鰤魚諾卡氏菌與黃粉色諾卡氏菌原生質(zhì)體融合的研究

王英華，陳建林，徐 亮，張紅蓮，夏立群,2,3

(1. 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，廣東 湛江 524088；3. 廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室，廣東 湛江 524088)

鰤魚諾卡氏菌與黃粉色諾卡氏菌原生質(zhì)體融合的研究

王英華1，陳建林1，徐 亮1，張紅蓮1，夏立群1,2,3

(1. 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，廣東 湛江 524088；3. 廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室，廣東 湛江 524088)

鰤魚諾卡氏菌是魚類諾卡氏菌病的主要病原，黃粉色諾卡氏菌為一種近緣無毒環(huán)境諾卡氏菌.本實驗研究主要以鰤魚諾卡氏菌和黃粉色諾卡氏菌為兩親本，開展了原生質(zhì)體融合研究.針對諾卡氏菌細(xì)胞壁厚的特性，本實驗對原生質(zhì)體制備時的溶菌酶脫壁時間進行了篩選，確定鰤魚諾卡氏菌和黃粉色諾卡氏菌的最佳脫壁時間分別是65 min和100 min.用聚乙二醇促使兩親本菌的原生質(zhì)體融合后，通過選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)、菌落形態(tài)篩選、革蘭氏染色觀察、16S rRNA測序等方法，對融合菌株進行了初步鑒定.鑒定結(jié)果表明：融合菌株的菌落形態(tài)較兩親本發(fā)生了改變，為革蘭氏陽性菌，通過16S rRNA基因序列比對，其與鰤魚諾卡氏菌的同源性為99%.融合菌株的毒力較鰤魚諾卡氏菌野生株有所降低.本研究為鰤魚諾卡氏菌活疫苗的研制提供了新思路，對魚類諾卡氏菌病的防治具有一定的潛在價值.

原生質(zhì)體融合； 鰤魚諾卡氏菌； 黃粉色諾卡氏菌

諾卡氏菌為革蘭氏陽性菌，是一種放線菌，菌體呈線狀、短桿狀或細(xì)長分枝狀，細(xì)胞壁厚.由諾卡氏菌引起的淡水養(yǎng)殖魚類諾卡氏菌病，最早報道是發(fā)生于南美阿根廷，后來在北美和歐洲發(fā)病，近年來也見于東南亞和大洋洲.諾卡氏菌感染海水養(yǎng)殖魚類的病例最初確認(rèn)于日本，近來頻發(fā)于東南亞、地中海等地區(qū)[1-4].

鰤魚諾卡氏菌(Nocardia seriolae)是魚類諾卡氏菌病的主要病原，它可引起系統(tǒng)性肉芽腫疾病，在魚體內(nèi)及體表形成大量結(jié)節(jié)、引起其體表出血及潰瘍[3-6].鰤魚諾卡氏菌的疫苗研制進展緩慢，其滅活疫苗無法提供有效保護.Itano等人[7]以土壤諾卡氏菌(N. soli)和河流諾卡氏菌(N. fluminea)作為活疫苗，免疫五條鰤(Seriola quinqueradiata)，然后用鰤魚諾卡氏菌攻毒，結(jié)果表明能產(chǎn)生一定的免疫保護，相對保護率最高達65. 4%，但可能由于所用環(huán)境的諾卡氏菌的免疫原性與鰤魚諾卡氏菌差異較大，其免疫效果離商品化尚有一段差距.

