結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)在診斷活動(dòng)性結(jié)核病中的價(jià)值

李根 李春玲 李海聰 趙慧敏 李鋒 胡志東 盧水華 范小勇 呂建新

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結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)在診斷活動(dòng)性結(jié)核病中的價(jià)值

李根 李春玲 李海聰 趙慧敏 李鋒 胡志東 盧水華 范小勇 呂建新

目的 分析結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)法在診斷活動(dòng)性結(jié)核病中的價(jià)值。方法 選取2015年1—12月來(lái)自上海市公共衛(wèi)生臨床中心、上海市肺科醫(yī)院和沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院的708例活動(dòng)性結(jié)核病患者、289例非結(jié)核肺部疾病患者和55名健康志愿者作為研究對(duì)象。將55名健康志愿者和289例非結(jié)核肺部疾病患者作為非活動(dòng)性結(jié)核組?；顒?dòng)性結(jié)核組包括68例肺外結(jié)核患者和640例肺結(jié)核患者，肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核者歸屬為肺結(jié)核患者；在肺結(jié)核患者中有230例患者痰標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢查呈陽(yáng)性，410例痰標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢查陰性。分離研究對(duì)象外周血單核細(xì)胞，應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的診斷效能。結(jié)果 結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核組的敏感度為81.78%(579/708)；檢測(cè)非活動(dòng)性結(jié)核組的特異度為79.36%(273/344)；檢測(cè)健康志愿者的特異度為89.09%(49/55)。在經(jīng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的650例研究對(duì)象中，正確檢出陽(yáng)性579例，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為89.08%；在所有檢查結(jié)果為陰性的402例研究對(duì)象中，正確檢出陰性273例，陰性預(yù)測(cè)值為67.91%(273/402)；陽(yáng)性似然比、陰性似然比和正確診斷效率依次為3.96、0.23和80.99%(852/1052)。檢測(cè)痰檢陽(yáng)性患者的陽(yáng)性檢出率相對(duì)更高，為84.78%(195/230)；檢測(cè)肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核患者的陽(yáng)性檢出率為91.49%(43/47)。結(jié)論 結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核病的診斷具有較高的敏感度和特異度，尤其在肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核的患者以及痰檢陽(yáng)性的肺結(jié)核患者中效果較好，可用于輔助診斷活動(dòng)性結(jié)核病。

結(jié)核； T淋巴細(xì)胞； 試劑盒, 診斷； 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)； 評(píng)價(jià)研究

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriatuberculosis，MTB)感染引起的重大傳染性疾病[1]。2016年世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查顯示，2015年全球結(jié)核病新發(fā)患者1040萬(wàn)例，死亡140萬(wàn)例[2]。中國(guó)第五次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告顯示，15歲及以上人群活動(dòng)性肺結(jié)核的患病率為459/10萬(wàn)，情況相當(dāng)嚴(yán)重[3]。

結(jié)核病的早期診斷是控制其傳播的關(guān)鍵。以記憶性T細(xì)胞檢測(cè)為基礎(chǔ)的γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay，IGRA)在發(fā)達(dá)國(guó)家中已被廣泛應(yīng)用于結(jié)核病感染的診斷[4]。MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒(商品名：QB-SPOT)相對(duì)于結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)等進(jìn)口試劑而言，其造價(jià)更低，更具有在我國(guó)臨床中廣泛應(yīng)用的潛在價(jià)值。筆者回顧性分析了該試劑盒在我國(guó)結(jié)核病診斷中的敏感度、特異度、診斷效率等相關(guān)指標(biāo)，為其對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核病的臨床診斷提供一定的理論依據(jù)。

材料和方法

1. 對(duì)象：選取2015年1—12月來(lái)自上海市公共衛(wèi)生臨床中心、上海市肺科醫(yī)院和沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院的708例活動(dòng)性結(jié)核病患者、289例非結(jié)核肺部疾病患者和55名健康志愿者作為研究對(duì)象。收集研究對(duì)象的年齡、性別、所患疾病等臨床信息。每一位受試者均用肝素抗凝管收集靜脈血液至少5 ml，并在4 h之內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。研究對(duì)象均經(jīng)知情同意并簽署知情同意書(shū)。

2.分組：非活動(dòng)性結(jié)核組包括55名健康志愿者和289例非結(jié)核肺部疾病患者?；顒?dòng)性結(jié)核組包括68例肺外結(jié)核患者和640例肺結(jié)核患者，其中，肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核者歸屬為肺結(jié)核患者；在肺結(jié)核患者中有230例患者痰標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢查呈陽(yáng)性，410例痰標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢查陰性。所有研究對(duì)象均采用MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

