翻白草對CCL4所致慢性肝損傷大鼠肝臟保護作用的實驗研究

蔡綱，李紹民

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

?

翻白草對CCL4所致慢性肝損傷大鼠肝臟保護作用的實驗研究

蔡綱，李紹民*

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:觀察翻白草對CCL4腹腔注射所致的大鼠慢性肝損傷的肝臟保護作用。方法:80只大鼠隨機分成空白對照組、翻白草低劑量組、翻白草高劑量組、模型對照組。全自動生化儀檢測各組大鼠血清ALT、AST和TBIL含量，觀察各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:翻白草煎液可以降低模型大鼠血清中ALT、AST和TBIL含量，延緩或抑制肝組織纖維化過程。結(jié)論:翻白草煎液對CCL4所致大鼠慢性肝組織損傷具有明顯的保護作用。

翻白草；四氯化碳；肝纖維化；慢性肝損傷

肝臟作為主要機體內(nèi)主要的代謝器官，容易受到各種非生物或生物等因素刺激，導(dǎo)致致肝細胞受損。若致病因子長期存在，會造成肝細胞變性、壞死、肝組織內(nèi)膠原沉積，導(dǎo)致肝纖維化,甚至可以發(fā)展為肝硬化，肝衰竭。由于體內(nèi)肝臟具有較好的修復(fù)和再生能力，肝組織纖維化的進程一般是較為緩慢的。

翻白草是多年生草本薔薇科植物，其內(nèi)含有多種活性成分及作用，藥理作用廣泛，在中醫(yī)的醫(yī)典古籍中很早就有對它的記載。近代研究發(fā)現(xiàn)它的安全性好，毒性極低[1]，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌、降血糖等藥理活性[2]；肝臟又是機體糖代謝和生物氧化重要器官，故此推斷翻白草可能對肝損傷具有保護作用。因此，本研究采用CCl4誘導(dǎo)大鼠慢性肝損傷為對象，觀察翻白草煎劑對損傷的肝保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級Wistar雌性大鼠，購買于佳木斯大學(xué)動物實驗室，體質(zhì)量180～220 g，80只，許可證號SCXK(黑)2013-001。

1.2 動物分組

普通喂養(yǎng)5天，適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境后，采用隨機數(shù)字法，開始對實驗大鼠進行分組。將80只大鼠隨機分成4組，每組20只，分別為空白對照組、翻白草低劑量組、翻白草高劑量組、模型對照組。

1.3 造模和處理

對4組大鼠分別按表1造模處理，每3天1次，翻白草實驗處理每日1次,實驗進行至第60天后結(jié)束。

表1 造模和實驗處理方案

1.4 翻白草水煎液的制備

從佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥局購置翻白草藥材，經(jīng)佳木斯大學(xué)李紹民教授鑒定為真品。稱取干燥的翻白草若干，漂洗，浸泡，文火加水煎煮3次，每次1 h；煎煮后濾過收集濾液后濃縮成含翻白草生藥量1.0 g/mL 和2.0 g/mL兩種濃度的溶液備用。

1.5 取材

處理8周后，停止所有處理因素48 h，禁食不禁水12 h后心臟穿刺采血后處死大鼠。使用全自動生化儀(AU5400,OLYMPUS)檢測血ALT、AST、TIBL值。處死大鼠后剪下全部肝臟，漂洗清血跡，濾紙擦干后稱重。然后剪取肝左葉以10%福爾馬林固定,石蠟包埋后進行HE 染色,光鏡下觀察肝細胞變性壞死、炎癥細胞浸潤、肝間質(zhì)纖維增生程度。

1.6 主要試劑

四氯化碳(天津市大茂化學(xué)試劑廠)和玉米油(黑龍江興貿(mào)食品有限公司)配制成40%四氯化碳玉米油溶液，每次新鮮配制供當(dāng)日使用。取市售37%～40%甲醛溶液(福爾馬林)和蒸餾水按1∶9混合，配制10%福爾馬林穩(wěn)定液。蘇木素和伊紅染色劑及肝臟病理切片制作相關(guān)材料由佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科提供。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 實驗動物的存活率

實驗過程中，大鼠意外死亡18只，死亡原因分別為：5例在腹腔注射操作過程中或操作完30 min內(nèi)死亡；2例死于腹腔注射入結(jié)腸而導(dǎo)致的中毒性巨結(jié)腸；3例死于灌胃或操作完30 min內(nèi)；8例死亡原因不明。各組分布為：空白對照組2只；翻白草低劑量組和高劑量組各5只；模型對照組6只。用卡方檢驗對以上各組大鼠死亡率進行比較，P=0.46,還不能認為不同組別大鼠的死亡率存在顯著差別。