鰤魚諾卡氏菌NS株(N. seriolae NS)是通過強毒株鰤魚諾卡氏菌ZJ0503進行多重誘變后經(jīng)篩選所獲得的減毒株，將鰤魚諾卡氏菌NS與無毒環(huán)境諾卡氏菌——黃粉色諾卡氏菌(N. flavorosea)進行原生質(zhì)體融合研究，旨在獲得高免疫原性、低毒性的融合菌株，進而研制疫苗.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和培養(yǎng)基 鰤魚諾卡氏菌減毒株N. seriolae NS由本實驗室篩選保藏，黃粉色諾卡氏菌(N. flavorosea)購自中國普通微生物保藏管理中心，編號4.1175，是從中國云南省的土壤中分離而得到.改良液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1, 酵母粉15 g·L-1,K2HPO40.75 g·L-1, NaCl 5 g·L-1, CaCl20.2 g·L-1, pH(6.5±0.2)(固體培養(yǎng)基添加瓊脂20 g·L-1).再生補充基本培養(yǎng)基(SMR)：葡萄糖5 g·L-1，(NH4)2SO42 g·L-1，檸檬酸鈉 1 g·L-1，K2HPO4·3H2O 14 g·L-1，KH2PO46 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，腺嘌呤 20 mg·L-1，蔗糖 0.5 mol·L-1，pH 7.0，100 Pa滅菌20 min.

1.1.2 試劑和引物 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、溶菌酶(50 g·L-1)購自Tiangen公司；Premix TaqTMPCR預(yù)混液購自TaKaRa公司；聚乙二醇(PEG-4000)等其他試劑均為國產(chǎn)分析純.16S rRNA通用引物為27F：5′ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′和1492R：5′ GGTTACCTTGTTACGACTT 3′.

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)菌懸液的制備 將-80 ℃保存的鰤魚諾卡氏菌NS和黃粉色諾卡菌劃線，接種于改良固體培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫倒置培養(yǎng).待長出菌落后，挑取單菌落接種于100 mL改良液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48～72 h.各取10 mL菌液，4 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，將菌體沉淀用PBS重懸后，4 000 r·min-1離心棄上清，重復(fù)兩次.最后將菌體重懸于原生質(zhì)體穩(wěn)定液(SMM：蔗糖0.5 mol·L-1，MgCl220 mol·L-1，順丁烯二酸 0.02 mol·L-1，pH 6.5)中，調(diào)整菌密度至108～109cfu·mL-1.

1.2.2 脫壁處理 分別取鰤魚諾卡氏菌NS、黃粉色諾卡菌的細(xì)菌懸液各5 mL，加入溶菌酶(終質(zhì)量濃度1 g·L-1)混勻后，于30 ℃水浴(進行脫壁處理)，于處理后的30～105 min內(nèi)每隔5 min取樣一次，染色后在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形成的情況，當(dāng)95%以上的細(xì)胞成球形原生質(zhì)體時，即為最佳脫壁時間.將原生質(zhì)體懸液以4 000 r·min-1離心10 min，棄去酶液，加入5 mL高滲緩沖液(Na2HPO40.07 mol·L-1，甘露醇0.8 mol·L-1，pH8.6)重懸.

1.2.3 原生質(zhì)體的融合 各取1 mL鰤魚諾卡氏菌NS、黃粉色諾卡菌的原生質(zhì)體懸液于4 mL的離心管中混合，靜置5～10 min，然后以2 500 r·min-1離心10 min，棄上清，往沉淀中加入200 μL的原生質(zhì)體穩(wěn)定液(SMM)，混勻，再加入1.8 mL促融合劑溶液(含φ=40%的聚乙二醇PEG-4000的SMM溶液)，微微搖晃混勻后，放入30 ℃的水浴鍋中水浴40～90 min，其間每隔5 min取樣，染色鏡檢融合情況，確定最佳的融合時間.融合完成后，以2 500 r·min-1離心10 min，棄上清，加入2 mL的原生質(zhì)體穩(wěn)定液(SMM)，制成融合懸液.

1.2.4 融合子檢出 往培養(yǎng)皿中倒入含2.0%瓊脂的再生補充基本培養(yǎng)基(SMR)，并以其作為基層培養(yǎng)基.然后取500 μL融合懸液，用原生質(zhì)體穩(wěn)定液(SMM)作適度稀釋(100、10-1、10-2)，取1 mL稀釋液，將其與新鮮滅菌并冷卻到50 ℃左右的再生補充基本培養(yǎng)基(含1.0%瓊脂)混勻，并迅速倒在基層培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～4 d.初步認(rèn)為所長出的菌落是融合子，繼續(xù)轉(zhuǎn)接傳代培養(yǎng).

