木質(zhì)素對纖維素酶的吸附作用研究

姚 蘭 周曉明 田 彥 楊海濤,*

(1.湖北工業(yè)大學(xué)制漿造紙工程學(xué)院,湖北武漢,430068；2.齊魯工業(yè)大學(xué)制漿造紙科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室,山東濟南,250353)

木質(zhì)素對纖維素酶的吸附作用研究

姚 蘭1,2周曉明1田 彥1楊海濤1,*

(1.湖北工業(yè)大學(xué)制漿造紙工程學(xué)院,湖北武漢,430068；2.齊魯工業(yè)大學(xué)制漿造紙科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室,山東濟南,250353)

研究了楊木木質(zhì)素、銀杏木質(zhì)素、玉米秸稈木質(zhì)素3種不同來源木質(zhì)素對纖維素酶的吸附作用,并與微晶纖維素對纖維素酶的吸附作用進行對比。結(jié)果表明，楊木木質(zhì)素為GS型木質(zhì)素,銀杏木質(zhì)素為G型木質(zhì)素,玉米秸稈木質(zhì)素為GSH型木質(zhì)素；4種底物對于纖維素酶的吸附作用強弱順序為：銀杏木質(zhì)素>玉米秸稈木質(zhì)素>楊木木質(zhì)素>微晶纖維素；木質(zhì)素主要吸附的是纖維素酶中的內(nèi)切酶和β-葡萄糖苷酶,而對外切酶的吸附較少。

木質(zhì)素；纖維素酶；吸附作用；最大吸附量

經(jīng)濟發(fā)展、國家安全以及環(huán)境保護等各方面的需求促使各個國家積極尋找可以替代石油的新能源。我國是世界第一大發(fā)展中國家,開發(fā)可以替代石油的新能源具有重要意義。纖維素乙醇在這一背景下應(yīng)運而生。在纖維素乙醇的生產(chǎn)過程中,如何降低其生產(chǎn)成本是目前亟待解決的難題。數(shù)據(jù)顯示,纖維素酶占纖維素乙醇生產(chǎn)成本的15%～50%[1]。因此,如何降低纖維素酶的用量是降低纖維素乙醇生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。在纖維素乙醇的生產(chǎn)過程中,木質(zhì)素對纖維素酶的無效吸附導(dǎo)致纖維素酶用量增加,從而增加了纖維素乙醇的生產(chǎn)成本。因而，研究木質(zhì)素對纖維素酶的吸附機理，以減弱木質(zhì)素的吸附作用是降低纖維素乙醇生產(chǎn)成本的關(guān)鍵所在。

在纖維素乙醇生產(chǎn)中，纖維素酶在其底物——纖維素上的吸附有利于后續(xù)酶解的順利進行[2]。Singh等[3]的研究結(jié)果表明,在30℃下,纖維素酶將在10 min內(nèi)快速吸附于纖維素底物上,這有利于纖維素酶對不溶性纖維素底物的催化降解。由于木質(zhì)纖維原料中存在木質(zhì)素,木質(zhì)素會通過疏水作用引起纖維素酶的無效吸附而降低其有效酶活[4]。因而，利用數(shù)學(xué)模型研究木質(zhì)素對纖維素酶的吸附作用,對于降低纖維素乙醇生產(chǎn)成本意義重大。

本實驗以銀杏、楊木和玉米秸稈為原料,研究不同來源的木質(zhì)素在50℃下對纖維素酶的吸附作用,繪制其吸附過程的動力學(xué)曲線,并與微晶纖維素進行對比。

1 實 驗

1.1 木質(zhì)素的制備

實驗選取銀杏、楊木和玉米秸稈為原料,采用Bj?rkman[5]提出的方法精制磨木木質(zhì)素(MWL)。將得到的3種木質(zhì)素分別命名為銀杏木質(zhì)素、楊木木質(zhì)素、玉米秸稈木質(zhì)素。

1.2 纖維素酶吸附實驗

采用pH值為4.8的HAc-NaAc緩沖液配制不同蛋白質(zhì)濃度(0.04～4 g/L)的纖維素酶液,在50℃、200 r/min的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上與木質(zhì)素(質(zhì)量濃度0.05 g/mL)混合,反應(yīng)4 h后,離心處理并測定上清液的酶活和蛋白質(zhì)濃度。同時，將不同蛋白質(zhì)濃度(0.04～4 g/L)的纖維素酶液、pH值為4.8的HAc-NaAc緩沖溶液加木質(zhì)素(質(zhì)量濃度0.05 g/mL)分別作為空白對照樣1#和空白對照樣2#。在微晶纖維素吸附纖維素酶的實驗中,在配制好的酶液中加入葡萄糖(質(zhì)量濃度5 g/mL)以抑制微晶纖維素的水解,其他條件同上。所有實驗重復(fù)3次。

