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    溫度和鹽度對櫛江珧受精卵孵化及早期幼蟲生長與存活的影響*

    2017-01-12 10:59:52李浩浩于瑞海楊智鵬
    關(guān)鍵詞:孵化率貝類鹽度

    李浩浩, 于瑞海, 楊智鵬, 李 琪

    (中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266003)

    技術(shù)報告

    溫度和鹽度對櫛江珧受精卵孵化及早期幼蟲生長與存活的影響*

    李浩浩, 于瑞海, 楊智鵬, 李 琪**

    (中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266003)

    室內(nèi)條件下,通過單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計方法,研究了溫度(18、22、26、30、34℃)和鹽度(15、20、25、30、35)對櫛江珧(Atrinapectinata)受精卵孵化及早期幼蟲生長與存活的影響。研究表明:櫛江珧受精卵的適宜孵化溫度為22~30℃,最適溫度為26℃(孵化率為73%);適宜孵化鹽度為25~30,最適鹽度為30(孵化率為70%)。櫛江珧早期幼蟲生長的適宜溫度為22~30℃,最適溫度為26℃(殼長日生長率為4.7μm/d,存活率為50%(7d));適宜鹽度為20~30,最適鹽度為25(殼長日生長率為4.5μm/d,存活率為55%(7d))。研究結(jié)果表明:櫛江珧受精卵孵化的適宜溫、鹽條件為溫度22~30℃,鹽度25~30;早期幼蟲生長發(fā)育的適宜溫、鹽條件為溫度22~30℃,鹽度20~30。本研究為櫛江珧人工育苗提供了重要的基礎(chǔ)資料。

    櫛江珧;溫度;鹽度;受精卵;幼蟲;生長發(fā)育

    櫛江珧(Atrinapectinata)俗稱“大海紅”,屬于軟體動物門(Mollusca)瓣鰓綱(Lamellibranchia)[1],在中國、日本和朝鮮半島沿海均有分布。櫛江珧閉殼肌肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美,深受國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛[1]。近年來,隨著環(huán)境污染的加重和捕撈強(qiáng)度的加大,櫛江珧野生資源總量急劇減少,產(chǎn)量難以滿足市場消費(fèi)需求[2-3],因此,開展櫛江珧的苗種繁育研究對其種質(zhì)資源保護(hù)和滿足市場需求具有重要意義。

    溫度和鹽度環(huán)境因子是影響貝類胚胎發(fā)育及幼蟲生長存活的重要因素[4-6]。在海洋生態(tài)系統(tǒng)中,這兩個環(huán)境因子決定了生物的分布和生存,且貝類的生活習(xí)性和地理分布也直接影響其對溫度和鹽度的耐受力[4]。溫度與貝類胚胎發(fā)育及早期幼蟲的生長、發(fā)育、攝食等生命過程密切相關(guān),例如:18℃時薄片鏡蛤(Dosinialaminata)受精卵不能發(fā)育成D型幼蟲,幼蟲在34℃條件下,活力低下,攝食減少,死亡率高[7]。當(dāng)外界環(huán)境鹽度不適宜時,會影響貝類胚胎發(fā)育及早期幼蟲的攝食和代謝,最終導(dǎo)致生長率和存活率的下降[8],例如:鹽度為10、40時,翡翠貽貝(Pernaviridis)受精卵不能發(fā)育至D形幼蟲,其幼蟲在鹽度25時,生長速度最快、存活率最高[9]。在貝類育苗過程中,浮游幼蟲對溫度和鹽度環(huán)境因子比較敏感[4,8]。掌握浮游幼蟲發(fā)育生長的適宜溫度和鹽度,對于提高貝類苗種產(chǎn)量有重要意義。