1.2.5 融合子的篩選 通過菌落形態(tài)特征來進行融合子的初步篩選.即依據(jù)存活菌落的形態(tài)、顏色等特征，選擇與兩親本菌株菌落特征都不相同的融合子菌落，并進行革蘭氏染色.

1.2.6 序列分析 將步驟1.2.5中篩選出的融合子，提取DNA.利用細(xì)菌的16S rRNA通用引物F27和R1492，使用Premix TaqTMPCR預(yù)混液進行16S rRNA擴增，產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序.將測序結(jié)果在NCBI上通過Blast N進行同源性比對，并用DNAMAN進行多重序列比對.

1.2.7 融合菌株毒力測試 挑取融合菌株和野生株鰤魚諾卡氏菌ZJ0503單菌落，經(jīng)PBS重懸清洗，以4 000 r·min-1離心10 min，收集菌體后，加入適量的PBS以制成菌懸液，調(diào)整細(xì)菌密度為108cfu·mL-1.用PBS對菌懸液進行10倍稀釋，以用于平板菌落計數(shù)法中測cfu.實驗組(30尾斑馬魚)：用微量注射器將融合菌懸液于腹腔注入斑馬魚(10 μL·尾-1)；陽性對照組(30尾)：接種同劑量的鰤魚諾卡氏菌ZJ0503；陰性對照組(30尾)：接種PBS.將斑馬魚分組飼養(yǎng)于不同的水族箱，水溫保持在28 ℃左右，連續(xù)觀察5 d，在此期間觀察斑馬魚的死亡情況.

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌脫壁處理的結(jié)果在未脫壁前，鰤魚諾卡氏菌NS在顯微鏡下所觀察到的形態(tài)大致為長桿狀，具隔橫，容易斷裂為桿狀，有分枝(圖1A)；以1 g·L-1溶菌酶對菌體進行脫壁處理后，每隔5 min取樣，染色鏡檢，觀察細(xì)菌的脫壁情況，確定鰤魚諾卡氏菌NS在脫壁處理65 min后其脫壁率達95%(圖1B)，此后原生質(zhì)體的形成不再增加，故確立鰤魚諾卡氏菌NS的脫壁時間為65 min.

進行脫壁處理前，通過革蘭氏染色在顯微鏡下可看到黃粉色諾卡氏菌呈長桿狀，菌絲有橫隔和分枝(圖1C)；對黃粉色諾卡氏菌脫壁處理后，在100 min時原生質(zhì)體形成較明顯，脫壁率達到95%左右(圖1D)，故確立鰤魚諾卡氏菌NS的脫壁時間為100 min.

圖1 鰤魚諾卡氏菌NS和黃粉色諾卡氏菌脫壁前后的變化(1 000×)

2.2 原生質(zhì)體的融合結(jié)果細(xì)菌脫壁后形成的球狀原生質(zhì)體在PEG-4000的作用下，原生質(zhì)體發(fā)生融合.在此過程中，需要控制好融合的時間及溫度，每隔一段時間取樣觀察，能夠看到原生質(zhì)體小球互相靠近并融合，在融合原生質(zhì)體的周圍會呈現(xiàn)橢圓狀光圈.圖2為鰤魚諾卡氏菌NS與黃粉色諾卡氏菌原生質(zhì)體融合時不同時間的融合情況，從圖2可知，原生質(zhì)體的融合時間在50 min時達到理想效果，50 min以上的融合效果基本不變，因此確定兩種原生質(zhì)體融合的最佳時間為50 min.

