多糖純化工藝的研究

杜佳

實(shí)驗(yàn)方法

葡聚糖凝膠柱層析。（1）sephadexG-200預(yù)處理。稱取一定量的Sephadex G-200干粉，用去離子水浸泡24h，充分溶脹后裝入層析柱中，用 0.1mol/L 的 NaCl 溶液平衡12h；（2）Sephadex G-200 柱層析法。將經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析法分離出的多糖組分，流速條件在 1mL/min下進(jìn)行洗脫，每管收集2mL。用苯酚硫酸法逐個(gè)檢測每管收集的多糖溶液，標(biāo)以收集多糖溶液的收集編號(hào)作為橫坐，吸光值作為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。

蛋白質(zhì)去除率的單因素實(shí)驗(yàn)。（1）反應(yīng)溫度對(duì)蛋白質(zhì)去除率的影響。準(zhǔn)確稱取10ml多糖溶液，加入濃度為4%的三氯乙酸溶液，分別在20、40、60、80、100℃溫度下，控制靜止時(shí)間在30min，取上清液測定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算不同處理溫度下所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)去除率；（2）反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)去除率的影響。準(zhǔn)確稱取10ml粗多糖溶液，在80℃的水浴鍋中處理樣品，加入濃度為4%的三氯乙酸溶液，反應(yīng)時(shí)間分別控制在10min、20min、30min、40min、50min，靜止，取上清液測定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算不同靜止時(shí)間下所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)去除率；（3）三氯乙酸用量對(duì)蛋白質(zhì)去除率的影響。準(zhǔn)確稱取10ml粗多糖溶液，在80℃的水浴鍋中處理，靜止時(shí)間控制在30min，三氯乙酸的用量分別控制在1%、3%、5%、7%、9%，取上清液測定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算不同三氯乙酸用量下所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)去除率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定。根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白含量含量在20-100mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9903，回歸方程y =1.725x + 0.0039。

多糖純化。（1）香菇多糖經(jīng) Sephadex G-200柱層析結(jié)果分析。用纖維素柱層析分析可知，用蒸餾水洗脫出的多糖溶液，在490nm處出現(xiàn)了兩個(gè)吸峰A和B，其中A峰所占的面積比較大，所以主要成分應(yīng)該是A峰處的多糖。將收集到的A和B的樣品進(jìn)行冷凍干燥，待使用；（2）香菇多糖經(jīng) Sephadex G-200 柱層析結(jié)果。稱取冷凍干燥后的A、B干粉各100mg，溶于10mL水中，吸取 5mL混合樣液于柱中，用蒸餾水作為洗脫液，在流速條件為0.5 mL/min下進(jìn)行洗脫，每管分別收集5mL，然后用苯酚硫酸法進(jìn)行檢測，重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值，制作洗脫曲線。

對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析，在第8管收集的的洗脫液已經(jīng)可以檢測到 A，并且從8-28管逐漸增加，從8至28管A的含量急劇增大，第28管到達(dá)最大值，然后又逐漸減小。到48管以后基本檢測不出A的存在了。A洗脫出的曲線是一對(duì)稱峰，由此確定A為單一的物質(zhì)。同樣，B洗出的曲線也呈單一曲線峰，所以也可證明B是單一組分；（3）紫外光譜掃描結(jié)果。對(duì) A、B兩種組分在190到400nm波段進(jìn)行紫外光譜掃描，經(jīng)過分析可知，在211nm處有吸收峰，但在260、280nm處均無吸收峰，由此可以證明在A、B中不含有核酸和蛋白質(zhì)。

結(jié)論

通過Sephadex G-200柱層析對(duì) A和B兩種多糖組分進(jìn)行洗脫，得到的洗脫曲線均呈單一對(duì)稱峰，說明A和B都是單一的多糖組分。通過對(duì)組分進(jìn)行紫外光譜掃描，通過紫外光譜掃描的結(jié)果可知，兩個(gè)多糖組分中均不含核酸和蛋白質(zhì)。其中，反應(yīng)條件為：三氯乙酸用量為5%，反應(yīng)時(shí)間為50min，反應(yīng)溫度為80℃。在此工藝條件下，多糖損失率只有26.7%，而蛋白去除率率可以達(dá)到61.8%。