    國內(nèi)外學(xué)者已開展了櫛江珧的人工育苗和養(yǎng)殖技術(shù)生態(tài)學(xué)等方面的研究[10-12]。郭世茂等培育出一定數(shù)量的苗種,但存在一定的偶然性,人工育苗還不能穩(wěn)定得到櫛江珧的苗種[13]。至今,尚未有關(guān)于環(huán)境因子對櫛江珧幼蟲生長發(fā)育影響方面的研究報道。因此,本實(shí)驗(yàn)研究不同溫度和鹽度對櫛江珧受精卵孵化及早期幼蟲生長與存活的影響,獲得櫛江珧受精卵孵化及早期幼蟲生長的適宜溫度和鹽度,將為櫛江珧的人工育苗提供重要的基礎(chǔ)資料。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物

    實(shí)驗(yàn)用櫛江珧親貝為2015年4月采自日照海區(qū)的2~4齡貝。

    1.2 受精卵的孵化

    親貝在室內(nèi)暫養(yǎng)促熟,待其成熟后,挑選發(fā)育良好的親貝,鏡檢選擇精卵成熟度高的個體解剖獲得精卵。將卵液用200目篩絹濾去較大組織塊后,再用400目篩絹去除組織液和微小雜質(zhì),用濃度為0.008%~0.014%氨海水泡卵40~60min;精液用300目篩絹過濾,收集。檢查精卵狀態(tài),人工授精,受精后計算受精率(受精率=卵裂的細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%)。取部分受精卵作為孵化期的試驗(yàn)材料;余下的受精卵在70L水桶里孵化,孵化后選取活力較好的D形幼蟲,用于早期幼蟲的溫度和鹽度實(shí)驗(yàn)。

    1.3 溫度實(shí)驗(yàn)

    溫度實(shí)驗(yàn)梯度設(shè)置為18、22、26、30和34℃。試驗(yàn)在2L塑料燒杯中進(jìn)行,采用加熱管及冰袋進(jìn)行控溫,溫度精度控制在±0.5℃,各溫度組均設(shè)3個重復(fù)。櫛江珧受精卵孵化的海水鹽度為30(預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,受精卵的孵化鹽度為30較好),孵化密度為30~50個/mL,測定各組孵化率和孵化時間。培育浮游幼蟲的海水鹽度為25(預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,幼蟲的生長發(fā)育鹽度25較好),幼蟲培育密度為5~10個/mL,每天半量換等溫海水,投餌量為1萬~3萬個/mL,用金藻(Chrysophyta)和小球藻(Chlorella)(體積比為1∶1)混合投喂,分3次投喂。每2天取樣1次,測定并計算各組幼蟲的生長和存活率。

    1.4 鹽度實(shí)驗(yàn)

    鹽度實(shí)驗(yàn)梯度設(shè)置為15、20、25、30和35。試驗(yàn)在2L塑料燒杯中進(jìn)行,通過向海水中加淡水和添加人工海水晶控制各組鹽度,用手持鹽度折射儀(日本ATAGO公司)測定鹽度,各鹽度組均設(shè)3個重復(fù)。櫛江珧受精卵孵化的海水溫度為26℃(預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,受精卵的孵化溫度為26℃較好),孵化密度為30~50個/mL,測定各組孵化率和孵化時間。培育浮游幼蟲的海水溫度為26℃(預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,幼蟲的生長發(fā)育溫度為26℃較好),幼蟲培育密度為5~10個/mL,每天半量換等鹽度海水,投餌量為1萬~3萬個/mL,用金藻和小球藻(體積比為1∶1)混合投喂,分3次投喂。每2 d取樣1次,測定并計算各組幼蟲的生長和存活率。

    1.5 數(shù)據(jù)處理

    幼蟲的殼長、殼高在目微鏡下測量,每次每組隨機(jī)測量30個個體。所有的統(tǒng)計分析均使用軟件SPSS19.0進(jìn)行,用單因素方差分析(ANOVA,Duncan)進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn),以P<0.05作為差異顯著水平。

    孵化率=D形幼蟲數(shù)/受精卵數(shù)×100%;

    孵化時間=90%幼蟲到達(dá)D形幼蟲所用的時間;

    幼蟲存活率=浮游幼蟲數(shù)/試驗(yàn)開始時幼蟲總數(shù)×100%;

