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    經(jīng)顱電刺激對(duì)阿爾茲海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬CA1區(qū)磷酸化tau蛋白表達(dá)情況的影響

    2017-01-12 07:36:22玥,
    關(guān)鍵詞:經(jīng)顱迷宮磷酸化

    劉 玥, 劉 芳

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    經(jīng)顱電刺激對(duì)阿爾茲海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬CA1區(qū)磷酸化tau蛋白表達(dá)情況的影響

    劉 玥, 劉 芳

    目的 探討經(jīng)顱電刺激對(duì)阿爾茲海默病(Alzeheimer’s disease,AD)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬CA1區(qū)磷酸化tau蛋白表達(dá)的影響。方法 健康SD大鼠,隨機(jī)分為:正常組、假手術(shù)組、模型組及經(jīng)顱電刺激2 w、4 w、6 w組。采用大鼠側(cè)腦室注射Aβ25-35凝聚態(tài)β-淀粉樣肽,同時(shí)腹腔注射D-半乳糖的方法,建立AD動(dòng)物模型。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力,HE染色,觀察海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu),免疫組化測(cè)定海馬CA1區(qū)磷酸化tau蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 (1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)大鼠測(cè)試學(xué)習(xí)和記憶能力,經(jīng)顱電刺激2 w組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),經(jīng)顱電刺激4 w組、6 w組與模型組比較,逃避潛伏期成績(jī)均好于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);(2)隨電刺激時(shí)間延長(zhǎng),經(jīng)顱電刺激各組磷酸化tau蛋白量逐漸降低,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 經(jīng)顱電刺激能夠改善阿爾茲海默病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,機(jī)制可能與下調(diào)海馬CA1區(qū)磷酸化tau蛋白表達(dá)有關(guān),對(duì)細(xì)胞的重塑有積極影響,遠(yuǎn)期效果有待進(jìn)一步研究。

    阿爾茨海默?。?經(jīng)顱電刺激; 海馬CA1區(qū); 學(xué)習(xí)記憶; 磷酸化tau蛋白

    阿爾茨海默病(Alzeheimer’s disease,AD)是常見的老年退行性變性疾病,是造成老年人認(rèn)知功能障礙的主要病因之一。目前發(fā)病機(jī)制仍不清楚,有研究表明其發(fā)病機(jī)制可能與tau蛋白過(guò)度磷酸化、β淀粉樣肽沉積、bcl-2過(guò)度表達(dá)及腦啡肽酶減少等因素有關(guān)[1,2]。AD治療目前無(wú)有效方法,我們過(guò)去研究提示經(jīng)顱電刺激治療可改善腦梗死大鼠運(yùn)動(dòng)功能,原因與經(jīng)顱電刺激可促進(jìn)腦的可塑性相關(guān)[3]。該方法能否用于改善AD認(rèn)知障礙目前仍不清楚。本研究使用經(jīng)顱電刺激(transcranial electrical stimulation,TES)治療AD模型大鼠,了解該方法對(duì)AD模型大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力改善的作用和海馬CA1區(qū)磷酸化tau蛋白表達(dá)影響。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠雌雄各半,由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào):SCXK(黔)200220001], 230±10 g,80只,經(jīng)水迷宮篩選,除去游泳及學(xué)習(xí)記憶能力差異較大者4只,得到符合實(shí)驗(yàn)要求SD大鼠76只。

    1.2 藥品、試劑及主要設(shè)備 Aβ25-35:Sigma(美國(guó))公司;D-半乳糖:進(jìn)口分裝,貴州賽蘭德生物科技公司;磷酸化tau蛋白免疫組化試劑盒:武漢博士德生物有限公司; Morris水迷宮、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)裝置:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所;CCS-l型大腦皮質(zhì)電刺激儀:河南省能源所;大鼠腦定位儀、電鉆、10 μl微量進(jìn)樣器:成都儀器廠;OLYMPUS-CX41攝像系統(tǒng)、圖像分析軟件:美國(guó)Olympus公司。

    1.3 方法

    1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠,分組前行Morris水迷宮訓(xùn)練并檢測(cè)逃避潛伏期及平均游泳速度,將學(xué)習(xí)記憶能力及游泳差異較大者剔除。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)方法按胡鏡清等人方法進(jìn)行[4]。

