科爾沁地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵奶豆腐中乳酸菌的鑒定

李 華,王 華,夏春麗,冀照君,孫立杰

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼 028000)

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科爾沁地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵奶豆腐中乳酸菌的鑒定

李 華,王 華*,夏春麗,冀照君,孫立杰

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼 028000)

從科爾沁地區(qū)采集到5份傳統(tǒng)發(fā)酵制作的奶豆腐樣中分離出12株供試菌株,將分離的菌株的16S rDNA進行PCR擴增、序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,12株菌株都屬于乳酸菌(LacticAcidBacteria),其中6株乳桿菌(Lactobacillus),分別是植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)4株、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)1株、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)1株;6株乳球菌(Lactococcus)分別是乳糖片球菌(Pediococcusacidilactici)5株和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)1株。鑒定結(jié)果與生理生化實驗結(jié)果一致,且以乳酸片球菌和植物乳桿菌為優(yōu)勢菌群。

乳酸菌,16S rDNA,生理生化實驗,序列分析,鑒定

乳酸菌是指一類在發(fā)酵過程中能夠發(fā)酵糖類物質(zhì)產(chǎn)生乳酸的無芽孢、革蘭氏染色呈陽性的細菌。這類細菌在自然界中存在廣泛,可分為23個屬、220多個種,主要包括乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬和片球菌屬等[1]。乳酸菌是對人類健康有益的公認(rèn)安全(generally recognizedas safe,GRAS)的微生物。用乳酸菌發(fā)酵的食品不僅不會生成毒性物質(zhì),還會產(chǎn)生乳酸及一些特殊的芳香物質(zhì),在提高食品營養(yǎng)價值的同時又賦予了食品特殊的風(fēng)味,因此被人們所喜愛[2]。

科爾沁地區(qū)位于內(nèi)蒙古東北部,是蒙古族比較集中的半農(nóng)半牧區(qū),至今仍然占全區(qū)蒙古族總?cè)丝诘娜种?這里的牧民長期以來沿用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵方法制作具有民族特色的傳統(tǒng)乳制品。奶豆腐(蒙古語為“胡如塔”)作為內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古族家庭經(jīng)常食用的主要傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品之一,其采用生奶自然發(fā)酵,至乳清與乳酪分離后煮沸而制成[3]。奶豆腐發(fā)酵工藝獨特、品種繁多、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富,能夠較好地保存當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境中的有益微生物——乳酸菌[4-6]。

16S rDNA序列分析技術(shù)是一種比較權(quán)威和準(zhǔn)確的細菌鑒定方法。乳酸菌的16S rDNA含有1540個核苷酸,大小適中,其結(jié)構(gòu)和功能都具有高度保守性,一直以來都被人們稱之為“細菌化石”[7-8]。Fabio Minervini等[9]人2012年采用兩對引物對發(fā)酵面團中乳酸菌16S rDNA進行擴增分析菌群的生物多樣性,以此來研究乳酸菌和酵母菌對面包風(fēng)味的影響。Naphatrapi Luangsakul等[10]通過16S rDNA序列分析了生面團中乳酸菌的生物多樣性。因此,采用16S rDNA序列分析法對乳酸菌進行鑒定,不僅可以避免樣品中微生物的丟失,而且可以反映樣品中微生物菌群的多樣性,是近年來使用較多的一種分離鑒定方法。

本文以科爾沁地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵工藝制作的奶豆腐為研究對象,采用16S rDNA序列分析技術(shù)對從不同地區(qū)不同牧民家庭采集的奶豆腐樣品中的乳酸菌進行分離鑒定,并通過生理生化實驗對其進行驗證,為科爾沁地區(qū)乳酸菌資源的整理提供借鑒,同時為科爾沁地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的工業(yè)化生產(chǎn)和品質(zhì)改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所有實驗材料 都來源于科爾沁地區(qū)地理位置不同的5個牧民家庭通過傳統(tǒng)工藝發(fā)酵制作的乳制品——奶豆腐,共5個樣品;Ex-Taq E、DL2 000 DNA Marker 均購自TaKaRa公司;分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000 DNA Marker、16S rDNA擴增引物 均購自北京莊盟公司;革蘭氏陽性菌提取試劑盒 購于TIAN GEN公司;乳酸菌微量生化鑒定試劑盒 上海士鋒生物科技有限公司;常規(guī)化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純試劑;MRS培養(yǎng)基 10 g蛋白胨,10 g牛肉膏,5 g酵母膏,2 g檸檬酸氫二銨,20 g葡萄糖,1.0 mL吐溫80,5 g乙酸鈉,2 g磷酸氫二鉀,2 g硫酸鎂,2 g硫酸錳,20 g瓊脂,定容至1000 mL,調(diào)pH至6.2～6.6,分裝后121 ℃滅菌15 min;M17 培養(yǎng)基 5 g植物蛋白胨,5 g酵母粉,5 g聚蛋白胨,0.5 g抗壞血酸,2.5 g牛肉膏,0.01 g硫酸鎂,19 gβ-甘油磷酸二鈉,定容至1000 mL,121 ℃滅菌15 min。