3. 納入排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)活動(dòng)性結(jié)核病確診標(biāo)準(zhǔn)：患者出現(xiàn)發(fā)熱、盜汗、咳嗽等典型結(jié)核病癥狀的基礎(chǔ)之上，滿足下列任意一項(xiàng)：①抗酸涂片鏡檢陽(yáng)性。②BACTEC MGIT 960快速培養(yǎng)MTB陽(yáng)性。③組織活檢或病理檢測(cè)可見(jiàn)典型結(jié)核病灶。④影像學(xué)檢查可見(jiàn)典型結(jié)核病征象，且抗結(jié)核藥物治療3個(gè)月后隨訪影像學(xué)檢查可見(jiàn)病灶明顯吸收、癥狀減輕。其中，肺外結(jié)核的診斷依據(jù)：肺部影像檢查未見(jiàn)明顯結(jié)核病灶，但肺外組織抗酸涂片鏡檢陽(yáng)性或MTB培養(yǎng)陽(yáng)性，或病理檢查提示干酪樣壞死。(2)活動(dòng)性結(jié)核病的排除標(biāo)準(zhǔn)(滿足其中任意一項(xiàng))：經(jīng)病灶活檢，明確診斷為腫瘤或其他病原體感染，且排除并發(fā)MTB感染；影像學(xué)檢查無(wú)明顯結(jié)核特征，且經(jīng)非抗結(jié)核藥物治療后病灶明顯吸收，癥狀減輕。(3)健康志愿者納入標(biāo)準(zhǔn)：影像學(xué)檢查正常，無(wú)疾病體征，無(wú)結(jié)核病接觸史。

4.主要試劑和儀器：Ficoll分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破饭荆籖PMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒由北京金豪制藥股份有限公司提供；酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定(ELISPOT)讀板儀購(gòu)自北京賽智生物制品公司。

5. MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)：參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，操作步驟如下：(1)使用5 ml肝素或檸檬酸鈉抗凝管，采集新鮮外周血標(biāo)本，注意樣本采集后不能冷藏或冷凍，室溫儲(chǔ)存不應(yīng)超過(guò)4 h；(2)用Ficoll分離液將外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分離出來(lái)；(3)吸取細(xì)胞(2.5×105個(gè)/孔)于預(yù)包被有γ-干擾素(IFN-γ)包被抗體的96孔板條，加入終濃度為10 μg/ml的MTB特異性抗原[早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)、Esx-1底物蛋白(Rv3615c)多肽庫(kù)]進(jìn)行刺激，并以僅加入培養(yǎng)基或2.5 μg/ml植物血凝素(PHA)為陰性或陽(yáng)性對(duì)照，于濃度5%的CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)18～20 h；(4)孵育完成后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，并依次添加生物素標(biāo)記的IFN-γ檢測(cè)抗體、鏈酶親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合物和3-氨基-9-乙基卡唑(AEC)顯色劑；(5)讀取板條上的點(diǎn)數(shù)。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)當(dāng)陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)<6，陽(yáng)性對(duì)照孔≥20，檢測(cè)孔點(diǎn)數(shù)減去陰性孔點(diǎn)數(shù)≥6時(shí)，判定結(jié)果為陽(yáng)性；(2)當(dāng)陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)>6，陽(yáng)性對(duì)照孔≥20，檢測(cè)孔點(diǎn)數(shù)≥2倍的陰性對(duì)照孔點(diǎn)數(shù)時(shí)，判定結(jié)果為陽(yáng)性；(3)當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)<20，無(wú)論陰性孔和檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)為多少，都視為無(wú)效，需重復(fù)檢測(cè)。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)算MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)效能指標(biāo)。計(jì)算不同細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果肺結(jié)核患者應(yīng)用MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的斑點(diǎn)數(shù)，并進(jìn)行比較；數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(Q1～Q3)]表示，選用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.檢測(cè)效能：采用MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒在活動(dòng)性結(jié)核組708例患者中，成功檢出579例，敏感度為81.78%(579/708)；在非活動(dòng)性結(jié)核組中，檢測(cè)71例陽(yáng)性，特異度為79.36%(273/344)；其中，在55名健康志愿者中檢測(cè)6名陽(yáng)性，特異度為89.09%(49/55)。在檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的650例研究對(duì)象中，正確檢出陽(yáng)性579例，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為89.08%(579/650)；在所有檢查結(jié)果為陰性的402例研究對(duì)象中，正確檢出陰性273例，陰性預(yù)測(cè)值為67.91%(273/402)。MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的陽(yáng)性似然比、陰性似然比和正確診斷效率依次為3.96、0.23和80.99%(852/1052)。