2.2 大鼠血清ALT、AST、TBIL值的統(tǒng)計結(jié)果

不同組別大鼠血清中ALT、AST、TBIL含量有顯著差別，P<0.05。采用LSD檢驗對其進行兩兩比較，結(jié)果見表2。

組別ALT(U/L)AST(U/L)TBIL(μmol/L)空白對照組67.10±23.06△104.82±22.20△3.14±1.14△翻白草低劑量組261.84±39.70*284.51±27.80*△19.49±3.07*翻白草高劑量組207.87±23.13*△246.38±37.93*△16.80±1.90*△模型對照組263.33±35.90*340.62±37.14*21.24±2.53*

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05。

與空白對照組比較，其余三組血清ALT值均明顯有不同程度升高(P<0.05)。和模型對照組比較，翻白草低劑量組血清ALT值降低不明顯，差異不顯著(P>0.05)；翻白草高劑量組血清ALT值降低明顯，差異顯著(P<0.05)?？梢姺撞莞邉┝拷M可以顯著降低本模型中大鼠血清ALT值。

與空白對照組比較，其余三組大鼠血清AST值均有不同程度增加(P<0.05)。和模型對照組相比，翻白草低劑量組和高劑量組血清AST值明顯減少(P<0.05)?？梢姺撞莸?、高劑量組都可以降低本模型中大鼠血清AST值。

與空白對照組比較，其余三組大鼠血清TBIL含量均有不同程度增加(P<0.05)。和模型對照組比較，翻白草低劑量組和模型對照組大鼠血清TBIL含量無差別(P>0.05)，翻白草高劑量組大鼠血清TBIL含量減少(P<0.05)。翻白高劑量組可以減少本模型中大鼠血清TBIL含量。

2.3 各組大鼠肝組織HE染色比較

各組大鼠肝組織HE染色比較(各組大鼠按肝組織病理損傷程度排序，取各組中位數(shù)比較)，見圖1。模型對照組：纖維間隔中度增生，肝細胞脂肪變性、水變性明顯，較多肝細胞胞漿均質(zhì)紅染，細胞核固縮、消失，肝細胞壞死。翻白草高劑量組：纖維間隔輕度增生，肝細胞胞漿疏松，明顯水變性，輕度脂肪變性，無明顯壞死。翻白草低劑量組：纖維間隔輕度增生，肝細胞中度水變性，脂肪變性較輕，無明顯壞死；正常對照組：正常大鼠肝組織。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色(100×)比較

組別n分期01234正常對照組18180000模型對照組1400374翻白草低劑量組1500852翻白草高劑量組1501761

2.4 各組大鼠肝組織纖維化分期評估比較。

參照Scheuer的方式對大鼠肝纖維化病理分期進行評估，0期無明顯異常；1期匯管區(qū)擴大，小葉及部分竇周纖維化；2期匯管區(qū)纖維化，纖維隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；3期纖維隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂；4期早期肝硬化，可能或肯定肝硬化。分期情況如表3所示。

3 討論

當(dāng)肝實質(zhì)細胞損傷，細胞膜結(jié)構(gòu)和通透性的改變或破壞, 使得肝細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST，進入血液中,因此血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST水平可以作為反映了肝臟組織細胞的損傷程度的敏感指標(biāo)[3-5]。實驗結(jié)果表明翻白草水煎液可以明顯降低該肝損傷大鼠血清ALT、AST值，提示翻白草對CCL4導(dǎo)致的慢性肝損傷大鼠有明顯的肝細胞保護作用；翻白草低劑量組血清ALT值減少，較模型組比差異不顯著，如表1所示翻白草高劑量組效果均優(yōu)于低劑量組，且翻白草毒性極低。可見翻白草水煎液具有降低肝損傷大鼠血清ALT、AST值作用，在一定范圍內(nèi)與翻白草水煎液的濃度或劑量存在正相關(guān)，當(dāng)然這還需要實驗去證明。

肝細胞受損后其攝取、結(jié)合膽紅素的能力，及毛細膽管排泄膽紅素的能力下降導(dǎo)致血清總膽紅素水平升高。因此，膽紅素可作為反映肝臟生化功能的指標(biāo)之一,從這一方面也證實了翻白草對肝臟損傷的保護作用。另一方面，有研究表明膽紅素在機體內(nèi)的正常生理濃度范圍內(nèi)具有很好的抗氧化作用，可有效的從多方面保護細胞[6-7]。蔡森的研究表明,在病理狀態(tài)下膽紅素在機體內(nèi)的蓄積，使其不能發(fā)揮良好的抗氧化作用，并隨著膽紅素濃度的升高，肝臟氧化損傷程度越嚴重[8]。肝臟損害和肝臟內(nèi)膽紅素的蓄積可以互為因果。本次試驗中翻白草高劑量組大鼠血清TBIL值明顯降低，低劑量組雖然降低不明顯，但如果增加樣本量也是能看到它的效果所在；這些都提示翻白草還可以在一定程度上促進肝細胞膽紅素的代謝，這種促進在一定程度上又減少了引起肝臟損害的不利因素。