1.3 分析方法

(1)紅外譜圖測試 取1～2 mg木質(zhì)素樣品與10倍量的無水KBr混合(在瑪瑙研缽中研磨),混合均勻后,倒入壓片模具中壓片,采用美國Thermo Nicolet公司Nexus FT-IR型紅外光譜儀分析3種木質(zhì)素的傅里葉變換紅外光譜。

圖1 3種木質(zhì)素紅外光譜譜圖

(2)蛋白質(zhì)濃度測定 采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度。將適當(dāng)稀釋的粗酶液100 μL加入到1 mL的考馬斯亮藍中,混勻,在波長595 nm處讀取吸光度,以牛血清蛋白質(zhì)作為標準物繪制標準曲線。

(3)纖維素酶酶活測定 以1%水楊苷為底物測定β-葡萄糖苷酶酶活[6]；以1%羧甲基纖維素鈉(CMC)為底物測定內(nèi)切酶酶活[7]；以對硝基苯纖維二糖苷(pNPC)為底物測定外切酶酶活[4]。

2 結(jié)果與討論

2.1 木質(zhì)素紅外光譜分析

2.2 不同底物對纖維素酶吸附動力學(xué)的研究

在以往的研究[11]中,對木質(zhì)纖維原料吸附纖維素酶等溫線的研究都在4℃下進行,主要是為了避免木質(zhì)纖維原料的水解。但是,有研究表明，50℃下吸附反應(yīng)比4℃時更加強烈[12],且纖維素酶對木質(zhì)纖維原料的酶解是在纖維素酶的最適溫度50℃下進行的,因此，本實驗也在該溫度下研究木質(zhì)素對纖維素酶的吸附動力學(xué)。在50℃、培養(yǎng)器轉(zhuǎn)速200 r/min、吸附時間4 h的條件下，研究3種來源木質(zhì)素對纖維素酶的吸附作用，并與微晶纖維素對纖維素酶的吸附作用進行比較。

表1 木質(zhì)素官能團信號歸屬

3種木質(zhì)素與微晶纖維素對纖維素酶的吸附曲線見圖2。由圖2可以看出,隨著纖維素酶溶液中蛋白質(zhì)濃度的增大,3種木質(zhì)素和微晶纖維素對纖維素酶的吸附量逐漸增大,最后達到平衡。根據(jù)朗格繆爾吸附等溫式(見式(1)),可以得出3種木質(zhì)素和微晶纖維素對纖維素酶的最大吸附量和平衡常數(shù)Kp(見表2)。

(1)

K=Emax×Kp

(2)

式中，Ead為酶吸附量,mg/g；Ef為蛋白質(zhì)濃度,g/L；Emax為最大吸附量,mg/g；Kp為平衡常數(shù)；K表征蛋白質(zhì)與底物的相互作用力。

圖2 3種木質(zhì)素和微晶纖維素對纖維素酶的吸附曲線

從表2可以看出,50℃時，微晶纖維素對纖維素酶的最大吸附量為43.47 mg/g,而楊木木質(zhì)素、銀杏木質(zhì)素、玉米秸稈木質(zhì)素對纖維素酶的最大吸附量分別為64.51、181.82、133.33 mg/g,分別是微晶纖維素最大吸附量的1.5、4.2、3.1倍,表明木質(zhì)素含量高的物質(zhì)會吸附更多的纖維素酶,這與以往的研究結(jié)果一致[13-14]。但本實驗得出的最大吸附量比文獻中的稍高,這可能是因為為了避免由于底物顆粒大小不同造成比表面積不同進而對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，對微晶纖維素和木質(zhì)素進行篩選,選取100～140目的底物進行實驗研究,這些底物可能較其他研究中用的底物小,所以會吸附更多的纖維素酶。實驗結(jié)果表明,木質(zhì)素比微晶纖維素可吸附更多的纖維素酶,且與文獻中木質(zhì)纖維原料吸附纖維素酶相比,木質(zhì)素對纖維素酶的最大吸附量也較大,表明在木質(zhì)纖維原料中，木質(zhì)素對纖維素酶的吸附能力最強。