TGL-16M高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;UV5Nano微量紫外可見分光光度計 瑞士梅特勒-托利多;YM100Z全自動高壓蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司;HHS-21 電熱恒溫水浴鍋、DZF-6020電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司;JY04S-3C 凝膠成像分析系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;SPH-1102C恒溫培養(yǎng)箱 上海世平實驗設(shè)備有限公司;HZS-H型水浴振蕩器 江蘇金壇友聯(lián)儀器研究所;BSA-224S分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;PHS-25pH計 上海雷磁儀器廠;Eppendorf-Matercycler基因擴增儀 Eppendorf公司;DYY-6C電泳儀 北京六一生物科技有限公司;厭氧培養(yǎng)瓶 美國bioMerieux,Inc。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集及處理 將牧民自然發(fā)酵制作的奶豆腐,用無菌刀片切片后每個樣品取3份裝入無菌容器中。在采樣現(xiàn)場利用便攜式pH計和溫度計測試采樣時奶豆腐的pH(3.8～4.2)和溫度(10.8～18.9 ℃)。將收集的樣品放入冰盒內(nèi)冷卻,間隔一定時間更換冰袋,保持較低的溫度下帶回實驗室后放于4 ℃冰箱,盡快進行乳酸菌的分離,共5個奶豆腐樣品。

1.2.2 乳酸菌的分離及保存 分別稱取1.0 g奶豆腐樣品置于90 mL磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中,經(jīng)振蕩混勻后稀釋至10-4倍,按1∶10的比例加到滅菌的10 mL液體MRS培養(yǎng)基中于厭氧培養(yǎng)瓶內(nèi),37 ℃,靜置培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)液100 μL涂布于MRS瓊脂平板上,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,挑取單菌落,液體培養(yǎng)后再進行劃線分離,對分離得到的單菌落進行菌株革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗[11],初步確定的菌株置于-80 ℃保存,備用。

1.2.3 乳酸菌DNA提取及純度鑒定 使用革蘭氏陽性菌提取試劑盒分別提取分離菌株的基因組DNA。取上述提取液3 μL用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。同時取2 μL提取液使用微量紫外可見分光光度計在260、280 nm下分別測定提取液中乳酸菌DNA濃度及OD260/OD280。

1.2.4 PCR擴增乳酸菌16S rDNA 根據(jù)NCBI上查詢到的乳酸菌16S rDNA的基因序列,使用軟件Primer primer 5.0設(shè)計一對16S rDNA擴增引物。正向引物16S-A:TAGACGGCTGGCTCCTTGC;反向引物:16S-S:TGGCGGCGTGCCTAATACA。以提取的DNA為模板,體系中加入Ex-Taq 聚合酶,設(shè)定擴增程序:94 ℃,120 s;94 ℃,20 s:57 ℃,20 s,72 ℃,50 s,35個循環(huán);72 ℃,10 min;4 ℃保溫[12-14]。PCR擴增后,產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴增成功的PCR產(chǎn)物送至上海生工測序檢測。

1.2.5 同源性分析 將從5份奶豆腐樣品中分離出的12株菌株的16S rDNA基因序列全部與GenBank數(shù)據(jù)庫中的參考菌株序列進行比對,確定其屬種。并利用軟件Mega5.10 鄰接法(Neighbour-joining)進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,其自展值(bootstrap value)為1000[15-16],以同源性大于95%為種的分界閾值將待測菌株鑒定到種。

1.2.6 生理生化鑒定 供試菌株中革蘭氏染色呈陽性、過氧化氫酶反應(yīng)呈陰性的菌株暫定為乳酸菌,根據(jù)生理生化反應(yīng)現(xiàn)象進一步鑒定各乳酸菌[17-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及純度分析