2.不同類(lèi)型標(biāo)本檢測(cè)效能：在708例結(jié)核病患者中，包括了470例單一肺結(jié)核、56例單一肺外結(jié)核、47例肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核、135例結(jié)核并發(fā)其他疾病(包括腎病綜合征、糖尿病和艾滋病等)，應(yīng)用MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的陽(yáng)性率依次為：82.98%(390/470)、83.93%(47/56)、91.49%(43/47)和73.33%(99/135)。

3.不同細(xì)菌學(xué)結(jié)果患者檢測(cè)效能：在640例肺結(jié)核患者中，包括有230例細(xì)菌學(xué)檢查陽(yáng)性，應(yīng)用MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒檢測(cè)84.78%(195/230)為陽(yáng)性；410例細(xì)菌學(xué)檢查陰性，80.98%(332/410)檢測(cè)為陽(yáng)性。其中，細(xì)菌學(xué)陽(yáng)性患者中的檢出斑點(diǎn)數(shù)為64.50(134.00～22.25)個(gè)，明顯高于細(xì)菌學(xué)陰性患者斑點(diǎn)數(shù)20.00(52.00～5.00)個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=9.28，P=0.004)。

4.對(duì)不同類(lèi)型的肺外結(jié)核患者的檢測(cè)效能：本試驗(yàn)入組的56例肺外結(jié)核患者中包括了5例結(jié)核性腦膜炎(tubercular meningitis，TBM)、11例結(jié)核性腹膜炎(tuberculous peritonitis，TBP)、11例淋巴結(jié)結(jié)核(lymphatic tuberculosis，LTB)、6例骨結(jié)核(bone tuberculosis，BTB)、5例腎結(jié)核(renal tuberculosis，RTB)、8例腰椎結(jié)核(lumbar vertebral tuberculosis，LVTB)、3例支氣管結(jié)核(endobronchial tuberculosis，EBTB)、1例皮膚結(jié)核(skin tuberculosis，STB)和6例結(jié)核性胸膜炎(tuberculous pleuritis，TBPL)。MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性例數(shù)依次為4、11、10、3、5、6、3、0、5，總檢出率為83.93%(47/56)。

討 論

IGRA是近年發(fā)展起來(lái)的一種免疫學(xué)診斷新方法，相較于結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculosis skin test，TST)，其在檢測(cè)MTB感染方面擁有更好的特異度和敏感度，是篩查和檢查結(jié)核病的重要手段之一[5-6]。目前，市場(chǎng)中應(yīng)用最為廣泛的是基于酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)的T-SPOT.TB。但是，進(jìn)口T-SPOT.TB試劑的檢測(cè)費(fèi)用昂貴，因而在一定程度上限制了其在我國(guó)多數(shù)地區(qū)，尤其是在低收入地區(qū)中的臨床推廣[7-8]。MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒為我國(guó)生產(chǎn)，生產(chǎn)成本相對(duì)低廉，檢測(cè)費(fèi)用僅為T(mén)-SPOT.TB的50%左右，因而更適宜在我國(guó)推廣使用。與T-SPOT.TB不同的是，MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒選用的抗原除了ESAT-6、CFP10以外，還添加了第3個(gè)抗原——Rv3615c。Rv3615c編碼在RD1區(qū)外，大小及序列與ESAT-6和CFP10類(lèi)似，也是一種可引起效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的MTB特異性抗原[9]。MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒將MTB特異性T細(xì)胞抗原ESAT-6、CFP10和Rv3615c全長(zhǎng)的重疊多肽組成混合肽庫(kù)作為抗原，對(duì)外周血中分離到的PBMC進(jìn)行體外刺激，結(jié)合ELISPOT技術(shù)，即可對(duì)結(jié)核病疑似患者及潛伏感染者的全血樣本進(jìn)行高特異性的篩查[10-11]。

本研究結(jié)果顯示，MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病患者檢測(cè)的敏感度和特異度與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的T-SPOT.TB的敏感度和特異度相當(dāng)[12-15]。此外，筆者還比較了該試劑盒在不同類(lèi)型結(jié)核病中的陽(yáng)性檢出率，其中，在肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核患者中的檢出率最高，為91.49%；在結(jié)核并發(fā)其他疾病患者中的檢出率最低，僅為73.33%。究其原因，因?yàn)樵诓l(fā)其他免疫或代謝性疾病的時(shí)候，人體的細(xì)胞免疫反應(yīng)會(huì)受到一定程度的抑制，能分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)減少，因而降低了這部分并發(fā)感染人群的陽(yáng)性檢出率；此結(jié)果與Kim等[16]報(bào)道的結(jié)果相符。在640例肺結(jié)核患者中，有230例痰菌檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，其分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量明顯高于痰檢陰性者，其陽(yáng)性檢出率為84.78%，也高于痰檢陰性人群的80.98%。痰檢陽(yáng)性的患者由于其體內(nèi)的MTB載量更多，能誘導(dǎo)體內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞分泌產(chǎn)生更多的IFN-γ，從而提高了其檢出率。在肺外結(jié)核患者的檢測(cè)中，總檢出率為83.93%?？梢?jiàn)，該檢測(cè)法也適用于活動(dòng)性肺外結(jié)核患者的體外診斷，特別是對(duì)于TBP和LTB等肺外結(jié)核具有較高的臨床診斷價(jià)值。

