基于肌紅蛋白構(gòu)筑新型生物催化劑*

張芳芳， 徐甲坤， 王 芳， 郭 輝， 梁興國

(1. 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

基于肌紅蛋白構(gòu)筑新型生物催化劑*

張芳芳1，2， 徐甲坤2**， 王 芳2， 郭 輝1， 梁興國1

(1. 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

利用計(jì)算機(jī)模擬與基因工程相結(jié)合的方法，對抹香鯨肌紅蛋白活性中心疏水空穴進(jìn)行設(shè)計(jì)，重點(diǎn)研究了肌紅蛋白活性部位68、107位置的氨基酸(大小、疏水性)對肌紅蛋白催化性能的影響。設(shè)計(jì)、制備、表達(dá)并純化了H64D/I107V、H64D/I107A和H64D/I107G三種變體，測試了不同變體對吲哚羥基化反應(yīng)的催化性能，并通過計(jì)算機(jī)模擬闡明肌紅蛋白活性部位構(gòu)筑與其催化性能之間的聯(lián)系。研究表明：H64D/I107V、H64D/I107A和H64D/I107G三種變體均能催化吲哚的羥基化反應(yīng)，kcat分別為10.6、9.2和25.2 min-1；證明了107位置氨基酸的空間位阻效應(yīng)和68位置氨基酸的疏水性能夠顯著影響底物在蛋白活性部位的空間構(gòu)象，進(jìn)而影響肌紅蛋白的催化性能。研究結(jié)果為基于肌紅蛋白新型生物催化劑的開發(fā)提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。

生物催化劑；肌紅蛋白；基因突變；催化性能；計(jì)算機(jī)模擬

肌紅蛋白(Myoglobin，見圖1)由一條153個(gè)氨基酸組成的肽鏈(珠蛋白)和一個(gè)血紅素(Heme)輔基組成[1]，其生理功能為氧氣的儲存和運(yùn)輸[2]，其本身并不具有催化功能。肌紅蛋白是第一個(gè)被X射線闡明三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(1962年諾貝爾化學(xué)獎)[3-4]，與其他血紅素蛋白相比，肌紅蛋白具有表達(dá)量高、穩(wěn)定性優(yōu)異、易于純化等優(yōu)點(diǎn)，常被研究者們作為模型蛋白來闡明其它血紅素蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系[5-9]，并作為優(yōu)異的框架材料開發(fā)具有新穎功能的蛋白[10-14]。

Yoshihito Watanabe研究小組利用基因定點(diǎn)突變(Site-directed Mutagenesis)技術(shù)，模擬其它血紅素蛋白活性部位的氨基酸排布，對抹香鯨肌紅蛋白(Sperm Whale Myoglobin，swMb)活性部位進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，成功地賦予了肌紅蛋白過氧化物酶、過氧化氫酶和過氧羥基脂肪酸羥化環(huán)氧化酶等性能，實(shí)現(xiàn)了不同類型血紅素蛋白的結(jié)構(gòu)及功能間的相互轉(zhuǎn)化[15-18]。譚相石研究小組和林英武研究小組聯(lián)合開發(fā)的L29E/F43H swMb突變體成功模擬了細(xì)胞珠蛋白和神經(jīng)珠蛋白活性部位的構(gòu)筑，而他們開發(fā)的F43Y swMb突變體則展現(xiàn)了血紅素翻譯后修飾的多樣性[19-21]。這些研究闡明了不同血紅素蛋白特定功能的結(jié)構(gòu)要求，詮釋了血紅素輔基如何被不同的蛋白分子所利用，來執(zhí)行不同的生理功能。Xu等綜合利用計(jì)算機(jī)模擬與定點(diǎn)基因突變技術(shù)模擬細(xì)胞色素P450酶活性部位的構(gòu)筑，改變抹香鯨肌紅蛋白活性部位的氨基酸排布，成功賦予其羥基化反應(yīng)催化能力，能夠催化吲哚制備靛藍(lán)，建立了催化效率最高的以過氧化氫為氧化劑制備靛藍(lán)的生物系統(tǒng)[22]。但對于如何通過調(diào)控重組蛋白活性部位構(gòu)筑來優(yōu)化其催化性能尚缺乏系統(tǒng)性和規(guī)律性的認(rèn)識，仍需要大量豐富而翔實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來總結(jié)完善。

