口腔黏膜上皮細胞片移植治療角膜緣干細胞缺損的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用

邱吉妮 張朝然

·綜 述·

口腔黏膜上皮細胞片移植治療角膜緣干細胞缺損的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用

邱吉妮 張朝然

角膜緣干細胞為正常角膜上皮的自我更新提供了來源，在維持眼表穩(wěn)態(tài)中起到了極為重要的作用。近年來，隨著對成體干細胞認識的加深以及生物組織工程學(xué)的發(fā)展，培養(yǎng)的口腔黏膜細胞片移植已成為治療角膜緣干細胞缺損的方法之一。本文就其培養(yǎng)方法、細胞片表型及臨床應(yīng)用結(jié)果的進展進行綜述。(中國眼耳鼻喉科雜志，2017，17：140-142,149)

角膜緣干細胞缺損；口腔黏膜上皮細胞；載體；表型特征;最佳矯正視力；新生血管化

健康穩(wěn)定的眼表保護眼睛免受外傷、感染和干燥的損害，對維持良好的視力至關(guān)重要。眼表上皮由結(jié)膜、角膜緣和角膜3種特異的上皮細胞構(gòu)成。角膜緣干細胞可不斷分化并形成角膜上皮細胞，為多層的、非角化的角膜上皮再生提供來源。

化學(xué)傷、熱灼傷、Steven-Johnson綜合征(Steven-Johnson syndrome)以及眼瘢痕性類天皰瘡等疾病都可導(dǎo)致角膜緣干細胞缺損(limbal stem cell deficiency，LSCD)，其結(jié)果是結(jié)膜上皮侵入角膜，臨床表現(xiàn)為持續(xù)的角膜上皮缺損，角膜基質(zhì)混濁以及新生血管化等一系列病變。疼痛、畏光、干眼、視力下降甚至失明等極大地影響了角膜緣干細胞缺損患者的生活質(zhì)量。由于LSCD患者多同時伴有眼表的慢性炎癥和干眼，這使得LSCD患者角膜移植的風(fēng)險大大增加，或者說LSCD是角膜移植手術(shù)的禁忌證。因此重建角膜緣干細胞的功能，是重建眼表的關(guān)鍵步驟。

角膜緣干細胞重建的方法主要分為：自體或同種異體角膜緣移植，基于組織工程技術(shù)體外培養(yǎng)的細胞片移植。對于雙側(cè)LSCD患者而言，并無自體角膜緣供體行自體角膜緣移植或培養(yǎng)的角膜緣細胞片移植，而同種異體角膜緣移植或培養(yǎng)的異體角膜緣上皮移植有很大的免疫排斥風(fēng)險，即便使用免疫抑制劑，異體角膜緣細胞片移植的成功率依然很低[1]。為了解決這些問題，包括結(jié)膜、口腔黏膜、鼻黏膜、頭發(fā)毛囊以及牙髓在內(nèi)的等多種自體組織都用來研究以替代角膜緣作為供體材料。其中，口腔黏膜上皮細胞(oral mucosal epithelial cell, OMEC)片能夠在體外維持其干細胞特性，并能夠表達CK3,CK19,Ki-67,p63,p75等角膜上皮標記物。既避免了異體移植可能發(fā)生的排斥以及使用免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素伴隨的并發(fā)癥等問題，同時適用于單側(cè)和雙側(cè)LSCD。而且口腔黏膜上皮細胞容易取得，所需的黏膜組織很小，通過局部麻醉即可獲得，操作傷害小，傷口1周內(nèi)可無瘢痕痊愈。在動物實驗及臨床試驗中都取得了滿意的效果[2-3]。

1 口腔黏膜體外培養(yǎng)方法

1.1 細胞片載體選擇 載體是細胞增殖的場所，同時引導(dǎo)細胞生長，決定著所構(gòu)建組織的形態(tài)，在OMEC培養(yǎng)、細胞片移植及之后的轉(zhuǎn)歸中都發(fā)揮著巨大作用。合適的載體需要同時滿足光學(xué)透明、生物性兼容、無菌、硬度適合等多個條件。

羊膜具有免疫原性低、抗新生血管、可抑制成纖維化和減少瘢痕等特點，已經(jīng)作為常規(guī)載體用于OMEC片的構(gòu)建[4]。但羊膜與上皮細胞黏附率較低，細胞易從羊膜上脫落，移植后羊膜組織溶解吸收較慢，影響種子細胞與角膜基質(zhì)黏附生長及角膜組織的透明。而且羊膜本身的質(zhì)量不一，透明度有限，具有潛在的醫(yī)源性感染的風(fēng)險。這些缺點限制了羊膜進一步的臨床應(yīng)用。

隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，近來各種生物材料在介導(dǎo)細胞附著生長、促進細胞增殖和分化、維持干細胞活性及操作方便等方面都有不斷的突破與改進。膠原、纖維蛋白凝膠、接觸鏡、聚己內(nèi)酯、絲蛋白、聚甲基丙烯酸酯、角蛋白、明膠殼聚糖、聚乳酸-羥基乙酸、聚乙二醇等多種材料作為細胞片載體的研究進展不一，多數(shù)仍處于體外實驗階段。近期研究[5]發(fā)現(xiàn)，聚己內(nèi)酯經(jīng)過等離子處理后生物兼容性和光學(xué)透明度極大改善，尚無體內(nèi)實驗的報道。等離子聚合體包被的接觸鏡為細胞載體能夠增加細胞的附著和增殖，首次報道在動物實驗中轉(zhuǎn)移后的細胞能夠存活并能幫助部分眼表重建[6]。但其所選擇的種子細胞多為角膜緣或角膜上皮細胞，在今后的研究中或許也將用于口腔黏膜上皮細胞的培養(yǎng)。

無載體的溫度敏感培養(yǎng)法[7]和纖維蛋白膠原培養(yǎng)法[8]在當(dāng)下培養(yǎng)OMEC中廣泛應(yīng)用，已經(jīng)在多個臨床試驗中證明了其可行性，其手術(shù)本身也并不要使用縫線，從而大大加速手術(shù)進程。由于無載體的細胞片直接與角膜基質(zhì)相接觸，上皮和基質(zhì)之間的連接更為緊密，可以提高術(shù)后細胞片的生存率，減少新生血管的產(chǎn)生，提高患者術(shù)后的視力。但通過羊膜載體細胞片與無載體細胞片的細胞增殖情況比較發(fā)現(xiàn)，前者BrdU細胞陽性率較高，而Ki67細胞陽性率較低，說明羊膜可能對維持上皮細胞處于低分化狀態(tài)有一定作用[9]。

1.2 飼細胞及血清的取舍 當(dāng)前,口腔黏膜上皮移植(cultured oral mucosal epithelial transplantation, COMET)細胞的體外培養(yǎng)多用胎牛血清和鼠源性的3T3細胞作為飼細胞的培養(yǎng)體系。以Rheinwald和Green在1975年創(chuàng)立的利用經(jīng)6 Gry Y射線照射失去增殖能力的鼠3T3細胞作為滋養(yǎng)層細胞的方法為代表,其特征是3T3細胞滋養(yǎng)層和使用含胎牛血清的培養(yǎng)液。這種細胞培養(yǎng)體系需血清、涂層板和細胞滋養(yǎng)層，成本較高，操作繁瑣，其本身就包含著傳播致病菌、免疫反應(yīng)和移植排斥的風(fēng)險，且達不到生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(good manufacturing practice, GMP)的要求。有學(xué)者[10]發(fā)現(xiàn)皮膚成纖維細胞可以替代3T3作為飼細胞培養(yǎng)口腔黏膜細胞，研究表明皮膚成纖維細胞可以在細胞傳代時維持其干細胞特點，有效性好于3T3細胞。

自體血清也可以用來培養(yǎng)口腔黏膜上皮細胞，但在使用的同時伴隨著傳播病毒感染的潛在風(fēng)險。而且，血清在培養(yǎng)基中的作用是非常復(fù)雜的，由于血清成分的多樣性使細胞培養(yǎng)條件的標準難以確定。由于培養(yǎng)基中血清的存在，也影響了所需細胞特點的檢測[11]。近來，有研究[12]報道了無血清的確定型培養(yǎng)基培養(yǎng)OMEC的可行性。之后，Kolli 等[13]以羊膜為載體，使用無動物源物質(zhì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)OMEC片，并應(yīng)用于化學(xué)傷導(dǎo)致的LSCD患者取得了較好的效果。Sheth等[8]報道了以纖維蛋白凝膠為載體，不依賴于3T3的OMEC培養(yǎng)。這些研究都在一定程度上提高了上皮細胞片培養(yǎng)材料的可靠性和安全性，但尚處于初步探索階段，之后較大規(guī)模的動物實驗、臨床試驗及臨床應(yīng)用有待證實。符合GMP的細胞培養(yǎng)方法仍未規(guī)范統(tǒng)一。研究符合GMP要求的無載體無血清的確定型培養(yǎng)基是未來COMET的發(fā)展方向。

2 細胞片及其臨床效果評估

2.1 細胞片表型 OMEC起源于口腔黏膜，在用于分化角膜上皮細胞時，首先要證實所培養(yǎng)細胞片上具有分化能力的干細胞存在，并能夠保持其再生功能，確保角膜上皮細胞的更新。其次，細胞片的完整性在于細胞連接，其在細胞交換和細胞穩(wěn)定中起到重要作用。第三，細胞片抗新生血管因子對于減少角膜新生血管化，確保細胞片移植的存活率十分重要。