本研究還存在一定的局限性。在計(jì)算特異度指標(biāo)時(shí)，納入的對(duì)照組人群或?yàn)楸淮_診為非活動(dòng)性結(jié)核的肺部感染人群，或?yàn)闊o(wú)臨床癥狀的健康志愿者。因缺乏區(qū)分MTB潛伏感染與活動(dòng)性結(jié)核病的標(biāo)準(zhǔn)方法，故無(wú)法判定所入組的對(duì)照人群中是否含有MTB潛伏感染者，可能導(dǎo)致該檢測(cè)法對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核病診斷的特異度被低估。

總之，筆者的研究結(jié)果表明MTB效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)MTB感染方面具有較高的特異度與敏感度，對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核病的體外診斷具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值，尤其在痰檢陽(yáng)性的肺結(jié)核患者與肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核的患者中表現(xiàn)出了較好的診斷準(zhǔn)確性。同時(shí)，相較于T-SPOT.TB，該檢測(cè)法費(fèi)用更為低廉，且具有較高的檢測(cè)質(zhì)量，因而更適宜在我國(guó)臨床中推廣。

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(本文編輯：李敬文)

Value ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay in diagnosis of active tuberculosis

LIGen*,LIChun-ling,LIHai-cong,ZHAOHui-min,LIFeng,HUZhi-dong,LUShui-hua,FANXiao-yong,LYUJian-xin.

*SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China

s:FANXiao-yong,Email:xyfan008@fudan.edu.cn;LYUJian-xin,Email:jxlu313@163.com

Objective To evaluate the value ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay in diagnosis of active tuberculosis (ATB). Methods A total of 708 ATB patients, 289 non-tuberculosis (Non-TB) patients and 55 healthy controls were recruited from Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai Pulmonary Hospital and Shenyang Chest Hospital between January 2015 and December 2015 and were then tested by theMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay. Non-active tuberculosis (NATB) group included 55 heathy individuals and 289 Non-TB patients. And 708 ATB patients included 640 cases of pulmonary tuberculosis (PTB) and 68 cases of extra-pulmonary tuberculosis (EPTB), in which the patients suffered from PTB complicated with EPTB were classified into PTB cases. Of the PTB cases, 230 were positive and 410 were negative in sputum smear test. The peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were separated and then detectedMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay to evaluate its value in diagnosis of ATB. Results The results showed that the sensitivity ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay in the ATB patients was 81.78% (579/708); the specificity ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay in the Non-TB patients and healthy controls were 79.36% (273/344) and 89.09% (49/55), respectively. Among all the 650 positive cases, 579 were detected correctly and the positive predictive value was 89.08%; while of the 402 negative cases, 273 were detected correctly and the negative predictive value was 67.91%. Additionally, positive likelihood ratio (LR+), negative likelihood ratio (LR-) and diagnostic efficiency ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay were 3.96, 0.23 and 80.99% (852/1052), respectively. Positive detection rate of patients with sputum smear positive was relatively higher (84.78% (195/230)), and positive detection rate of PTB combined with EPTB was 91.49% (43/47) when tested by theMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay. ConclusionMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay has shown a high sensitivity and specificity in detection of ATB, especially in the PTB combined with EPTB cases, PTB cases with bacterial-positive results, it could be adjunctive to the diagnosis of ATB.

Tuberculosis; T-lymphocytes; Reagent kits, diagnostic; Enzyme-linked immunospot assay; Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.05.016

“十二五”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2013ZX10003007-003)；國(guó)家自然科學(xué)基金(81273328、31170876)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目(17ZR1423900、134119a5200)

325035 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院(李根、李春玲、范小勇、呂建新)；上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心(李海聰、趙慧敏、李鋒、胡志東、盧水華、范小勇)

范小勇，Email：xyfan008@fudan.edu.cn；呂建新，Email：jxlu313@163.com

2016-12-21)