本研究將在前期研究的基礎(chǔ)上，綜合利用計(jì)算機(jī)模擬與基因定點(diǎn)突變相結(jié)合的方法，以吲哚的羥基化反應(yīng)為模型反應(yīng)，研究肌紅蛋白活性部位64、107位置的氨基酸(大小、疏水性等)對肌紅蛋白催化性能的影響，通過系統(tǒng)分析不同突變體活性部位構(gòu)筑與其催化性能之間的聯(lián)系，深入揭示血紅素蛋白的構(gòu)效關(guān)系，為新型生物催化劑的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器設(shè)備 Nanodrop 2000(美國Thermo)、搖床(上海知楚)、CR21GⅢ高速冷凍離心機(jī)(日本日立)、TProfessional PCR儀(德國Biometra)、蛋白純化儀AaktaP900(德國GE Health Care)、Shimadzu 1800紫外-可見光光譜儀(日本島津)、VCF-1500超聲破碎儀(美國SONICS)、DYY-8C電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

試劑 H64D/V68I/I107A、H64D/V68I/I107V質(zhì)粒由日本名古屋大學(xué)Yoshihito Watanabe教授惠贈，Quick site-directed mutant kit 購自于安捷倫，Pst I酶、JM109感受態(tài)細(xì)胞購自于Takara，DNaseⅠ、溶菌酶、氨芐青霉素購自于索萊寶，DTT、吲哚、吡啶、連二亞硫酸鈉購自于阿拉丁試劑有限公司，酵母粉、胰蛋白胨購自O(shè)XOID；氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸氫二鉀、氫氧化鈉、硫酸銨、乙二胺四乙酸二鈉、鐵氰化鉀等常規(guī)試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，配置試劑所用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 定點(diǎn)突變 將質(zhì)粒溶解，用Nanodrop測定質(zhì)粒濃度，經(jīng)Pst I酶切，1%瓊脂糖電泳檢測質(zhì)粒純度。用Site-Directed Mutagenesis Kit突變試劑盒進(jìn)行定點(diǎn)基因突變，引物為I68V F：TGGTGTTACCgtgTTAACTGCCCTAG，R: GAAGACTTCTAGACTTTT TTCT, A107G F: TAGGACCTTAAGccgAGACTTCG，R:GATCATCCATGTTCTGCATTC。PCR(95 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s變性， 60 ℃ 10 s退火， 68 ℃ 1.5 min延伸，68 ℃ 5 min)反應(yīng)。在I68V引物的作用下，將H64D/V68I/I107A和H64D/V68I/I107V突變?yōu)镠64D/I107A和H64D/I107V。加入適量限制性內(nèi)切酶Dpn I酶降解掉不含突變序列的甲基化模板，結(jié)束后，4 ℃儲存突變質(zhì)粒。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化 將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化完成后取少量菌液涂平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng) 從平板上挑取光滑單菌落，置于3～5 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)6 h，取部分菌液測序，剩下菌液轉(zhuǎn)移至100 mL LB培養(yǎng)基，最后擴(kuò)大至10 L LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)，在對數(shù)生長末期離心菌液(4 ℃，8 000 r/min，10 min)，-80 ℃冷凍備用[23]。1.2.4 蛋白純化 取適量菌體溶于50 mmol/L pH=8.0 Tris-HCl (含1 mmol/L EDTA-2Na，0.6 mmol/L DTT，1 g/L溶菌酶)中，加入2 000 U DNase I并攪拌30 min，超聲破碎(60 Hz，4～6次，每次30 s)，4 ℃，15 000 r/min離心30 min，上清液用50%、90%硫酸銨分級沉淀(4 ℃，15 000 r/min，30 min)，離心將沉淀復(fù)溶于適量10 mmol/L pH=6.0 KPi，徹夜透析，先后用陽離子交換柱(HiprepTMCM FF 16/60)(流速：5 mL/min，10 mmol/L pH=6.0 KPi與40 mmol/L pH=9.0 KPi梯度洗脫)與分子凝膠排阻層析柱(流速：1 mL/min，50 mmol/L pH=7.0 Kpi，HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 HR)對樣品進(jìn)行純化，用SDS-PAGE(12%分離膠，5%濃縮膠)檢測蛋白純度，利用吡啶血色原光吸收測定法[24-25]測定蛋白濃度。所獲樣品-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 催化性能測定 催化反應(yīng)體系為1 mL 50 mmol/L pH=7.0 KPi(含0.5 μmol/L Mb，0.5～3 mmol/L吲哚)，反應(yīng)體系37 ℃預(yù)熱10 min，加入H2O2(終濃度0.1 mmol/L)啟動反應(yīng)，670 nm下檢測產(chǎn)物靛藍(lán)的生成。根據(jù)Michaelis-Menten方程計(jì)算催化反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)kcat和Km。