    殼頂幼蟲率=殼頂幼蟲數(shù)/幼蟲總數(shù)×100%。

    2 結(jié)果

    2.1 溫度對櫛江珧受精卵孵化的影響

    在18~34℃溫度范圍內(nèi),櫛江珧受精卵的孵化率隨著溫度的升高先升高后降低。26℃組的孵化率最高(73%),略高于22℃(67%)組,顯著高于18(0)、30(62%)和34℃(0)組(P<0.05)(見圖1A);18和34℃組的畸形胚胎較多,受精卵無法發(fā)育至D形幼蟲,溫度為22、26、30℃組可以得到D形幼蟲,櫛江珧受精卵的孵化時間在22~30℃溫度范圍內(nèi),隨著溫度的升高而降低,30℃組孵化時間最短(19h),略低于26℃組,顯著低于22℃組(P<0.05)(見圖1B)。故櫛江珧受精卵的適宜孵化溫度為22~30℃,最適溫度為26℃(見圖1)。

    (A:溫度對孵化率的影響;B:溫度對孵化時間的影響。標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。A: The hatching rates at different temperature; B: The hatching time at different temperature.Means with the same symbol are not significantly different (P>0.05).)

    圖1 溫度對櫛江珧受精卵孵化的影響

    Fig.1 Effects of temperature on the hatching ofA.pectinatazygotes

    2.2 溫度對櫛江珧早期幼蟲生長和存活的影響

    溫度對櫛江珧浮游幼蟲殼長、殼高生長的影響趨勢基本相同。18和34℃組幼蟲無法發(fā)育至殼頂幼蟲時期,殼長、殼高基本無生長(見圖2,A、B和D);22、26、30℃條件下幼蟲的生長較好,幼蟲發(fā)育至第7天時,殼長×殼高分別為113μm×102μm、118μm×110μm、123μm×116μm,30℃組幼蟲的殼長和殼高均為各組最大,略高于26℃組,顯著大于22℃組(P<0.05),且殼長和殼高日增長速度也最大,為5.2和7.6μm/d(見圖2,A和B);第7天時,30℃組殼頂幼蟲率為84%,高于26℃組,顯著大于22℃組(P<0.05)(見圖2D)。

    溫度對櫛江珧早期幼蟲的存活有顯著影響。18和34℃組出現(xiàn)幼蟲活力下降、下沉等現(xiàn)象,存活率大幅度降低,幼蟲在第5天已全部死亡,顯著低于其他各組(P<0.05)(見圖2C);幼蟲發(fā)育至第7天時,22~30℃各組均有較高的存活率,26℃組存活率最高(50%),顯著高于22(40%)和30℃(31%)(P<0.05)組(見圖2C)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,櫛江珧早期幼蟲生長的適宜溫度為22~30℃,最適溫度為26℃。

    (A:溫度對幼蟲殼長的影響;B:溫度對幼蟲殼高的影響;C:溫度對幼蟲存活的影響;D:溫度對幼蟲殼頂率的影響(7 d)。標(biāo)有相同小寫字母表示組間無顯著性差異(P>0.05)。A: The mean shell length at different temperature; B: The mean shell hight at different temperature; C: The survival rate at different temperature; D: The umbo larvae rate at different temperature(7 d). Means with the same symbol are not significantly different (P>0.05).)

    圖2 溫度對櫛江珧早期幼蟲生長與存活的影響

    Fig.2 Effects of temperature on the growth and survival of the early larvae ofA.pectinata

    2.3 鹽度對櫛江珧受精卵孵化的影響

    在溫度26℃的條件下,在15~35鹽度范圍內(nèi),櫛江珧受精卵的孵化率隨著鹽度的升高先升高后降低,30鹽度組的孵化率最高(70%),顯著高于15(0)、20(23%)、25(52%)和35(0)鹽度組(P<0.05)(見圖3A);15和35鹽度組的畸形胚胎較多,受精卵無法發(fā)育至D形幼蟲,鹽度為20、25、30鹽度組可以得到D形幼蟲,櫛江珧受精卵的孵化時間在20、25、30鹽度組之間沒有差異(見圖3B)。故櫛江珧受精卵的適宜孵化鹽度為25~30,最適鹽度為30(見圖3)。

