4個(gè)茶樹品種自交后代群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

楊 軍，王讓劍，孔祥瑞，鄭國華

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所／國家茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355015）

4個(gè)茶樹品種自交后代群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

楊 軍，王讓劍，孔祥瑞，鄭國華

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所／國家茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355015）

利用EST－SSR對茶樹品種紫玫瑰、金牡丹、茗科1號 （金觀音）、悅茗香及其自然雜交后代，進(jìn)行親緣關(guān)系、遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)分析。16對EST－SSR標(biāo)記共檢測到等位位點(diǎn)125個(gè)，反映位點(diǎn)多態(tài)性水平的PIC值平均值為0．617，變幅為0．159～0．840。參試材料的觀測雜合度、期望雜合度、Nei′s基因多樣性、Shannon信息多樣性指數(shù)的平均值分別為0．579、0．639、0．632、1．281。結(jié)果表明，參試自然雜交后代有較強(qiáng)母本遺傳效應(yīng)，4個(gè)群體具有明顯的群體遺傳組成特征，Structure軟件適宜茶樹品種群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。

茶樹；自然雜交；EST－SSR；親緣關(guān)系；群體結(jié)構(gòu)

茶樹是山茶科山茶屬茶組的多年生常綠木本植物［1］，且為常異花授粉植物，具有高度雜合性，其較為復(fù)雜的群體遺傳結(jié)構(gòu)給育種工作造成了較大難度。EST－SSR來自于功能基因，具有多態(tài)性高、共顯性、技術(shù)簡單、重復(fù)性好等特點(diǎn)，在茶樹遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、群體結(jié)構(gòu)分析、關(guān)聯(lián)分析、種質(zhì)資源鑒定篩選中廣泛應(yīng)用［2－4］。對材料的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)的解析是物種進(jìn)化、等位基因發(fā)掘、復(fù)雜性狀關(guān)聯(lián)分析的重要基礎(chǔ)［5－7］。劉文等［8］對大白菜與白菜群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析，表明白菜與大白菜群體間存在基因交流，且群體與材料的來源地、抗性有明顯的對應(yīng)關(guān)系。茶樹群體結(jié)構(gòu)分析也有大量的研究。王麗鴛等［9］認(rèn)為龍井群體的遺傳分化程度較低。姚明哲等［10］認(rèn)為江北茶區(qū)主要省份間茶樹種質(zhì)的遺傳分化程度低。喬婷婷等［11］認(rèn)為茶樹地方品種、選育品種 （系）具有相對獨(dú)立的群體結(jié)構(gòu)，選育品種 （系）根據(jù)親緣關(guān)系的不同形成不同的類群。吳曉梅等［12］認(rèn)為烏龍茶品種與綠茶品種間的遺傳結(jié)構(gòu)存在差異。本試驗(yàn)對高香烏龍茶品種紫玫瑰、茗科1號 （金觀音）、金牡丹與悅茗香及其自然雜交后代進(jìn)行遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)分析，以期為雜交后代遺傳多樣性與標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

參試材料來源于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，紫玫瑰、金觀音、金牡丹、悅茗香及其自然雜交后代共52個(gè) （每個(gè)母本與自然雜交后代數(shù)量均為13個(gè)），采集各個(gè)材料1芽2葉鮮葉后用液氮迅速冷凍處理，保存在－70℃冰箱中備用。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 基因組DNA的提取 采用改進(jìn)的CTAB法［13］提取茶樹基因組DNA。用1．0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行茶樹基因組分子量大小檢測，用756－MC型紫外分光光度計(jì)測定茶樹基因組DNA的純度（OD260／280比值）。

1．2．2 引物合成 參照文獻(xiàn) ［14］引物序列，序列由上海Sangon公司合成。

1．2．3 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物鑒定 PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 18．8μL，10×Buffer 2．5μL（Mg2＋），dNTP（10mmol·L－1）0．5μL，上、下游primer （10μmol·L－1）各0．5μL，Taq polymerase 0．2 μL（0．5U），模板DNA 1μL。PCR反應(yīng)于美國ABI－9600型擴(kuò)增儀上進(jìn)行，熱循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入下列溫度循環(huán)：94℃變性45s，不同溫度條件退火60s，72℃延伸75s，重復(fù)35個(gè)熱循環(huán)；72℃延伸10min，最后4℃保存。