1.2.6 計(jì)算機(jī)模擬 利用分子模擬軟件PYMOL基于F43W/H64D/V68I Mb(PDB code：2E2Y)預(yù)測肌紅蛋白H64D/I107V、H64D/I107A和H64D/I107G等變體的結(jié)構(gòu)，利用分子對接軟件AutoDockVina[26]對肌紅蛋白與底物吲哚開展仿真對接實(shí)驗(yàn)，將蛋白活性部位的Leu29、Leu32、Phe33、Phe43、Phe46、Asp64、Val68、Leu69、Ile111設(shè)為柔性氨基酸。小分子的吲哚的結(jié)構(gòu)由Dundee Prodrg Server生成。利用AutoDockVina的自由能打分函數(shù)對計(jì)算模擬結(jié)果進(jìn)行排序，通過PYMOL對AutoDockVina對接得到的復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析，探討蛋白活性部位空間構(gòu)筑變化對底物結(jié)合的影響，進(jìn)而為肌紅蛋白活性部位空間構(gòu)筑與催化性能之間的聯(lián)系提供理論依據(jù)。

2 結(jié)果

菌液測序結(jié)果表明，H64D/V68I/I107A與H64D/V68I/I107V在I68V的引物下，64位氨基酸密碼子由ATC(I)變?yōu)镚TG(V)，69位氨基酸密碼子由CTA(L)變?yōu)門TA(L)，表明其成功地被突變成了H64D/I107A和H64D/I107V。H64D/I107A在A107G引物的作用下，107位氨基酸密碼子由GCG(A)突變?yōu)榱薌GC(G)，表明突變成了H64D/I107G。上述數(shù)據(jù)表明基因突變成功，獲得H64D/I107A、H64D/I107V和H64D/I107G 3個(gè)突變體。

純化后蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，3種突變體在17 kDa附近均呈現(xiàn)清晰的單一條帶，而目的蛋白分子量為16.7 kDa，表明3種蛋白均純化成功。利用朗博-比爾定律計(jì)算蛋白濃度，得出H64D/I107A為8.34 μmol/L，H64D/I107G為9.59 μmol/L，H64D/I107V為21.05 μmol/L。

(Marker為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，H64D/I107V，H64D/I107G和H64D/I107A為3種肌紅蛋白突變體。Marker is the protein molecular weight marker, H64D/I107V, H64D/I107G and H64D/I107A are three Mb mutants.)