    2.4 鹽度對櫛江珧早期幼蟲生長與存活的影響

    鹽度對櫛江珧早期幼蟲的生長影響顯著,低鹽、高鹽都會抑制幼蟲的生長和發(fā)育。15和35鹽度組幼蟲無法發(fā)育至殼頂幼蟲時期,殼長、殼高基本無生長(見圖4,A、B和D);20、25、30鹽度條件下幼蟲的生長較好,幼蟲發(fā)育至第7天時,殼長×殼高分別為109μm×99μm、117μm×112μm、102μm×84μm,25鹽度組幼蟲的殼長和殼高均為各組最大,顯著大于20和30鹽度組(P<0.05),且殼長和殼高日增長速度也最大,為4.5和7.1μm/d(見圖2A和B);第7天時,25鹽度組殼頂幼蟲率為78%,高于20鹽度組,顯著大于30鹽度組(P<0.05)(見圖4D)。

    (A:鹽度對孵化率的影響;B:鹽度對孵化時間的影響,標(biāo)有相同小寫字母表示組間無顯著性差異(P>0.05)。A: The hatching rates at different salinities; B: The hatching time at different salinities. Means with the same symbol are not significantly different (P>0.05). )

    圖3 鹽度對櫛江珧受精卵孵化的影響

    Fig.3 Effects of salinity on the hatching ofA.pectinatazygotes

    鹽度對對櫛江珧早期幼蟲的生長有顯著性影響。15和35鹽度組出現(xiàn)幼蟲活力下降、下沉等現(xiàn)象,存活率大幅度降低,幼蟲在第7天已全部死亡,顯著低于其他各組(P<0.05)(見圖2C);幼蟲發(fā)育至第7天時,20~30鹽度組均有較高的存活率,25鹽度組存活率最高(55%),略高于20(54%)鹽度組,顯著大于30(21%)鹽度組(P<0.05)(見圖2C)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,櫛江珧早期幼蟲生長的適宜鹽度為20~30,最適鹽度為25。

    (A:鹽度對幼蟲殼長的影響;B:鹽度對幼蟲殼高的影響;C:鹽度對幼蟲存活的影響;D:鹽度對幼蟲殼頂率的影響(7d),標(biāo)有相同小寫字母表示組間無顯著性差異(P>0.05)。A: The mean shell length at different salinities; B: The mean shell hight at different salinities; C: The survival rate at different salinities; D: The umbo larvae rate at different salinities(7 d). Means with the same symbol are not significantly different (P>0.05).)

    圖4 鹽度對櫛江珧早期幼蟲生長與存活的影響

    Fig.4 Effects of salinity on the growth and survival of the early larvae ofA.pectinata

    3 討論

    溫度對貝類受精卵的孵化有顯著影響,低溫和高溫均會影響受精卵的孵化及幼蟲生長發(fā)育[14]。例如,溫度為15℃時,毛蚶(Scapharcasubcrenata)受精卵不能發(fā)育至D形幼蟲,溫度為35℃時,毛蚶受精卵孵化率顯著減少[15]。本試驗(yàn)中,18和34℃組的畸形胚胎較多,受精卵無法發(fā)育至D形幼蟲,溫度為22、26、30℃組可以得到D形幼蟲,符合上述規(guī)律,且櫛江珧受精卵的孵化時間在22~30℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高而減少,與青蛤(Cyclinasinensis)[16]、脈紅螺(Rapanavenosa)[17]等貝類一致,這可能是由于在高溫條件下酶的活力更高,從而使幼蟲發(fā)育速度得到加快[4]。因此,櫛江珧的適宜孵化溫度為22~30℃,最適溫度為26℃,孵化的適溫范圍與毛蚶[15]相似,高于海灣扇貝(Argopectenirradias)[18],說明櫛江珧胚胎對高溫的適應(yīng)性較強(qiáng),這和櫛江珧夏季(6~7月)繁殖的習(xí)性相一致。