引物統(tǒng)一在反向引物 （R）的5′段標(biāo)記熒光（FAM／TAMRA），由上海百力格生物科技有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物0．5μL，GeneScanTM500 ROXTM0．5μL，HiDi 9μL，混勻后使用ABI公司3730XL進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1．2．4 群體結(jié)構(gòu)分析 使用Struture 2．3．4［15］進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，先計(jì)算各材料歸屬第k亞群的概率Q值。使用混合模型K值從3設(shè)置到10模擬群體結(jié)構(gòu)，每一個(gè)K值重復(fù)5次。將MCMC迭代設(shè)為100000次，初始burn－in次數(shù)為100000。

1．2．5 數(shù)據(jù)處理 采用ABI公司的GeneMapper 4．0軟件，選擇GeneScanTM500ROXTM作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，對每一個(gè)擴(kuò)增出的條帶記錄大小。運(yùn)用PopGen3．2軟件計(jì)算Shannon信息指數(shù)（I）和Nei′s基因多樣性指數(shù)（H）。運(yùn)用NTSYSpc 2．1中的Tree plot程序進(jìn)行聚類分析。方差分析采用SAS。

2 結(jié)果與分析

2．1 引物多態(tài)性與等位位點(diǎn)分析

從表1中看出，16對EST－SSR標(biāo)記在參試材料中共檢測到等位位點(diǎn)125個(gè)，平均每對引物檢測到7．812個(gè)，其中最多為TM345為13個(gè)，多態(tài)性十分豐富；16對引物的PIC值平均為0．617，高于0．5，篩選出來的引物具有較強(qiáng)鑒定能力；根據(jù)Nei（1978）提供的公式計(jì)算觀測雜合度與期望雜合度平均值分別為0．581與0．662，數(shù)值比較接近，說明篩選的引物檢測到的等位基因在4個(gè)群體中分布相對均勻。

2．2 自然雜交后代與母本遺傳分析

在相似系數(shù)0．76處，52份材料被分為3組，第I組主要為金觀音與金牡丹及其自然雜交后代，且金牡丹及其自然雜交后代主要集中在第i組，第II組主要為紫玫瑰及其自然雜交后代，第III組主要為悅茗香及其自然雜交后代 （圖1）。參試自然雜交后代都與母本親緣關(guān)系近，且方差分析結(jié)果表明金牡丹、悅茗香與其自然雜交后代的相似系數(shù)顯著高于金觀音與紫玫瑰 （表2），說明參試的自然雜交后代具有較強(qiáng)母本遺傳效應(yīng)，且參試金牡丹、悅茗香的自然雜交后代母本遺傳效應(yīng)強(qiáng)于金觀音與紫玫瑰。

表1 參試材料的擴(kuò)增結(jié)果Table 1 Amplified results of tested materials

2．3 群體間遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用Structure軟件對參試材料群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)解析 （圖2）。當(dāng)類群數(shù) （K值）在2～7變化時(shí)，△K值在K＝4時(shí)達(dá)到最大值，表明52份參試材料可以劃分為4個(gè)類群。當(dāng)以類群屬性比率（研究材料的遺傳組分在各類群上的分布百分比，≥50%的遺傳組分稱為類群屬性比率，＜50%的遺傳組分則稱為非類群屬性比率［6］）作為劃分依據(jù)時(shí)，52份材料中，有49份（94．3%）被劃分到4個(gè)類群中的一個(gè)，而剩余的3份 （5．8%）則沒有明確的類群歸屬特性，形成了一個(gè)混合類群P（表3）。依據(jù)各類群所包含材料的系譜等信息，這4個(gè)類群依次確定為S1類群（25．0%）、S2類群（19．2%）、S3類群（26．9%）與S4類群（23．1%）。

表2 不同母本與其自然雜交后代的相似系數(shù)比較Table2 Similarity coefficients on various females and theirnatural hybrid progenies

圖1 遺傳相似系數(shù)聚類圖Fig．1 Dendrogram of genetic similarity

圖2 假設(shè)K＝4時(shí)群體按照所估計(jì)的成分 （Q）值的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig．2 Structures under assumed cluster number（k＝4）and sorted by estimated membership coefficients of individual samples in 4 clusters