    1.3.2 建立AD動(dòng)物模型 (1)大鼠腹腔注射1.25%D-半乳糖(50 mg/kg/d),連續(xù) 6 w致衰老,假手術(shù)組腹腔注射等容積生理鹽水。(2)生理鹽水將Aβ25-35稀釋為10 μg/μl,37 ℃孵育 1 w,使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的Aβ25-35。在D-半乳糖連續(xù)處理6 w后的第2天起行Aβ25-35注射, SD大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于立體定位儀上,切開頭部皮膚,暴露顱骨。根據(jù)Paxinos[5]的《大鼠腦立體定位圖》,選擇右側(cè)側(cè)腦室為注射靶區(qū),于前囟向后1.0 mm,中線旁開1.7 mm,深度3.8 mm處用微型電鉆開顱骨,暴露硬腦膜,微量進(jìn)樣器緩慢將10 μg Aβ25-35注入,注射時(shí)間為10 min,留針10 min,使 Aβ25-35充分彌散;縫合皮膚,大鼠放回鼠籠中常規(guī)飼養(yǎng).假手術(shù)組注入等容積生理鹽水。(3)1 w后行水迷宮測(cè)試,選取癡呆大鼠納入實(shí)驗(yàn)。納入標(biāo)準(zhǔn):行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),方法同前,各組大鼠適應(yīng)訓(xùn)練至逃避潛伏期成績(jī)基本穩(wěn)定,以正常組大鼠逃避潛伏期的平均值為參考值,計(jì)算每只大鼠的平均逃避潛伏期與參考值之差所占該鼠的平均逃避潛伏期比值。該值>20%則認(rèn)定該鼠為造模成功大鼠。

    1.3.3 分組及實(shí)驗(yàn)步驟 共獲得符合標(biāo)準(zhǔn)的癡呆大鼠52只,隨機(jī)分為癡呆組、電刺激組(又分2 w組、4 w組及6 w組),每組13只;正常組6只,假手術(shù)組6只。采用CCS-l型大腦皮質(zhì)電刺激儀,將表面電極改裝為圓形刺激電極,直徑0.2 cm,陰極和陽(yáng)極間距為1.5 cm。經(jīng)顱電刺激治療時(shí),兩級(jí)分別置于雙側(cè)海馬區(qū)兩側(cè),刺激脈寬為100 μs,刺激頻率0.25 Hz,電壓為1000 V窄高壓方波刺激,每天連續(xù)刺激10次,刺激間隔2~3 s。經(jīng)顱電刺激組分別刺激2 w、4 w、6 w。假手術(shù)組僅給予與電刺激相同的聲音刺激,正常組不予特殊處理。

    1.3.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 正常組、假手術(shù)組、模型組,經(jīng)顱電刺激2 w、4 w、6 w組于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),方法同前。大鼠適應(yīng)訓(xùn)練2 d,第3天行定位航行實(shí)驗(yàn),定位航行實(shí)驗(yàn):把大鼠從平臺(tái)對(duì)側(cè)象限及第Ⅲ象限中點(diǎn)面朝水池壁放入水池中,記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期。

    1.3.5 大鼠海馬CA1區(qū)組織HE染色及磷酸化tau蛋白表達(dá) 1%水合氯醛腹腔麻醉;4%多聚甲醛250 ml灌注固定,取出腦組織,4%多聚甲醛溶液常溫下避光保存,石蠟包埋,取海馬CA1區(qū)組織快速連續(xù)切片5片,分別作HE染色觀察CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)及磷酸化tau蛋白免疫組化,在400倍視野下測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值。

    1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0版統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,組間采用χ2檢驗(yàn),組內(nèi)采用t檢驗(yàn),P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 各組大鼠造模前、后Morris水迷宮平均逃避潛伏期結(jié)果 造模前后水迷宮檢測(cè)平均潛伏期,兩組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明造模成功(見表1)。

    2.2 不同時(shí)期電刺激各組Morris水迷宮平均逃避潛伏期結(jié)果 電刺激2 w組在水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期與模型組無(wú)顯著差異,電刺激4 w及6 w組與模型組有顯著差異P<0.05,4 w組成績(jī)好于2 w組結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05(見表2)。

    2.3 免疫組化檢測(cè)磷酸化tau蛋白表達(dá)情況 電刺激組與模型組比較,隨電刺激時(shí)間延長(zhǎng),磷酸化tau蛋白量逐漸降低,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。