肝臟纖維化發(fā)生機制復(fù)雜，是多種損傷因素和病理、生理機制共同作用，各種細胞、細胞因子等參與的結(jié)果。慢性肝損傷的修復(fù)過程中彌漫性細胞外基質(zhì)(如膠原纖維等)過度沉積導(dǎo)致的肝纖維化，可以認為是肝硬化的前期可逆階段[9-11]。本試驗中HE染色觀察結(jié)果觀察，翻白草高劑量組和低劑量組肝組織病理變化，翻白草能夠延緩或抑制該模型大鼠肝組織纖維化增生的作用。

綜上，可以認為翻白草對CCL4導(dǎo)致大鼠慢性肝損傷具有明顯的保護作用,可在一定程度上延緩或抑制纖維化的發(fā)展進程。從目前翻白草的研究現(xiàn)狀來看，其作用機制可能是多因素、多靶點和多機制綜合作用的結(jié)果，如何逐一去解釋這些機制，則需要更多的研究。

[1] 蘇建華,周明瑤,李穎,等.翻白草對大鼠的長期毒性實驗[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2010,38(3):41-43.

[2] 孫奕,鄧雁如,王穎,等.翻白草的化學(xué)成分及藥理活性研究進展[J].中成藥,2016,38(3):639-645.

[3] 徐強,孫笑姝,朱剛,等.益肝膠囊對免疫性肝損傷小鼠保護作用及細胞因子表達的影響[J].中醫(yī)藥信息，2016,33(3):17-19.

[4] 馬宏宇.肝病患者血清中AST/ALT比值的臨床意義[J].臨床合理用藥雜志,2010,3(21):65-66.

[5] 冷玉杰.中藥五味子煎劑與藥物性肝損傷治療的相關(guān)性研究[J].中醫(yī)藥信息，2015,32(6):53-55.

[6] Erel O.A novel automated direct measurement method for total antioxidant capacity using a new generation,more stable ABTS cation[J].Clin Biochem,2004,37:277-285.

[7] 張英,黃維義,鄧輝勝,等.低膽紅素血癥對機體抗氧化能力和脂質(zhì)過氧化的影響及VitE的干預(yù)效果[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2002,12(4):24-28.

[8] 蔡森.慢性乙型肝炎高膽紅素血癥患者氧化損傷的研究[D].濟南:山東大學(xué),2010.

[9] Ismail MH, Pinzani M. Reversal of liver fibrosis[J].Saudi J Gastroenterol,2009,15:72-79.

[10] 王欣欣，盧秉久.“從脾論治”肝纖維化對模型大鼠TIMP-2及MMP-2相關(guān)因子水平影響的實驗研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2016,44(3):37-40.

[11] 王業(yè)秋，任燕冬，劉海洋,等.逍遙散抗大鼠肝纖維化活性部位的篩選[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2014,42(3):141-143.

Protective Effect of Potentilla Discolor Bge onRats with Chronic Liver Injury Induced by CCL4

CAI Gang,LI Shao-min*

(FirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154003,China)

Objective:To investigate the protective effect of Potentilla Discolor Bge (PDB)on CCL4-induced chronic liver injury. Methods:80 rats were randomly divided into 4 groups:blank control group, model control group, potentilla discolor bunge groups with low dose and high dose. Establish chronic liver injury models induced by CCL4. Compare the liver index, serum ALT, AST and TBIL levels and liver pathological injury in rats in each group. Results:The PDB could reduce the liver index of rats and the contents of serum ALT, AST and TBIL, delay or inhibit the process of liver fibrosis in the model rats. Conclusion:PDB has a significantly protective effect on chronic liver injury rats induced by CCL4.

Potentilla Discolor Bge; Carbon tetrachloride; Hepatic fibrosis; Chronic hepatic injury

黑龍江省自然科學(xué)基金項目(No.H201371)

蔡綱(1982-)，男，佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)(傳染病學(xué))專業(yè)2013級在讀碩士研究生。

李紹民*(1966-)，男，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：慢性病毒性肝炎的發(fā)病機制。

2016-04-12

R285.5

A

1002-2406(2016)01-0013-04

修回日期：2016-05-10