圖2 肌紅蛋白電泳圖

Fig.2 The electrophorogram of Mb

在670 nm(靛藍(lán)的最大吸收波長)監(jiān)測靛藍(lán)的生成。圖3為肌紅蛋白H64D/I107G突變體在過氧化氫存在下催化吲哚形成靛藍(lán)的催化曲線，由圖3可知，隨著時(shí)間的推移，靛藍(lán)的生成量逐漸增多，且隨著吲哚濃度的增加，生成靛藍(lán)的量也隨之增多。

肌紅蛋白催化吲哚的催化速率曲線如圖4所示，由圖4可知，3種肌紅蛋白突變體的表觀速率常數(shù)值的大小次序?yàn)镠64D/I107G > H64D/I107A > H64D/I107V。相應(yīng)的催化動力學(xué)參數(shù)如表1所示，H64D/I107V、H64D/I107A和H64D/I107G 三種突變體對吲哚羥基化反應(yīng)的kcat分別為10.6、9.2和25.2 min-1。

注：nd：未檢測到Not detected。

吲哚在肌紅蛋白活性部位的模擬構(gòu)象如圖5所示，底物吲哚均能進(jìn)入H64D/I107V、H64D/I107A及H64D/I107G三種變體的活性部位。由于甘氨酸的空間位阻最小，相對于H64D/I107V與H64D/I107A變體，底物分子能夠更深入的進(jìn)入H64D/I107G變體的活性部位。底物吲哚在H64D/I107V與H64D/I107A變體活性部位中的位置基本類似，為苯環(huán)在內(nèi)，五元環(huán)在外構(gòu)象，吲哚C3環(huán)Fe與距離分別為7.4 ?和7.6 ?。而底物吲哚在H64D/I107G變體中的構(gòu)象與其他2種變體顯著不同，為苯環(huán)在外，五元環(huán)在內(nèi)的構(gòu)象，吲哚C3顯Fe距離為4.9 ?。

3 討論

野生型肌紅蛋白并無催化功能，H64D變體對吲哚羥基化反應(yīng)具有一定的催化性能(kcat=4.8 min-1)，表明將64位置的氨基酸由組氨酸突變?yōu)樘於彼岷?，能夠有效產(chǎn)生反應(yīng)中間體，從而提升其羥基化反應(yīng)催化能力[22]。H64D/I107V與H64D/I107A突變體對吲哚羥基化反應(yīng)的kcat分別為10.6和9.2 min-1，分別為H64D變體的2.2與1.91倍，表明將活性部位107位置的異亮氨酸突變?yōu)轶w積較小的丙氨酸與纈氨酸能夠有效提升蛋白的催化性能。當(dāng)將107位置的異亮氨酸突變?yōu)轶w積更小的甘氨酸時(shí)，H64D/107G變體對吲哚羥基化反應(yīng)的kcat為25.2 min-1，為H64D變體催化性能的5.25倍，表明107位置的氨基酸體積能夠顯著影響蛋白的催化性能，隨著107位置氨基酸體積的減少，肌紅蛋白的催化性能提升，原因?yàn)榈鞍谆钚圆课豢诖鼉?nèi)部空間的釋放能夠使底物更易接近活性中心，有利于催化反應(yīng)的進(jìn)行。但H64D/I107V與H64D/I107A突變體對吲哚羥基化反應(yīng)的催化性能仍低于H64D/V68I/I107V及H64D/V68I/I107A變體，表明68位置氨基的疏水性大小能夠顯著影響蛋白的催化性能，68位置的氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸降低了蛋白的催化性能。

((A)H64D/I107V，(B)H64D/I107A，(C)H64D/I107G；(a)側(cè)視圖，(b)俯視圖；吲哚(青色)，血紅素(紅色)及關(guān)鍵氨基酸(綠色)以棍棒模型展示。(A) H64D/I107V, (B) H64D/I107A, (C) H64D/I107G; (a) side view, (b) top view; Indole (cyan), heme (red), and the key amino acid residues (green) are shown as stick models.)

