鼠衰老模型的建模方法概述*

孫 凱 蔣偉文

·綜述·

鼠衰老模型的建模方法概述*

孫 凱 蔣偉文

鼠衰老模型可分為自然衰老模型和人工衰老模型兩類(lèi)。本文通過(guò)回顧鼠自然衰老模型、D-半乳糖致衰老模型、β淀粉樣蛋白注射致衰老模型、快速老化小鼠模型、γ射線照射致衰老模型、臭氧損傷致衰老模型、去除胸腺致衰老模型和轉(zhuǎn)基因致衰老模型等方法，詳細(xì)闡述了各方法的原理、建模方法、評(píng)價(jià)指標(biāo)和優(yōu)缺點(diǎn)，為不同目的的研究提供了參考依據(jù)，為口腔黏膜衰老模型的建立提供借鑒。

鼠衰老模型；評(píng)價(jià)指標(biāo)；優(yōu)缺點(diǎn)

衰老又稱(chēng)老化，是指生殖后期發(fā)生的降低機(jī)體健康水平和維持自身內(nèi)穩(wěn)態(tài)能力的退行性改變[1]。衰老是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，隨著年齡的增長(zhǎng)，人易罹患糖尿病、高血脂、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、營(yíng)養(yǎng)不良等全身疾病。同時(shí)，在口腔中則會(huì)發(fā)生上皮萎縮、角化減少、彈性降低、腺體分泌功能降低等表現(xiàn)，易產(chǎn)生感染、口干癥等口腔疾病。目前，針對(duì)全身衰老的研究是國(guó)際研究的熱點(diǎn)，鼠全身衰老模型也已較為成熟，然而，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)針對(duì)口腔黏膜衰老的動(dòng)物模型。本文將對(duì)鼠各種全身衰老模型作一綜述，為口腔黏膜衰老模型的建立提供借鑒。

1.自然衰老鼠模型

自然衰老鼠模型是指將鼠飼養(yǎng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，直至所需的年齡[2]。目前，大鼠和小鼠是最常用的自然衰老模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。建模時(shí)，將1-2月齡小鼠或3-5月齡大鼠飼養(yǎng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，小鼠12-24月齡為老年期，大鼠衰老早期為21-26月齡，衰老晚期為30-32月齡[2]。另外，沙鼠也可建立自然衰老的模型[3]。

自然衰老小鼠的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括抗疲勞能力、常壓耐缺氧能力、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和溶血素水平(降低)，Y迷宮智力測(cè)驗(yàn)及跳臺(tái)智力測(cè)驗(yàn)的錯(cuò)誤反應(yīng)率(升高)。小鼠自然衰老后，抗應(yīng)激能力和免疫功能降低，學(xué)習(xí)記憶功能減退。

理論上，自然衰老鼠模型具有最符合人類(lèi)衰老特點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)，并且可省略給藥或手術(shù)的步驟，避免在此過(guò)程中可能發(fā)生的意外情況，但這一模型存在一些不足：如老年鼠難以得到，其來(lái)源不統(tǒng)一、飼養(yǎng)周期長(zhǎng)、價(jià)格昂貴、健康狀況差，死亡率高，在藥物吸收、代謝、分布上的變異性大。因此，鼠的人工衰老模型被廣泛采用進(jìn)行研究。

2.人工衰老鼠模型

人工衰老鼠模型是指用人為因素致衰老所構(gòu)建的鼠模型[2]，主要方法包括D-半乳糖(D-galactose，D-gal)給藥法、β淀粉樣蛋白(amy loid β-protein, β-AP)注射法、快速老化小鼠(sensecence accelerated mouse,SAM)、γ射線照射法、臭氧損傷法、去除胸腺法和轉(zhuǎn)基因法等。其中，SAM是一種人工衰老的模式動(dòng)物，可用于快速衰老的研究。