經(jīng)菌株分離,共從5份奶豆腐樣品中分離得到12株革蘭氏染色呈陽性、過氧化氫酶反應(yīng)呈陰性的菌株。經(jīng)革蘭氏陽性菌基因提取試劑盒提取12株菌株的DNA,提取產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,其結(jié)果如圖1所示。

圖1 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測分析Fig.1 Electrophoresis of the genomic DNA注:M:DL15000 bp Marker(250,500,1000,1500,2500,5000,7500,10000,15000);1:NDF-1;2:NDF-2;3:NDF-3;4:NDF-4;5:NDF-5;6:NDF-6;7:NDF-7;8:NDF-8;9:NDF-9;10:NDF-10;11:NDF-11;12:NDF-12。

從圖1可知,12株乳酸菌的DNA大小都在20 kbp左右,完整性較好,可滿足后續(xù)實驗的使用。分別取DNA提取液用微量紫外分光光度計檢測其含量。

從表1得知,基因組DNA的濃度最低為298.7 ng/μL,最高為593.7 ng/μL。A260/A280均在1.8～2.0。說明基因組DNA純度較高,能滿足后續(xù)16S rDNA 擴增和測序的需要。

表1 基因組DNA檢測結(jié)果

2.2 16S rDNA的PCR結(jié)果

以16S-A、16S-S為引物,以提取的DNA為模板進行PCR擴增。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析,在大約1.5 kb處有特異性條帶,無拖尾,無彌散現(xiàn)象,說明PCR產(chǎn)物可以用來測序,見圖2。將PCR產(chǎn)物送往上海生工進行核苷酸序列測定,測序引物為PCR引物。測序后每個樣品返回2條序列,每條序列約為800 bp,使用SeqMan軟件將序列拼接后,最終得到1.5 kb左右的基因序列。

圖2 16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測分析Fig.2 Electrophoresis of the PCR amplification of 16S rDNA gene注:M:DL2000 bp Marker(100,250,500,750,1000,2000);1:NDF-1;2:NDF-2;3:NDF-3;4:NDF-4;5:NDF-5;6:NDF-6;7:NDF-7;8:NDF-8;9:NDF-9;10:NDF-10;11:NDF-11;12:NDF-12。

2.3 同源性分析

利用軟件Mega 5.10 鄰接法(Neighbour-joining)進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,如圖3所示。從5份奶豆腐樣品中分了出的12株菌株,其中6株乳桿菌中包括4株植物乳桿菌,1株干酪乳桿菌和1株戊糖乳桿菌,且其同源性均達到97%以上;6株球菌以乳酸片球菌多;6 株乳球菌中包括5株乳糖片球菌和1株戊糖片球菌,其同源性均在99%以上。

圖3 根據(jù)16S rDNA 基因序列繪制的系統(tǒng)樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene alignment

2.4 生理生化鑒定結(jié)果

從5份奶豆腐樣品中共分離出來12株乳酸菌,根據(jù)硝酸鹽實驗、明膠液化實驗、H2S生成實驗、6.5% NaCl生長實驗、4% NaCl生長實驗確定了12株菌株中包括6株球菌、6株桿菌,和16s rDNA的鑒定結(jié)果一致。糖發(fā)酵實驗進一步驗證了桿菌都為乳桿菌屬(Lactobacillus),球菌都為乳球菌屬(Lactococcus),結(jié)果如表2所示。

菌株NFD-1,NFD-2,NFD-7,NFD-10四個菌株的糖發(fā)酵實驗結(jié)果與植物乳桿菌相近,且其基因比對結(jié)果相似度都在98%以上,因此這四個菌就是植物乳桿菌,其樣品來源于科爾沁區(qū)的科爾沁左翼后旗、霍林河、奈曼和扎魯特旗;NFD-3,NFD-4,NFD-5,NFD-6,NFD-9根據(jù)糖發(fā)酵實驗可進一步證明其就是乳糖片球菌,樣品來源于科爾沁左翼后旗、霍林河、奈曼和庫倫,其占到總菌株數(shù)的41.7%,為優(yōu)勢菌群。NFD-8的基因序列與干酪乳桿菌相似度達97%,生理生化鑒定時不能發(fā)酵阿位伯糖、鼠李糖、蜜二糖、棉籽糖,在15 ℃可以生長,確定其為干酪乳桿菌(Lactobacilluscaseizhang),樣品來源于霍林河,霍林河與內(nèi)蒙古錫林郭勒盟交界,而2001年張和平等人[20]在錫林郭勒盟大草原牧民家制作的傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶(koumiss)中分離并篩選獲得的Lactobacilluscaseizhang;菌株NFD-11和NFD-12的樣品來源于扎魯特旗,NFD-11的生理生化反應(yīng)與基因序列比對結(jié)果一致,鑒定為戊糖片球菌;NFD-12的16sDNA序列與戊糖乳桿菌基因序列相似度在97%,結(jié)合糖發(fā)酵實驗,該菌株能夠發(fā)酵鼠李糖,因此鑒定其為戊糖乳桿菌。