A：融合45 min； B：融合50 min； C：融合55 min

融合后在再生補充基本培養(yǎng)基平板上長出的菌落，在經(jīng)多次傳代后，選性狀穩(wěn)定的菌落，觀察各菌落的形態(tài)和顏色，將其與親本菌落的特征進行比較，篩選菌落形態(tài)和顏色明顯不同的菌落，初步認(rèn)為其是成功的融合子(圖3).鰤魚諾卡氏菌NS的菌落呈淡黃色、半干燥、沙粒狀(圖3A)；而黃粉色諾卡氏菌的菌落大、邊緣不整齊、呈黃粉色(圖3B)；融合子菌落為白色、偏濕潤(圖3C).融合子菌落在顯微鏡下的形態(tài)為短桿狀，經(jīng)革蘭氏染色呈紫色，為革蘭氏陽性菌(圖3D).

A：鰤魚諾卡氏菌NS； B：黃粉色諾卡氏菌； C：融合子； D：融合子革蘭氏染色(1 000×)

2.3 16S rRNA序列的分析結(jié)果將融合子16S rRNA PCR擴增產(chǎn)物送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測序結(jié)果在NCBI上通過Blast N進行同源性比對，其結(jié)果與鰤魚諾卡氏菌ZJ0503的16S rRNA基因序列的同源性最高，達99%(圖4).故確定該菌株為諾卡氏菌屬的細(xì)菌，它與鰤魚諾卡氏菌的遺傳關(guān)系較近.

2.4 融合菌株毒力測試結(jié)果毒力實驗表明，對于腹腔注射融合菌株的斑馬魚，在攻毒5天后其存活率為88%，而野生株鰤魚諾卡氏菌ZJ0503的存活率為60%，融合菌攻毒后的斑馬魚存活率明顯高于鰤魚諾卡氏菌ZJ0503(圖5)，結(jié)果表明，篩選到的融合菌毒力較野生株鰤魚諾卡氏菌ZJ0503有所降低.

3 討 論

研究表明，傳統(tǒng)的鰤魚諾卡氏菌滅活疫苗，如甲醛滅活疫苗、熱滅活疫苗、添加弗氏佐劑的滅活疫苗等，雖然可以提高血清凝集抗體的效價，但攻毒后并不能提供有效的免疫保護作用[8-9]，這可能是由于滅活過程損失了重要抗原物質(zhì)的緣故.根據(jù)近緣菌具有交叉保護性抗原的原理，Itano[7]等人以近緣環(huán)境諾卡氏菌作為活疫苗，免疫保護率較鰤魚諾卡氏菌滅活疫苗有大幅提高，但仍然不夠理想.目前看來，在進行鰤魚諾卡氏菌疫苗研制時，活疫苗較滅活疫苗更為可行[10].

本實驗室前期通過多重誘變后篩選獲得了減毒株鰤魚諾卡氏菌NS，作為活疫苗它能提供85%的免疫保護率.為了進一步降低活疫苗在使用過程中毒力回復(fù)的風(fēng)險，我們將該減毒株與篩選到的無毒近緣種黃粉色諾卡氏菌進行了原生質(zhì)體的融合，構(gòu)建融合菌，以期獲得高免疫原性、低毒性的融合菌株，并以其作為更為安全有效的鰤魚諾卡氏菌活疫苗.結(jié)果表明，初步篩選到一株菌落形態(tài)和顏色與親本菌落有差異的融合子，其16S rRNA基因序列與鰤魚諾卡氏菌的同源性最高，且毒力較野生株有所下降，初步證明鰤魚諾卡氏菌與黃粉色諾卡氏菌的原生質(zhì)體融合成功.

在進一步的研究中，可對所得的融合菌進行免疫保護率評估.本研究為鰤魚諾卡氏菌活疫苗的研制提供了新思路，這對魚類諾卡氏菌病的防治具有一定的潛在價值.