2.1 D-gal給藥法 D-gal給藥致鼠衰老的機(jī)制不明，有糖代謝紊亂學(xué)說(shuō)、自由基氧化損傷學(xué)說(shuō)、半乳糖醇中毒學(xué)說(shuō)、羰基毒化衰老學(xué)說(shuō)等。目前可能的一種解釋是當(dāng)D-gal在體內(nèi)可使半乳糖濃度增高，從而增加了不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝的半乳糖醇的濃度，其堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能喪失和代謝紊亂，導(dǎo)致衰老的發(fā)生[3]。

建模時(shí)，首選雄性SD大鼠，亦可選用W istar大鼠或昆明小鼠等[3]。給藥方式包括皮下注射、腹腔注射或口服給藥，考慮到腹腔注射對(duì)肝臟的毒副作用，腹腔注射較少采用[4]。給藥劑量無(wú)統(tǒng)一規(guī)定，一般劑量范圍從50-500mg/kg·d不等，連續(xù)給藥6-8周[5]，徐智等用125mg/kg·d的D-gal劑量皮下注射40天，得到了相當(dāng)于24個(gè)月齡大鼠的模型[6]。崔美芝等用500 mg/kg·d的D-gal腹腔注射雄性W istar大鼠連續(xù)56天，得到了相當(dāng)于20個(gè)月齡大鼠的模型[7]。吳克芬等認(rèn)為采用D-gal 120-125mg/kg·d連續(xù)皮下注射6-8周建立衰老動(dòng)物模型是較為可靠、穩(wěn)定的[4]。王少康等用腹腔注射法對(duì)老鼠連續(xù)給藥56天，水平接近自然衰老鼠[3]。李春海等以700mg/kg·d的劑量給NIH小鼠和W istar大鼠口服D-gal，連續(xù)40天，發(fā)現(xiàn)口服D-gal同樣可以獲得與注射相似的致衰老效應(yīng)[8]。

目前，D-gal給藥致衰老鼠模型應(yīng)用廣泛。Liao等將D-gal在8周齡C57BL/6小鼠的腹腔內(nèi)注射建模，用于雄性生殖系統(tǒng)衰老的研究[9]。Hu等將3月齡SD大鼠皮下注射D-gal建模，在此基礎(chǔ)上采用人參皂苷Rg1局部注射，用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞和造血微環(huán)境的抗衰老研究[10]。Chen等在雄性SD大鼠皮下注射D-gal，從而對(duì)增齡性中樞聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)改變的潛在原因進(jìn)行研究[11]。Gao等在SD大鼠皮下注射D-gal，構(gòu)建阿爾茲海默病的模型，在此基礎(chǔ)上使用紅景天苷，探究阿爾茲海默病可能的發(fā)病機(jī)制[12]。Budni等將4月齡W istar大鼠口服給藥觀察其大腦前額皮質(zhì)和海馬體線粒體呼吸鏈的變化[13]。

D-gal給藥法構(gòu)建的衰老鼠模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括(1)外觀特征：體重(是否下降)、毛色(是否枯黃)、行動(dòng)(是否遲緩)、精神(是否萎靡)；(2)血液、組織生化指標(biāo)：血清、紅細(xì)胞、腦、肝組織中的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、單胺氧化酶 B (monoam ine oxidase B,MAO-B)、脂質(zhì)過(guò)氧化物(lipid perox ide,LPO)(是否增高)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力(是否降低)；腦、心、肝中脂褐素含量；血糖、血清膽固醇；(3)臟器指數(shù)：如胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)；(4)行為學(xué)檢測(cè)：Y型迷宮試驗(yàn)、水迷宮試驗(yàn)、興奮性試驗(yàn)、跳臺(tái)被動(dòng)回避試驗(yàn)等；(4)形態(tài)學(xué)研究：大腦皮層的神經(jīng)病理學(xué)變化；(5)分子生物學(xué)檢測(cè)：內(nèi)耳組織線粒體DNA、端粒酶活性等[5]。