2．4 群體間聚類與遺傳多樣性情況

軟件PopGen計(jì)算按來源分類群的相似系數(shù)和按Structure軟件結(jié)果分類群的相似系數(shù)，并用NTSYS繪制UPGMA圖3。在相似系數(shù)為0．80處，2種分群聚類結(jié)果都顯示金觀音、金牡丹、紫玫瑰及其自然雜交后代聚類在一起，悅茗香及其雜交后代群體單獨(dú)聚類。從表4中看出，按材料來源分類群，4個(gè)類群Shannon信息指數(shù)的方差分析未達(dá)到顯著差異；而按Structure軟件結(jié)果分類群，5個(gè)類群在Shannon信息指數(shù)的方差分析達(dá)到顯著差異；說明按Structure軟件結(jié)果分類群，類群間遺傳組成特征更顯著。

表3 52份材料的群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistic analysis on population structures of 52 samples

圖3 群體遺傳相似系數(shù)聚類圖Fig．3 Dendrogram on genetic similarity among groups

表4 群體遺傳多樣性比較Table 4 Genetic diversity of various groups

3 討論

金觀音、金牡丹、紫玫瑰都為鐵觀音與黃棪的人工雜交后代［16］，親緣關(guān)系較近［17］。Struture軟件將參試材料分為4個(gè)類群，其中悅茗香及其自然雜交后代、紫玫瑰與其自然雜交后代類群，與NTSYS聚類結(jié)果相似，金觀音、金牡丹及其自然雜交后代類群與NTSYS聚類結(jié)果有所不同，NTSYS聚類僅將金牡丹、金觀音及其雜交后代分為1個(gè)類群。Struture群體結(jié)構(gòu)分析顯示，將金牡丹、金觀音及其雜交后代分為2個(gè)類群，其中類群S1為金觀音、金牡丹、紫玫瑰的自然雜交后代，參試自然雜交后代受母本遺傳效應(yīng)影響較大，類群S1反映的類群屬性可能由于金觀音、金牡丹、紫玫瑰具有相同的鐵觀音或黃棪親本來源，與參試材料來源背景更為相符。綜合分析，Struture軟件能更好的分析參試材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)，與魏世平［5］分析中國栽培大豆群體結(jié)構(gòu)不同分類方法比較的結(jié)果一致。

劉金［18］等認(rèn)為小扁豆種質(zhì)資源的PCA分析和Structure遺傳結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果相互間完全吻合。按材料來源分類群和Struture軟件結(jié)果分類群結(jié)果進(jìn)行PopGen檢測，看出對于親緣關(guān)系來源比較近的群體，用Struture軟件結(jié)果進(jìn)行分類優(yōu)于按材料來源對參試材料進(jìn)行分類，對于來源親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)的群體，2種分類群方法結(jié)果差異不大，如本研究中對紫玫瑰、悅茗香及其雜交后代的分類。

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Genetic Structure of Natural Hybrids of Four Tea Varieties

YANG Jun，WANG Rang－jian，KONG Xiang－rui，ZHENG Guo－h(huán)ua
（Tea Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences／Fujian Branch，National Center for Tea Improvement，F(xiàn)u’an，F(xiàn)ujian355015，China）

EST－SSR was used to analyze the genetic polymorphism，relationship，and population structure of Zimeigui，Jinmudan，Mingke 1（Jinguanyin），Yuemingxiang，and the natural hybrids of Zimeigui，Jinmudan，Jinguanyin，and Yuemingxiang．A total of 125alleles were amplified using 16pairs of EST－SSR primers．The average PIC was 0．617，varying from 0．159to 0．840．The average observed heterozygosity，expected heterozygosity，Nei′s genetic diversity，Shannon information diversity index among them were 0．579，0．639，0．632，and 1．281，respectively．A strong maternal parental effect seemed apparent as shown by the genetics of the natural hybrids．The population structures of the 4groups had distinctive genetic characteristics．It was concluded that the software applied could be adequately used for analyzing the genetic structures of tea populations．

tea plant；natural hybrids；EST－SSR；genetic relationship；population structure

S571．1；Q311

：A

：2096－0220（2016）02－0059－04

2016－02－23初稿；2016－05－04修改稿

福建省現(xiàn)代農(nóng)業(yè) （茶葉）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 （2014～2016）；農(nóng)業(yè)部福建茶樹及烏龍茶加工科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站 （2011～2015）。

楊軍（1981－），男，碩士，助理研究員，從事茶樹種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E－mail：yangjun007＠qq．com