    2.4 HE染色模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞帶排列紊亂,海馬神經(jīng)元脫失,排列不規(guī)則,排列紊亂,細(xì)胞層次減少,胞核與胞漿界限不清,細(xì)胞周圍間隙增寬;部分神經(jīng)元變性壞死,體積縮小,細(xì)胞核固縮為三角形或多角形,染色質(zhì)深染。核仁消失,細(xì)胞脫失明顯。電刺激2 w組海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列較整齊,神經(jīng)元胞體腫脹減輕,各項(xiàng)病理改變均有不同程度的改善。電刺激4 w組和6 w組,與模型組大鼠比較,正常細(xì)胞數(shù)量比模型組明顯增多,神經(jīng)元排列更緊密,形態(tài)規(guī)則;細(xì)胞胞漿較之清亮,胞核染色更加清晰,視野中很少有核碎裂、核溶解的情況。

    表1 各組大鼠造模前、后水迷宮平均潛伏期比較

    與造模前比較*P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

    表2 各組大鼠水迷宮平均逃避潛伏期比較

    與模型組比*P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與電刺激2 w組比△P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

    表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化tau蛋白表達(dá)平均吸光度比較

    與正常組比*P<0.05;與模型組比#P<0.05

    3 討 論

    AD是嚴(yán)重影響老年人記憶和造成學(xué)習(xí)新知識(shí)能力障礙的疾病,目前認(rèn)為神經(jīng)元變性和纖維神經(jīng)纏結(jié)為主要的病理標(biāo)志[6],其中tau蛋白異常磷酸化是重要的病理改變。過(guò)度磷酸化的tau蛋白使其同微管蛋白結(jié)合能力減弱,破壞細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性,導(dǎo)致tau蛋白積聚形成神經(jīng)元纖維纏結(jié),破壞神經(jīng)元及突觸的正常功能,引起神經(jīng)元凋亡;異常磷酸化的tau蛋白還可充當(dāng)支架蛋白,造成樹突棘功能障礙,使樹突減少[7]。在阿爾茲海默病中,海馬體積萎縮是早期病癥之一,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床診斷。多篇研究發(fā)現(xiàn),海馬亞區(qū)萎縮要比海馬整體萎縮更具敏感性,具體體現(xiàn)在CA1、CA3、presubiculum等部位[8,9]。本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)海馬CA1區(qū)進(jìn)行觀察,HE染色顯示,模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞帶排列紊亂,海馬神經(jīng)元脫失,排列不規(guī)則,細(xì)胞層次減少,體積縮小,顯示部分神經(jīng)元變性壞死。電刺激治療后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)較模型組規(guī)則,說(shuō)明經(jīng)顱電刺激可調(diào)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。

    造模成功后,模型組大鼠水迷宮平均逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng),表明記憶能力和學(xué)習(xí)能力明顯降低。予經(jīng)顱電刺激治療,最初2 w與模型組比較無(wú)明顯差異,但4 w、6 w后水迷宮平均逃避潛伏期時(shí)間縮短,與模型組及2 w組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而4 w組和6 w組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明經(jīng)顱電刺激治療,可以改善大鼠的認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力,對(duì)記憶障礙有修復(fù)作用。修復(fù)可能通過(guò)減少磷酸化tau蛋白產(chǎn)生,改善神經(jīng)細(xì)胞的可塑性,使突觸后興奮性電位持續(xù)增加而產(chǎn)生。但經(jīng)顱電刺激各組與正常組比較仍有差異,原因可能與細(xì)胞重塑后,尚未形成良好的突觸聯(lián)系,導(dǎo)致認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)能力進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期。經(jīng)顱電刺激改善大鼠的認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力還可能與改善血流動(dòng)力學(xué)有關(guān),Wachter[10]等認(rèn)為電刺激可以擴(kuò)張血管,增加血流速度,改善微循環(huán),減輕免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)。通過(guò)免疫組化檢測(cè)磷酸化tau蛋白,結(jié)果顯示,經(jīng)顱電刺激治療與模型組比較磷酸化tau蛋白明顯降低,治療6 w和4 w比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明經(jīng)顱電刺激治療可減少磷酸化tau蛋白的產(chǎn)生,減少神經(jīng)纖維纏結(jié)情況。同時(shí)經(jīng)顱電刺激能改善大腦神經(jīng)功能,促使腦功能重組,改善認(rèn)知功能。

    本實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)顱電刺激治療短期內(nèi)能夠改善癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,對(duì)海馬CA1區(qū)細(xì)胞的重塑有積極影響。但由于本實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間較短,隨著磷酸化tau降低,大鼠的認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力是否會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)一步改善,遠(yuǎn)期效果需要進(jìn)一步研究。

    [1]Ness S,Rafii M,Aisen P,et al.Down’s syndrome and Alzheimer’s disease:towards secondary prevention[J].Nature Reviews Drug Discovery,2012,11(9):655-656.