圖5 吲哚在肌紅蛋白突變體活性活性部位的模擬構(gòu)象

Fig.5 The docking simulation of indole into the active sites of Mb mutants

P450cam中底物d-camphor與血紅素中心Fe的距離為4.2 ?[27]，相對于H64D/I107V(7.4 ?)與H64D/I107A(7.6 ?)變體而言，H64D/I107G變體中C3中Fe距離(4.9 ?)更適宜于羥基化反應(yīng)的進(jìn)行，因此H64D/I107G表現(xiàn)出相對優(yōu)異的羥基化反應(yīng)催化能力。在H64D/V68I/I107V與H64D/V68I/I107A變體中，吲哚C3中Fe與距離分別為4.1 ?和4.2 ?，因此這2種變體具有更為優(yōu)異的羥基化反應(yīng)催化能力。表明活性部位68位置的氨基酸能夠有效調(diào)控底物在活性部位的空間構(gòu)象，而疏水性對蛋白的催化性能具有顯著影響。

4 結(jié)語

本研究通過基因定點(diǎn)突變技術(shù)，重點(diǎn)研究了抹香鯨肌紅蛋白68、107位置的氨基酸對其羥基化反應(yīng)催化性能的影響。研究結(jié)果表明，H64D/I107V、H64D/I107A和H64D/I107G對于吲哚羥基化反應(yīng)均有較好的催化能力。計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果表明，肌紅蛋白活性部位107位置氨基酸的空間位阻效應(yīng)及68位置氨基酸的疏水性能夠顯著影響底物在蛋白活性部位的空間構(gòu)象，進(jìn)而影響其催化性能。本研究為探討肌紅蛋白活性部位氨基酸排布對其催化性能的影響，闡明肌紅蛋白變體結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，進(jìn)一步揭示血紅素蛋白的構(gòu)效關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯 朱寶象

Constructing Novel Biocatalysts Basing on Myoglobin

ZHANG Fang-Fang1,2, XU Jia-Kun2, WANG Fang2, GUO Hui1, LIANG Xing-Guo1

(1.College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.The Key Laboratory of Sustainable Development, Marine Fisheries of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)

Comprehensively utilizing the methods of computer simulation and genetic engineering, we designed the active site of the sperm whale Mb. The influence of the amino acids at 68 and 107 positions on the catalytic ability was studied in detail. Three Mb mutants H64D/I107V, H64D/I107A and H64D/I107G were designed, prepared, expressed and purified. The hydroxylation catalytic ability of these three mutants was measured using indole as a substrate. Thekcatvalue of these three mutants against hydroxylation reaction was 10.6 min-1, 9.2 min-1, and 25.2 min-1, respectively. The computer simulation results indicated that the stereo-hindrance effect of the amino acid at 107 position and the hydrophobic property of the amino acid at 68 position can influence the location of indole in the active site, and thus affect the catalytic performance of the protein.

biocatalyst; myoglobin；site-directed mutagenesis；catalytic performance；computer simulation

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31200642)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014GHY115029)；青島市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(14-2-4-91-jch)；青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2015ASKJ02)；黃海水產(chǎn)研究所級基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(20603022016011)資助

2016-03-08；

2016-05-03

張芳芳 (1990-)，女，碩士生。E-mail: fangfang_zhang1990@163.com

** 通訊作者：E-mail: xujk@ysfri.ac.cn

Q814.9； S917

A

1672-5174(2017)04-046-06

10.16441/j.cnki.hdxb.20160059

張芳芳， 徐甲坤， 王芳， 等. 基于肌紅蛋白構(gòu)筑新型生物催化劑[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 47(4): 46-51.

ZHANG Fang-Fang, XU Jia-Kun, WANG Fang, et al. Constructing novel biocatalysts basing on myoglobin [J].Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(4): 46-51.

Supported by the National Natural Science Foundation of China (31200642); Science and Technology Development Plan of Shandong Province (2014GHY115029); Qingdao Scientific and Technological Achievements Transformation Program (14-2-4-91-jch); The Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02); Special Scientific Research Funds for Central Non-profit Institutes, Yellow Sea Fisheries Research Institute(20603022016011)