[1] Xia L Q，Zhang H L，Lu Y S，et al．Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Nocardia salmonicida， the causative agent of nocardiosis in Fish[J]．Journal of Microbiology and Biotechnology，2015，25(3)：321-327．

[2] 夏洪麗，魯義善，湯菊芬，等．魚類致病殺鮭諾卡氏菌(Nocardia salmonicida)特異性PCR檢測方法的建立[J]．廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2014，34(4)：56-61．

[3] Elkesh A，Kantham K P，Shinn A P，et al．Systemic nocardiosis in a Mediterranean population of cultured meagre，Argyrosomus regius Asso (Perciformes：Sciaenidae) [J]．Journal of Fish Diseases，2013，36(2)：141-149．

[4] Wang G L，Yuan S P，Jin S．Nocardiosis in large yellow croaker，Larimichthys crocea (Richardson) [J]．Journal of Fish Diseases，2005，28(6)：339-345．

[5] 滿其蒙．鰤魚諾卡氏菌致病機制的研究[D]．上海：上海海洋大學(xué)，2013．

[6] Labrie L，Ng J，Tan Z，et al．Nocardial infections in fish：an emerging problem in both freshwater and marine aquaculture systems in Asia[C]．Diseases in Asian aquaculture VI．Fish health section．Manila：Asian Fisheries Society，2008：297-312．

[7] Itano T， Kawakami H， Kono T，et a1．Live vaccine trials against nocardiosis in yellowtail，Seriola quinqueradiata [J]．Aquaculture，2006，261(4)：1 175-1 180．

[8] Shimahara Y，Yasuda H，Nakamura，et al．A Detection of antibody responses against Nocardia seriolae by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and a preliminary vaccine trial in yellowtail Seriola quinqueradiata[J]． Bulletin of the European Association of Fish Pathologists，2005，25(6)：270-275．

[9] Kato G， Kato K，Jirapongpairo J W，et al．Development of DNA vaccines against Nocardia seriolae infection in fish[J]．Fish Pathology，2014，49(4)：165-172．

[10] Shoemaker C A， Klesius P H， Evans J J，et al．Use of Modified live vaccines in aquaculture[J]．Journal of the World Aquaculture Society，2009，40(5)：573-585．

Protoplast Fusion ofNocardiaseriolaeandNocardiaflavorosea

Wang Yinghua1, Chen Jianlin1, Xu Liang1, Zhang Honglian1, Xia Liqun1,2,3

(1. Fisheries College of Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals, Zhanjiang 524088, China; 3. Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions, Zhanjiang 524088, China)

Nocardia seriolae is the main pathogen of fish nocardiosis, while N. flavorosea is an avirulent related environmental Nocardia spp. In the study, N. seriolae and N. flavorosea were selected as parent strains and protoplast fusion was carried out. According to the cell wall characteristics of the two Nocardia spp, which were thick, the cell wall treating time by lysozyme during protoplast preparation were optimized, and the optimal treating time for N. seriolae and N. flavorosea was 65min and 100min, respectively. After the two kinds of protoplast were fused by using polyethylene glycol (PEG) as fusogen under high concentration of Ca2+, the fusion strains were identified by selective medium culture, colony morphology filtering, Gram staining, and 16s rRNA sequencing. The results indicated that the fusant was Gram-positive bacteria, and whose colony morphology was different with that of the parent strains, the 16S rRNA sequence of fusant was 99% identical to that of N. seriolae. Compared with wild strains N. seriolae ZJ0503, the virulence of fusant was decreased. Our study provides a new idea for N. seriolae live vaccine development, and is valuable for the prevention and treatment of fish nocardiosis.

protoplast fusion; Nocardia seriolae; Nocardia flavorosea

2016-07-12

廣東省國際科技合作項目(2016A050502061)；廣東省教育廳特色創(chuàng)新項目(2014KTSCX075)；深圳大鵬新區(qū)產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金(KY20160207)；廣東省攀登計劃項目(pdjh2016b0234)；“海之帆—起航計劃”大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項(hzfqhjhzrkx2015b03)

王英華(1991-)，女，廣東信宜人，廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院2012級本科生，E-mail：1024765309@qq.com

夏立群(1976-)，女，安徽太和人，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：水生動物病原生物學(xué)，Email：xialq@gdou.edu.cn

1004-1729(2016)04-0350-06

S 943. 2

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2016.0053