    貝類幼蟲的生長與存活和溫度關(guān)系密切,生物體一般有其自身的溫度耐受范圍,溫度過低或過高時都會造成貝類幼蟲生長緩慢,存活率低[4,19]。例如,青蛤幼蟲10℃條件下,游動緩慢,生長發(fā)育停止;在34℃條件下,幼蟲畸形,死亡率高[16]。本實(shí)驗(yàn)中,18和34℃組幼蟲死亡率高,無法發(fā)育至殼頂幼蟲時期,且殼長、殼高基本無生長,是由于攝食減少,生長發(fā)育畸形造成的,也說明了櫛江珧幼蟲在溫度小于18℃或大于34℃條件下,是無法生存的。在貝類苗種繁育過程中,在一定溫度范圍內(nèi),提高幼蟲培育水溫可以促進(jìn)幼蟲的生長和發(fā)育,但當(dāng)水溫升高到一定程度時,幼蟲的存活率會顯著降低[4]。例如,青蛤幼蟲在22~30℃范圍內(nèi),隨著水溫升高,其幼蟲生長發(fā)育加快,但溫度為34℃時,其存活率顯著降低[16]。本實(shí)驗(yàn)中,櫛江珧幼蟲在22~30℃范圍內(nèi),30℃組的第7日的殼長、殼高及殼頂幼蟲率均大于22和26℃組,而其存活率低于其他區(qū)2組。因此,櫛江珧早期幼蟲生長與存活的適宜溫度為22~30℃,最適溫度為26℃,適宜溫度范圍與薄片鏡蛤[7]和毛蚶[15]相近,但高于櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[20],說明櫛江珧幼蟲對高溫的適應(yīng)性較強(qiáng),這和櫛江珧的繁殖習(xí)性有關(guān)。

    近年來,鹽度對貝類受精卵孵化的影響已有較多報道,國內(nèi)外學(xué)者研究了鹽度對薄片鏡蛤[7]、青蛤[17]、櫛孔扇貝[20]和牡蠣(Crassostreagigas)[21-22]等受精卵孵化的影響,發(fā)現(xiàn)鹽度對貝類受精卵孵化影響顯著,海水滲透壓的改變超出受精卵的調(diào)節(jié)能力,胚胎發(fā)育終止。例如:鹽度為5、45時,青蛤受精卵不能發(fā)育至D形幼蟲[16]。本試驗(yàn)中,15和35鹽度組的畸形胚胎較多,櫛江珧受精卵無法發(fā)育至D形幼蟲,鹽度為20、25、30鹽度組可以得到D形幼蟲,受精卵的孵化時間在20、25、30鹽度組之間沒有差異,與牡蠣、翡翠貽貝等貝類一致[9,21]。故櫛江珧的適宜孵化鹽度為25~30,最適鹽度為30。這比毛蚶的胚胎發(fā)育適宜鹽度范圍要窄[15],和大獺蛤胚胎發(fā)育適宜鹽度范圍相近[23],說明櫛江珧胚胎對低鹽的適應(yīng)性較強(qiáng),這可能與櫛江珧夏季(6—7月)(多雨)繁殖的習(xí)性有關(guān)。

    鹽度對貝類幼蟲生長和發(fā)育的研究已廣泛開展[4]。研究發(fā)現(xiàn)不適宜的鹽度會降低海洋貝類幼蟲對不良環(huán)境的抵抗能力和對食物的消化吸收效率,鹽度過高或過低都會造成貝類幼蟲生長緩慢、存活率降低[4,24]。例如,翡翠貽貝幼蟲鹽度為10的條件下,幼蟲有明顯的低滲反應(yīng),游動異常,不久沉底死亡;鹽度為40的條件下,幼蟲生長存活率較低。本試驗(yàn)中,15和35鹽度組幼蟲無法發(fā)育至殼頂幼蟲時期,殼長、殼高基本無生長,可能是因?yàn)楹K疂B透壓的改變超出了其自身的調(diào)節(jié)能力,導(dǎo)致幼蟲死亡[7]。櫛江珧幼蟲在鹽度20~30范圍內(nèi),25鹽度組的第7日的殼長、殼高及殼頂幼蟲率均大于20和30鹽度組,且其存活率高于其他2組。因此,櫛江珧幼蟲生長的適宜鹽度為20~30,最適鹽度為25,與青蛤幼蟲生長的適宜鹽度范圍相比要窄[17],和薄片鏡蛤的適鹽范圍相近[7],且幼蟲對低鹽的適應(yīng)能力強(qiáng)于高鹽條件,這與櫛江珧的繁殖習(xí)性有關(guān),夏季雨水較多,也是櫛江珧在長期進(jìn)化過程中對生活環(huán)境的一種適應(yīng)。