朗繆爾吸附等溫線中的參數(shù)Kp可反映蛋白質(zhì)和底物的親和力,準確的說，是純化后的單一蛋白質(zhì)與底物的親和力,由于本實驗中使用的是混合纖維素酶,所以該參數(shù)沒有實際意義。銀杏木質(zhì)素和玉米秸稈木質(zhì)素的K相差不大,且在4個底物中兩者的K較大,其次是楊木木質(zhì)素的K,微晶纖維素的K最小,說明木質(zhì)素對纖維素酶的吸附作用大于微晶纖維素；而3種木質(zhì)素對纖維素酶吸附作用的大小順序為：銀杏木質(zhì)素>玉米秸稈木質(zhì)素>楊木木質(zhì)素。

2.3 3種木質(zhì)素對纖維素酶各組分的吸附量

木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)決定了其吸附纖維素酶的組分,通過分析被吸附的纖維素酶組分能夠進一步研究木質(zhì)素對纖維素酶的吸附特征。實驗選取了蛋白質(zhì)濃度分別為0.05、0.1、1、4 g/L的纖維素酶液與3種木質(zhì)素充分混合均勻直至吸附平衡,以CMC、pNPC、水楊苷為底物測定被木質(zhì)素吸附后纖維素酶中的內(nèi)切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶的酶活,評估不同木質(zhì)素對纖維素酶各組分的吸附程度。3種木質(zhì)素對纖維素酶各組分和蛋白質(zhì)的吸附量見圖3。

圖3 3種木質(zhì)素對纖維素酶各組分和蛋白質(zhì)的吸附量

從圖3可以明顯看出,在實驗的蛋白質(zhì)濃度下,玉米秸稈木質(zhì)素吸附的蛋白質(zhì)最多,其次是銀杏木質(zhì)素,楊木木質(zhì)素吸附的蛋白質(zhì)最少。盡管玉米秸稈木質(zhì)素吸附的蛋白質(zhì)最多,但銀杏木質(zhì)素對纖維素酶各組分的吸附量要大一些。例如，從圖3(a)可知，銀杏木質(zhì)素對于外切酶、內(nèi)切酶、β-葡萄糖苷酶的吸附量分別為10.0%、25.1%和18.2%,分別是玉米秸稈木質(zhì)素和楊木木質(zhì)素對外切酶、內(nèi)切酶、β-葡萄糖苷酶吸附量的2.4、1.4、1.4和1.2、1.5、1.3倍。另外,在低蛋白質(zhì)濃度(0.05和0.1 g/L)下,3種木質(zhì)素吸附最多的是內(nèi)切酶,其次是β-葡萄糖苷酶,木質(zhì)素對外切酶的吸附作用最弱；在高蛋白質(zhì)濃度(1和4 mg/mL)下,楊木木質(zhì)素和銀杏木質(zhì)素對β-葡萄糖苷酶的吸附作用最強,其次是內(nèi)切酶,而玉米秸稈木質(zhì)素吸附最多的是內(nèi)切酶,其次是β-葡萄糖苷酶,所有木質(zhì)素對外切酶的吸附作用最弱。

上述分析表明,對于每種木質(zhì)素,對3種酶的吸附量大小順序為：內(nèi)切酶≈β-葡萄糖苷酶>外切酶。3種木質(zhì)素對纖維素酶各組分吸附量大小順序為：銀杏木質(zhì)素>玉米秸稈木質(zhì)素>楊木木質(zhì)素,這與前面吸附動力學(xué)曲線分析中得到的最大吸附量結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

來自于銀杏、楊木和玉米秸稈中的磨木木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特點和性質(zhì)不同,紅外光譜分析結(jié)果表明,3種木質(zhì)素分別為G型、GS型和GSH型。通過木質(zhì)素和微晶纖維素對纖維素酶吸附動力學(xué)曲線的研究表明,3種木質(zhì)素和微晶纖維素對纖維素酶的最大吸附量分別為181.82、133.33、64.51和43.47 mg/g。它們對纖維素酶的親和力大小為銀杏木質(zhì)素>玉米秸稈木質(zhì)素>楊木木質(zhì)素>微晶纖維素,說明木質(zhì)素比微晶纖維素會吸附更多的纖維素酶,且3種木質(zhì)素中吸附性能最強的是銀杏木質(zhì)素。木質(zhì)素主要吸附的是纖維素酶中的內(nèi)切酶和β-葡萄糖苷酶。

[1] Jeremy S Luterbacher, Jacqueline M Rand, David Martin Alonso, et al. Nonenzymatic Sugar Production from Biomass Using Biomass Derivedγ-Valerolactone [J]. Science, 2014, 343: 277.