表2 科爾沁地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵奶豆腐中乳酸菌鑒定結(jié)果

注:“+”表示實驗陽性;“-”表示實驗陰性;由于球菌碳水化合物發(fā)酵項目較少,故沒有測定的項目用空格表示。

3 結(jié)論與討論

本研究從5份科爾沁地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵奶豆腐樣品中分離得到了12株侍測菌株,經(jīng)16S rDNA基因序列分析與生理生化鑒定結(jié)果如下:植物乳桿菌(Lactobacillusplantarumstrain)4株、干酪乳桿菌(Lactobacilluscaseizhang)1株、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)1株、乳糖片球菌(Pediococcusacidilactici)5株和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)1株。

由此可見,科爾沁地區(qū)發(fā)酵奶豆腐中乳酸菌具有共性。在分離出的12株菌株中,乳糖片球菌占了41.7%,且在科爾沁區(qū)制作發(fā)酵奶豆腐的主要地區(qū)中4個地區(qū)都鑒定分離出該菌,故認(rèn)定其為科爾沁區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵奶豆腐的優(yōu)勢菌群。而王輯等人[21]在做內(nèi)蒙古奶豆腐中潛在益生性乳酸菌的篩選時發(fā)現(xiàn)乳酸片球菌是內(nèi)蒙古奶豆腐中的優(yōu)勢菌群,與本研究結(jié)果相似。5個地區(qū)中,有80%的地區(qū)都分離到了植物乳桿菌,可初步推測植物乳桿菌也是科爾沁區(qū)發(fā)酵奶豆腐的優(yōu)勢菌群之一。

本研究系統(tǒng)地分析了科爾沁地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵奶豆腐制品中乳酸菌的組成,為篩選發(fā)酵乳制品中的益生菌和發(fā)酵劑提供了基礎(chǔ),同時為傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的工業(yè)化生產(chǎn)及其發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù),為科爾沁地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品發(fā)酵過程中微生物定向調(diào)控和微生物資源開發(fā)、利用奠定基礎(chǔ)。

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Identification of lactic acid bacteria isolated from fermented dairy Tofu of Horqin Region

LI Hua,WANG Hua*,XIA Chun-li,JI Zhao-jun,SUN Li-jie

(College of Life Science,Inner Mongolia University for Nationnalities,Tongliao 028000,China)

Twelve strains were isolated from 5 samples of traditional fermented dairy tofu in Horqin Region. Sequence analysis of 16S rDNA after PCR amplification and construct a phylogeny tree was used for the identification of 12 strains. The results demonstrated that the 12 strains were all theLacticacidbacteriastrains,including 6Lactobacillusstrains and 6Lactococcusstrains were respectively:Lactobacillusplantarum(4 strains),Lactobacilluscasei(1strain),Lactobacilluspentosus(1 strain),Pediococcusacidilactici(5 strains),Pediococcuspentosaceus(1strain).The results of sequence analysis of 16S rDNA were in accordance with that of physiological-biochemical tests,PediococcusacidilacticiandLactobacillusplantarumwere dominant microfloras.

lacticacidbacteria;16S rDNA;physiological-biochemical tests;sequence analysis;identification

2016-05-04

李華(1967-)，女，大學(xué)本科，教授，主要從事乳與乳制品工藝學(xué)方面的研究，E-mail:lihuahli@163.com。

*通訊作者:王華(1981-)，女，博士，副教授，主要從事功能性食品與生物反應(yīng)器方面的研究，E-mail:huaking1981@126.com。

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2013MS1220)。

TS202.3

A

1002-0306(2016)22-0222-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.035