D-gal所致衰老鼠模型具有價(jià)格低廉、結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，成模時(shí)間較自然衰老鼠模型短，但又較臭氧方法時(shí)間長(zhǎng)，需實(shí)驗(yàn)者每天給藥，較為繁瑣，同時(shí)與自然衰老鼠在某些指標(biāo)上仍有一定差異，在應(yīng)用時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.2 β-AP注射法 β-AP是一種阿爾茨海默病的特異性蛋白，與阿爾茨海默病的病理形成過(guò)程密切相關(guān)。有證據(jù)表明，雙側(cè)海馬內(nèi)單次注射β-AP可引起大鼠學(xué)習(xí)記憶功能下降。若在D-gal所致動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，海馬內(nèi)注射β-AP可望成為一種更佳的研究阿爾茨海默病的鼠衰老模型[14]。然而，β-AP注射法所致衰老鼠模型僅適用于對(duì)阿爾茨海默病的研究。

2.3 SAM SAM小鼠在日本東京大學(xué)首次培育成功，目前共有12個(gè)亞系，是一種經(jīng)典的模式動(dòng)物?？焖偎ダ闲∈蟾鱽喯档闹饕卣靼庖吖δ艿拖?、肺部病變、變形骨關(guān)節(jié)病、主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)異常及中膜輕度鈣化、衰老及學(xué)習(xí)記憶能力減退、白內(nèi)障、腦萎縮的學(xué)習(xí)記憶及情感障礙等[15]。M ikulski等利用SAM的P系(SAMP)小鼠發(fā)現(xiàn)了腸炎的發(fā)病與CCL21的缺失和樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫功能缺損有關(guān)[16]，Menghini P等則進(jìn)一步利用SAMP1小鼠研究了結(jié)腸腫瘤與腸炎的關(guān)系[17]。SAMP小鼠與許多人類(lèi)老年性疾病的病理改變相似，同時(shí)，小鼠遺傳信息極為豐富，為衰老的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但其價(jià)格昂貴，存在基因缺陷，來(lái)源不足。實(shí)驗(yàn)者應(yīng)根據(jù)研究具體條件選擇。

2.4 γ射線照射法 γ射線致衰老模型利用γ射線對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的多種自由基來(lái)攻擊生物膜。同時(shí)，輻射也能使氧化酶和非氧化酶活性系統(tǒng)的防御機(jī)制減弱，白細(xì)胞總數(shù)和血紅蛋白明顯降低，從而加速衰老的發(fā)生[2]。

建模時(shí)，可采用10月齡雄性SD大鼠連續(xù)照射γ射線5天，吸收劑量為3.0Gy，即控制輻照面積為25cm×25cm，照源距大鼠的高度為80cm，每次輻射4分53秒。李云等用該方法建模，選用SOD、MDA作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)γ射線照射SD大鼠在照射5天后，SOD顯著下降，MDA顯著上升，等效于采用40mg/kg·d連續(xù)40天頸背部皮下注射D-gal的致衰老效果[18]。γ射線致衰老法簡(jiǎn)便易于掌握，但γ射線具有極強(qiáng)的穿透能力，誤操作對(duì)人體將造成一定的危險(xiǎn)，在一般實(shí)驗(yàn)室難以獲得，同時(shí)，γ射線致衰老模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)也較為有限。

2.5 臭氧損傷法 臭氧作為強(qiáng)氧化劑，在常溫下能與任一種有機(jī)分子作用產(chǎn)生超氧陰離子自由基，使細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化物鏈反應(yīng)，其產(chǎn)物作用于蛋白質(zhì)分子及某些酶，使它們的生物活性受到影響，最終導(dǎo)致細(xì)胞變性死亡，促進(jìn)組織衰老[2]。