    綜上所述,在貝類育苗過程中,浮游幼蟲對溫度和鹽度環(huán)境因子比較敏感,掌握浮游幼蟲生存適宜的溫度和鹽度十分必要[4]。本實(shí)驗(yàn)研究了溫度和鹽度對櫛江珧受精卵孵化及早期幼蟲生長發(fā)育的影響,得出了櫛江珧受精卵孵化及早期幼蟲生長的適宜溫度和鹽度,為櫛江珧幼蟲生活習(xí)性的研究及人工育苗方面提供了重要的基礎(chǔ)資料。

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    責(zé)任編輯 朱寶象

    Effects of Temperature and Salinity on Hatching, Early Larval Growth and Survival of Pen ShellAtrinapectinata

    LI Hao-Hao, YU Rui-Hai, YANG Zhi-Peng, LI Qi

    (The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

    In order to find the suitable conditions of hatching fertilized egg and early larval growth ofAtrinapectinata, the effects of temperature (18, 22, 26, 30 and 34 ℃) and salinity (15, 20, 25, 30 and 35) on hatching rate, early larval growth and survival of pen shellAtrinapectinatawere investigated through single factor experiments. The results of temperature treatments showed that temperatures between 22 and 30 ℃ were suitable for the development ofA.pectinatazygotes, and the optimum was 26 ℃. Such temperature range was also suitable for the growth of planktonic larvae ofA.pectinata, and the optimal was 26 ℃. The results of temperature treatments indicated that the embryo and early larvae ofA.Pectinatainclined to the environment of high temperature, which was consistent with the summer (high temperature) reproductive life habits ofA.Pectinata. The results of salinity treatments demonstrated that salinity range from 25 to 30 was suitable for the development ofA.pectinatazygotes, and the optimum was 30. The salinities varying between 20 and 30 are suitable for the growth of planktonic larvae ofA.pectinata, and the optimal was 25. The results of salinity treatments suggested that the embryo and early larvae ofA.Pectinatafavored low salinity, which was consistent with the summer (rainy) reproductive life habits ofA.Pectinata. This study obtained the suitable conditions of hatching the fertilized eggs (temperature 22~30 ℃, salinity 25~30) and early larval growth (temperature 22~30 ℃, salinity 20~30), which will provide useful information for the artificial breeding ofA.pectinata.

    Atrinapectinata; temperature; salinity; zygote; larvae; growth and development

    國家十二五科技支撐計劃項(xiàng)目(2011BAD13B01);國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201305005);山東省科技發(fā)展計劃項(xiàng)目(2014GHY115002)資助

    2015-10-14;

    2016-03-15

    李浩浩(1991-),男,碩士生,主要從事貝類遺傳育種研究。E-mail: haohaoli1110@126.com

    ** 通訊作者:E-mail:qili66@ouc.edu.cn

    S968.3

    A

    1672-5174(2017)04-022-06

    10.16441/j.cnki.hdxb.20150351

    李浩浩, 于瑞海, 楊智鵬, 等. 溫度和鹽度對櫛江珧受精卵孵化及早期幼蟲生長與存活的影響[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2017, 47(4): 22-27.

    LI Hao-Hao, YU Rui-Hai, YANG Zhi-Peng, et al. Effects of temperature and salinity on hatching, early larval growth and survival of pen shellAtrinapectinata[J].Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(4): 22-27.

    Supported by This work was supported by Scientific and Technical Supporting Program (2011BAD13B01), National Marine Public Welfare Research Program(201305005), Science and Technology Development Program of Shandong Province (2014GHY115002)

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