    [2]秦海燕,鄒良玉.BCL2L12在阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中的作用[J].廣東醫(yī)學(xué),2014,35(3):464-465.

    [3]劉 芳,張 璐.經(jīng)顱電刺激對(duì)腦梗死大鼠的運(yùn)動(dòng)功能及神經(jīng)微絲表達(dá)的影響[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2004,26 (8):449-451.

    [4]胡鏡清,溫澤淮,賴世隆.Morris水迷宮檢測(cè)記憶屬性與方法學(xué)初探[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2000,17(2):117-120.

    [5]Paxinos G,Waston C.The rat brain in dtereotaxic coordinates[M].4th edition.San Diego:Academic Press,1998.

    [6]Querfurth HW,Laferla FM.Alzheimer’s disease[J].New England Journal of Medicine,2010,362(4):329-344.

    [7]Zempel H,Luedtke J,Kumar Y,et al.Amyloid-β oligomers induce synaptic damage via Tau-dependent microtubule severing by TTLL6 and spastin[J].Embo Journal,2013,32(22):2920-2937.

    [8]Mueller SG,Schuff N,Yaffe K,et al.Hippocampal atrophy patterns in mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease[J].Human Brain Mapping,2010,31(9):1339-1347.

    [9]Martin J,Chadwic K,Heidi M,et al.Maguire.CA3size predicts the precision of memory recall[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2014,111(29):10720-10725.

    [10]Wachter D,Wrede A,Schulz-Schaeffer W,et al.Transcranial direct current stimulation induces polarity-specific changes of cortical blood perfusion in the rat[J].Experimental Neurology,2011,227(2):322-327.

    Influences of transcranial electrical stimulation onlearning and memory ability andphosphorylated tau protein expression of hippocampal CA1area in rats with Alzheimer’s diseases

    LIUYue,LIUFang.

    (DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

    Objective To evaluate the influences of transcranial electrical stimulation onlearning and memory ability andphosphorylated tau protein expression of hippocampal CA1area in rats with Alzheimer’s diseases.Methods Healthy SD rats were randomly divided into:the normal group,the sham-operation group,the model group,and 2-week,4-week,and 6-week transcranial electrical stimulation groups.Rats were given Aβ25-35 condensed state β-amyloid peptide via lateral ventricles and D-galactosevia intraperitoneal injection at the same time to establish AD animal models.Morris water maze task was used to detect the rat learning and memory ability of each group.HE staining was carried out to observe the morphology structure of hippocampal CA1area,and immunohistochemistry was used to determine the phosphorylated tau protein expression in hippocampal CA1area.Results (1)Morris water maze task found no statistically significant differences between 2-week transcranial electrical stimulation group and the model group in rat learning and memory ability (P>0.05),and compared with the model group,the escape latency was better in the 4-week and 6-week transcranial electrical stimulation groups,with statistically significant differences (P<0.05);(2)With the extension of electrical stimulation,the amount of phosphorylated tau protein was gradually decreased in each transcranial electrical stimulation group,with statistically significant differences (P>0.05).Conclusion Transcranial electrical stimulation can improve the learning and memory ability of rats with Alzheimer’s disease.The mechanism may be related to down-regulating phosphorylated tau protein in hippocampal CA1area.It has positive effects on the reshaping of the cells,but the long-term effects remain to be further researched.

    Alzheimer’s disease; Transcranial electrical stimulation; Hippocampal CA1area; Learning and memory; Phosphorylated tau protein

    1003-2754(2016)12-1104-03

    2016-08-13;

    2016-11-30 基金項(xiàng)目:貴州省科技技術(shù)基金[No.黔科合J字(2011)2236號(hào)]作者單位:(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,貴州 貴陽(yáng) 550004) 通訊作者:劉 芳,E-mail:liufang_C@126.com

    R749.1

    A

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