Sen等[14]發(fā)現(xiàn)OMEC表達非角化上皮細胞的分子標志物K4和K13，這說明OMEC有形成類似于角膜上皮細胞的多層上皮細胞細胞片的能力。OMEC培養(yǎng)的細胞片是多層的，包括細胞核較大，核質(zhì)比較高的能夠快速增殖并分化的圓形小細胞和細胞核較小，核質(zhì)比較大的分化成熟的上皮細胞。分子生物學(xué)標記物同樣證明了細胞片中既包含具有干細胞潛能的細胞，又包含成熟的上皮細胞。通過掃描電鏡觀察OMEC發(fā)現(xiàn)，細胞間如正常的角膜上皮細胞間一樣，存在細胞與細胞間的連接橋粒。同時，首次觀察到培養(yǎng)的OMEC中含有黏蛋白顆粒[14]。這些發(fā)現(xiàn)都證實了體外培養(yǎng)的OMEC具有增殖分化能力，并能夠形成細胞連接，還具有減輕黏液缺損，緩急眼表疾病相關(guān)的干眼狀態(tài)的潛能。

Bardag-Gorce等[15]用溫度敏感法培養(yǎng)兔OMEC片，并使用微陣列分析研究了細胞片的基因表達，證實了細胞片上干細胞的存在。并發(fā)現(xiàn)細胞片細胞外基質(zhì)的MMP-1，MMP-3,MMP-12等促進新生血管因子的基因表達下調(diào)，細胞間隙連接蛋白A7和保護角膜免受紫外線輻射的ALDH1A1等基因表達上調(diào)，說明了COMET用于LSCD的可靠性。這些研究證實了OMEC具有再生能力，良好的細胞交換作用，有能夠促進細胞黏附和抗新生血管形成的細胞外基質(zhì)。

2.2 細胞片在眼表的結(jié)構(gòu)重建 COMET術(shù)后存在于眼表的口腔黏膜上皮細胞片是否分化成角膜上皮細胞以及是否維持其增殖分化的能力是近期的熱點之一。Soma等[16]在對大鼠模型中的研究中發(fā)現(xiàn)，COMET術(shù)后細胞片維持了上皮干細胞增殖分化能力，同正常眼表角膜干細胞的分布相同。細胞片的干細胞多存在于角膜外周，其機制有待進一步研究。

Sugiyama等[17]在對動物模型COMET術(shù)后研究發(fā)現(xiàn)，移植后的OMEC全層均表達有角蛋白K14和干細胞標志物p63。而它們存在于正常角膜緣基底上皮細胞而非正常角膜上皮細胞。其中1例OMEC在不同位置觀察到有K4和角膜上皮特異性標志物K12的表達。Chen等[18]報道了4例COMET術(shù)后角膜上皮免疫熒光染色的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)4例角膜上皮均具有干細胞增殖分化能力，并表達口腔黏膜上皮分化特異性標志物K13，其中僅1例角膜周邊局部出現(xiàn)角膜上皮分化特異性標志物K12，說明COMET術(shù)后移植到眼表的OMEC依然偏向分化為OMEC。最近，Gaddipati等[19]對1例COMET術(shù)后11個月的角膜上皮研究,證實了之前對干細胞和口腔黏膜上皮標志物的發(fā)現(xiàn)。該研究還發(fā)現(xiàn)角膜上皮胞質(zhì)中表達K12，胞核中表達PAX6，這些是角膜上皮細胞特有的標志物，說明培養(yǎng)的(cultured OMEC, COMEC)在COMET術(shù)后維持OMEC特點的同時獲得了角膜上皮樣特征。目前此類研究的病例數(shù)仍比較少，檢測時間不一，COMET術(shù)后干細胞、OMEC、角膜上皮細胞出現(xiàn)及能夠維持的時間有待進一步研究。

2.3 細胞片在眼表的功能重建 總的來說，盡管在角膜周邊區(qū)域有一定程度的新生血管形成，COMET在臨床中已經(jīng)取得較好的中長期效果。同時，培養(yǎng)的OMEC片表達黏蛋白，可以減輕黏液缺損，緩解眼表疾病相關(guān)的干眼狀態(tài)[14]。Nakamura等[20]報道了對19例患眼至少隨訪36個月，其中10例患者視力有所恢復(fù)，在重建穹隆功能和解除瞼球粘連方面也非常有效。Satake等[21]報道了對40例眼平均25.5個月隨訪，1年時，64.8%患眼角膜表面穩(wěn)定，2年為53.1%，3年為53.1%。近來，Dobrowolsk等[22]在對無虹膜患者COMET術(shù)后觀察發(fā)現(xiàn)，88.2%的患眼視力有所提高。

