1增加到20∶1時(shí),多糖得率迅速增大,液料比為20∶1時(shí)多糖得率達(dá)到最大值,但當(dāng)液料比增加至20∶1以后,多糖得率上升趨勢(shì)非常緩慢,并有下降趨勢(shì),原因可能是在其他操作條件相同的情況下,適當(dāng)增大液料比有利于多糖溶出,但是液料比過大,在一定的微波功率和提取時(shí)間下,微波作用反而降低,不利于破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁,多糖溶出減弱,多糖得率反而下降[20],故液料比以20∶1為宜。

圖1 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effects of liquid/solid ratio on polysaccharide yield

2.1.2 浸泡時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 由圖2可知,隨著浸泡時(shí)間的不斷增加,多糖得率也顯著增加,但當(dāng)浸泡時(shí)間6 min之后,多糖得率基本維持在一個(gè)水平,增大較緩慢。原因可能是:熱浸泡有利于植物細(xì)胞溶脹,使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜在后續(xù)的微波和超聲波作用下破裂,有利于多糖的溶出,而當(dāng)浸泡時(shí)間6 min以后,延長(zhǎng)浸泡時(shí)間對(duì)后續(xù)操作無明顯增效作用,對(duì)多糖得率的提升不明顯,即溶脹效果已達(dá)到最佳狀態(tài),繼續(xù)延長(zhǎng)浸泡時(shí)間反而增加了操作時(shí)間,故浸泡時(shí)間以6 min為宜。

圖2 浸泡時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effects of immersion time on polysaccharide yield

2.1.3 微波功率對(duì)多糖得率的影響 由圖3可知,隨著微波功率的增加,多糖得率也逐漸增加,當(dāng)微波提取功率為200 W時(shí),多糖得率達(dá)到最大值,但當(dāng)微波功率高于200 W之后,多糖得率逐漸下降，故微波功率以200 W為宜。原因可能是:微波的內(nèi)加熱效應(yīng)迫使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破裂,多糖組分迅速離開細(xì)胞溶解到水中,當(dāng)微波功率逐漸增大時(shí),熱效應(yīng)也不斷增強(qiáng),多糖得率逐漸上升,微波功率為200 W時(shí),多糖得率達(dá)到最大值;但當(dāng)微波功率繼續(xù)增大時(shí),溶出的多糖被過度加熱,部分多糖被分解成小分子糖,在醇沉的時(shí)候,部分小分子糖溶解在95%的乙醇溶液中,從而降低了白及多糖得率;且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)微波功率為300 W時(shí),醇沉物質(zhì)顏色較暗,原因可能是較高的微波功率產(chǎn)生較多的能量,部分原料糊化,且提取溶液中雜質(zhì)增多,不利于后期的純化,故微波功率以200 W為宜。

圖3 微波功率對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effects of microwave power on polysaccharide rate

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 由圖4可知,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),多糖得率也顯著增加,當(dāng)微波時(shí)間為4 min時(shí),多糖得率達(dá)到最大值6.56%,但是當(dāng)微波時(shí)間大于4 min之后,多糖得率逐漸下降。原因可能是隨著提取時(shí)間的增加,微波輻射不斷增強(qiáng),有利于破壞原料的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁,多糖得率迅速增加,但是當(dāng)提取時(shí)間過長(zhǎng)時(shí),微波輻射能力越來越強(qiáng),微波輻射時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致部分多糖水解加大,經(jīng)醇沉后,粗多糖收率降低,且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)提取時(shí)間超過6 min后,物料開始糊化。由上述分析可知,提取時(shí)間以4 min為宜。

表5 對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effects of extration time on polysaccharide yield

2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)表1的因素和水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),結(jié)果如表3所示。由表3直觀分析可以看出:影響超聲-微波協(xié)同提取工藝的順序大小為:浸泡時(shí)間(B)>液料比(A)>微波功率(C)>提取時(shí)間(D),最優(yōu)工藝組合為:A2B2C2D3,即液料比20∶1,浸泡時(shí)間6 min,微波功率200 W,微波時(shí)間5 min。由表4可知,A和B對(duì)白及多糖得率有顯著影響(p<0.05),而C和D則無顯著影響(p>0.05)。按最優(yōu)工藝條件分別進(jìn)行3次提取實(shí)驗(yàn),白及多糖的平均得率為6.98%±0.19%,高于正交實(shí)驗(yàn)表中的9個(gè)實(shí)驗(yàn)組合,表明實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)穩(wěn)定、可行。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

注:*代表顯著性,即F比>F0.05臨界值。2.3 白及多糖的協(xié)同提取作用分析

按表2的工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行提取實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表5所示。由表5可知,c法的多糖得率顯著高于a法和b法,a法和b法提取的多糖得率僅為c法的46.28%和87.96%。a法與c法對(duì)比表明,微波可極大地提高超聲提取效率,b法與c法對(duì)比表明,超聲波亦可促進(jìn)微波提取效率,提高多糖得率,因此超聲-微波協(xié)同提取白及多糖高效的原因可能是超聲波和微波2種方法優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、相互協(xié)同所產(chǎn)生的結(jié)果,從而大大提高了白及多糖的得率,即提高了提取效率,這與劉常金等[12]研究結(jié)果一致。

2.4 白及多糖抗氧化活性研究

b法和c法制備的白及多糖對(duì)DPPH·具有一定的清除作用,且清除率與濃度呈量效關(guān)系,當(dāng)多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí),白及多糖對(duì)DPPH·的清除率分別為67.16%和74.21%;在相同濃度下c法制備的白及多糖對(duì)DPPH·的清除率較b法高,且均高于Qu Y等[10]的研究結(jié)果,原因可能是不同提取方法制備的多糖抗氧化活性存在差異[22]。

圖5 多糖對(duì)和DPPH·的清除能力Fig.ability of polysaccharides

3 結(jié)論

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Study on ultrasonic-microwave synergistic extraction of polysaccharose fromBletillastriataand its antioxidant activity

CAI Jin-yuan1,2,XIONG Jian-wen1,HUANG Yan-fen2,ZHAO Yao-yin3, ZHANG Cai-yun1,LIU Wei-wei1,WEI Kun-hua2,*

(1.Department of Food and Chemical Engineering,Lushan College of Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545616,China; 2.Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Protection and Genetic Improvement, Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant,Nanning 530023,China; 3.Pingnan SecondaryVocational and Technical School,Pingnan 537300,China)

ultrasonic-microwave synergistic extraction;Bletillastriata;polysaccharide;antioxidant activity

2016-05-06

蔡錦源(1987-)，男，碩士，講師，研究方向：植物有效成分提取純化技術(shù)，E-mail:jingyuan025163@163.com。

*通訊作者:韋坤華(1983-)，女，博士，副研究員，研究方向：藥用植物生物技術(shù)，E-mail:divinekh@163.com。

國家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(201507002 );中央財(cái)政林木良種苗木培育補(bǔ)貼項(xiàng)目(2015);廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科合14125008-2-21);廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科重14124002-1);南寧市科技局重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(20163157);廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KY2015YB523)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)22-0274-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.045