[2] Gan Q, Allen S J, Taylor G. Kinetic dynamics in heterogeneous enzymatic hydrolysis of cellulose: an overview, an experimental study and mathematical modelling[J]. Process Biochem, 2003, 38: 1003.

[3] Singh A, Kumar P K R, Schügerl K. Adsorption and reuse of cellulases during saccharification of cellulosic materials[J]. J Biotechnol, 1991, 18: 205.

[4] Xu F, Ding H, Osborn D, et al. Partition of enzymes between the solvent and insoluble substrate during the hydrolysis of lignocellulose by cellulases[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2008, 51: 42.

[5] Bj?rkman A. Studies on finely divided wood. Part 1.-Extraction of lignin with neutral solvent[J]. Svensk Papperstidn, 1956, 59(13): 477.

[6] Child J J, Eveleigh D E, Sieben A S. Determination of cellulase activity using hydroxyethyl cellulose as substrats[J]. Canadian Journal of Biochemistry, 1973, 51(1): 39.

[7] Deshpander M V, Eriksson K E, Pettersson L G. An assay for selective determination of exo-1,4-β-glucanases in a mixture of cellulolyticenzymes[J]. Anal Biochem, 1984, 138: 481.

[8] Faix O. Classification of lignins from different botanical origins by FT-IR spectroscopy[J]. Holzforschung, 1991, 45(s1): 21.

[9] Yang H T, Zheng X, Yao L, et al. Elucidation of the bonds between cellulose and dehydrogenation polymer with carbon-13 isotopic tracer method[J]. Cellulose Chem Technol, 2013, 47(3/4): 143.

[10] Yang Haitao, Zheng Xing, Yao Lan, et al.Structural changes of lignin in the Soda-AQ pulping process studied using the carbon-13 tracer method[J]. BioResources, 2014, 9(1): 176.

[11] Daniele Longo Machado, J?ao Moreira Neto,José Geraldo da Cruz Pradella, et al. Adsorption characteristics of cellulaseandβ-glucosidase on avicel, pretreated sugarcane bagasse, and lignin[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry, 2015, 62(5): 681.

[12] Zheng Yingfu, Zhang Songping, Miao Shida, et al. Temperature sensitivity of cellulase adsorption on lignin and its impact on enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass[J]. Journal of Biotech-nolog, 2013, 166: 135.

[13] JaKyongKo, Eduardo Ximenes, Youngmi Kim, et al. Adsorption of Enzyme onto Lignins of Liquid Hot Water Pretreated Hardwoods[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2015, 112(3): 447.

[14] Seiji Nakagame, Richard P Chandra, John F Kadla, et al. Enhancing the Enzymatic Hydrolysis of Lignocellulosic Biomass by Increasing the Carboxylic Acid Content of the Associated Lignin[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2011, 108(3): 538.

(責(zé)任編輯：郭彩云)

Study of the Adsorption of Cellulase on Lignin

YAO Lan1,2ZHOU Xiao-ming1TIAN Yan1YANG Hai-tao1,*

(1.SchoolofPulpandPaperEngineering，HubeiUniversityofTechnology，Wuhan，HubeiProvince， 430068；2.KeyLabofPulpandPaperScience&TechnologyofEducationMinistryofChina，QiluUniversityofTechnology，Ji’nan，ShandongProvince， 250353)

(*E-mail: pphtyang1979@aliyun.com.cn)

In the process of bioethanol production, adsorption of cellulase on lignin results in the high cost. In this paper, adsorption of cellulose on lignins from three different sources was studied and compared with the adsorption of cellulose on microcrystalline cellulose. FT-IR analysis showed that milled wood lignins from poplar, gingko and corn stover belonged to GS, G and GSH type, respectively. The results of adsorption of cellulase on lignin showed that the adsorption capacity was expressed as follows: gingko lignin > corn stover lignin > poplar lignin > microcrystalline cellulose. Enzyme activity measurement demonstrated a prominent absorption of endoglucanase andβ-glucosidase on lignins.

lignin； cellulase； adsorption； maximum adsorption capacity

2016- 02- 23

國家自然科學(xué)基金(31500496)；制漿造紙科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室開放基金(KF-201409)。

姚 蘭,女,1982年生；講師,博士；主要從事環(huán)境資源微生物技術(shù)研究工作。

*通信聯(lián)系人：楊海濤,E-mail:pphtyang1979@aliyun.com.cn。

TS7；TK6

A

1000- 6842(2016)04- 0025- 05