不同與之前無載體細胞片較羊膜載體細胞片來說更加易碎的預(yù)想，通過對膠原纖維凝膠的無載體細胞片與羊膜載體細胞片做比較，Kaplan-Meier分析表明無載體細胞片生存率明顯高于羊膜載體細胞片，新生血管程度低于羊膜載體組，其術(shù)后最佳矯正視力(best corrected visual acuity，BCVA)也明顯好于羊膜載體細胞片[23]，與之前動物實驗[9]觀察到無載體組細胞片光學(xué)透明高于羊膜組的結(jié)果一致。尚無長期的臨床試驗觀察到,在COMET術(shù)后較長的時間內(nèi)有無羊膜載體影響上皮細胞的增殖狀態(tài)。Sotozono等[24]對多種病因引起的LSCD患者COMET術(shù)后視力的多元回歸曲線分析，表明術(shù)后角膜新生血管化和瞼球粘連與BCVA明顯相關(guān)。LSCD患者的長期視力得到提高，即使是對于嚴重的眼表疾病伴隨嚴重的淚液缺乏患者，COMET可以極大改善其視力。

COMET失敗的主要原因是持續(xù)的上皮缺損(persistent epithelial deficiency，PED)和角膜表面纖維和新生血管化。PED和術(shù)前PED狀態(tài)相關(guān)。雖然COMEC細胞外基質(zhì)的MMP-1，MMP-3,MMP-12等促進新生血管因子的基因表達下調(diào)，而且COMEC與培養(yǎng)的角膜上皮細胞片相比，它們表達的血管生成抑素，F(xiàn)GF-2，F(xiàn)lt-1，VEGFR-2和VEGF并無明顯差別，但是內(nèi)皮抑素，PEDF和TSP-1等抗血管生成因子在COMEC中明顯少于后者。Chen等[25]對COMET術(shù)后的角膜進行了一系列血管生成相關(guān)因子的檢測發(fā)現(xiàn)，sF1t-1、TIMP-3和TSP-1這些抗血管生成因子的缺乏可能與COMET術(shù)后新生血管化密切相關(guān)，還提出新生血管化的程度可能與細胞分化的程度有關(guān)。Bardag-Gorce等[2]對LSCD動物模型COMET術(shù)后6個月的角膜進行組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，抗血管生成因子TIMP-3表達升高，而血管生成因子MMP-3表達降低可能是新生血管化降低的原因。由于COMET術(shù)后角膜材料不易獲得，對臨床新生血管化的病例研究較少，影響COMET術(shù)后新生血管化的血管生成相關(guān)因子和具體機制尚未明確，但抗新生血管治療可以作為COMET術(shù)后防止外周新生血管長入的方法來提高COMET術(shù)后效果[26]。

3 展望

目前，COMET在臨床上取得良好的效果，具有臨床應(yīng)用的理論基礎(chǔ)，能有效地用于治療LSCD。但COMET術(shù)后OMEC片是否能夠完全表達角膜上皮細胞的結(jié)構(gòu)特點，是否能夠達到正常角膜上皮所具有的功能，以及其具有一定結(jié)構(gòu)和功能所需的時間和能夠維持的時間都尚未明確。角膜新生血管長入及影響其長入程度的機制也未能明確，這些問題都對于COMET的成功應(yīng)用和患者的預(yù)后十分重要。在當(dāng)前的COMET臨床研究中，病例數(shù)較少，眼表情況不一，還需要通過嚴格的病例對照和病例研究來幫助我們對不同患者有明確的評估并確定適宜的個體化治療方法。建立完善的、符合GMP標準的無載體的確定型培養(yǎng)基培養(yǎng)的OMEC片，減少術(shù)后新生血管生成和其他并發(fā)癥，為患者提供個體化治療，是我們今后努力的方向。

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(本文編輯 諸靜英)

Update on cultivate oral epithelial cells sheet for limbal stem cell deficiency

QIUJi-ni,ZHANGChao-ran.

DepartmentofOphthalmology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,China

ZHANG Chao-ran, Email: fdeent@126.com

Limbal stem cell (LSC), which is the source of the corneal epithelium cell, plays an important role in the ocular surface. In recent decades, with the development of stem cell application and tissue engineering, cultivated oral epithelial cells sheet transplantation (COMET) has become an alternative for LSC deficiency. In this review, the cultivated methods, cell phenotypic characteristics of the cells sheet, as well as the clinical results of COMET in recent years were summarized. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:140-142,149)

Limbal stem cell deficiency; Oral mucosal epithelial cell; Carriers; Phenotypic characteristics; Best corrected vision acuity; Neovascularization

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031

張朝然(Email:fdeent@126.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.02.020

2016-01-13)