建模時(shí)，選用雄性W istar大鼠或NIH小鼠。將鼠放置于1.9mg/m3的臭氧濃度的臭氧柜中生活，每天給水、飼料、換墊料，觀察其活動(dòng)情況。如選用NIH小鼠，則在臭氧柜中生活10-20天[2]。如選用雄性W istar大鼠，則在臭氧柜中生活21天。到達(dá)時(shí)間后，在鼠股動(dòng)脈采血稱(chēng)重后處死，取出胸腺和脾臟，用電子天平稱(chēng)重，計(jì)算相應(yīng)臟器指數(shù)[7]。Gao等運(yùn)用8周齡C57BL/6小鼠，臭氧照射后建模，檢測(cè)了KL蛋白在呼吸道上皮中的表達(dá)，并用于慢性阻塞性肺病的研究[19]。Lim則采用年輕的8周齡無(wú)毛小鼠和18月齡年老的SKH-1無(wú)毛小鼠，經(jīng)臭氧照射后，用于皮膚傷口愈合情況的研究[20]。

臭氧致衰老鼠模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括血清SOD活性、MDA含量、血糖、膽固醇、臟器指數(shù)和耐寒能力[7]。臭氧致衰老模型的優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)單易行，節(jié)約人力，時(shí)間較D-gal致衰老和自然衰老模型短，但需經(jīng)常用臭氧檢測(cè)管測(cè)量臭氧柜內(nèi)的臭氧濃度。

2.6 胸腺摘除法 胸腺是免疫系統(tǒng)的中樞器官，又是免疫細(xì)胞的生成場(chǎng)所。胸腺激素由胸腺上皮產(chǎn)生，其主要功能是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的分化成熟、增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡[21]。當(dāng)胸腺摘除后，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能低下、缺損可加快衰老。

建模時(shí)，將3月齡W istar大鼠麻醉后仰臥固定，沿胸骨正中線縱行切開(kāi)皮膚1.0cm-1.5cm，用眼科鑷子分離皮下組織，再用眼科組織剪從頸部向下沿胸骨正中線縱行剪開(kāi)胸骨至第2肋間，暴露胸腺，小心剝離并取出胸腺，然后立即縫合，并滴加青鏈霉素，繼續(xù)飼養(yǎng)至6月齡[7]。有學(xué)者構(gòu)建了去除胸腺的B6小鼠，研究了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與傳統(tǒng)T細(xì)胞的平衡關(guān)系[22]。Morel等利用胸腺摘除小鼠探索了以基因治療恢復(fù)先天性無(wú)胸腺或胸腺功能低下者內(nèi)分泌功能的可能[23]。Lanzer等運(yùn)用胸腺去除鼠制作衰老模型，研究了其CD4T細(xì)胞的多樣性及其對(duì)流感病毒的反應(yīng)[24]。

胸腺摘除致鼠衰老模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括測(cè)定血清SOD活性、MDA含量、血糖、膽固醇，計(jì)算臟器指數(shù)，觀察耐寒能力等。該方法僅需在大鼠3月齡時(shí)行一次胸腺摘除手術(shù)，后續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)，不需過(guò)多的人力、物力，但初學(xué)者易造成動(dòng)物死亡，反而所需時(shí)間更長(zhǎng)。

2.7 轉(zhuǎn)基因法 APP轉(zhuǎn)基因小鼠、CRH敲除小鼠和Sod2雜合子敲除小鼠可分別用于作為阿爾茨海默病病理作用、糖皮質(zhì)激素作用和氧化應(yīng)力理論研究[2]。

綜上所述，鼠衰老模型是人類(lèi)研究衰老機(jī)制的有效途徑工具。然而，各衰老的老鼠模型有其各自?xún)?yōu)缺點(diǎn)，且所研究側(cè)重點(diǎn)各有不同，研究者應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)、實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)周期和研究目的選擇和構(gòu)建所需要的模型。同時(shí)，經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)，我們并未發(fā)現(xiàn)專(zhuān)門(mén)研究口腔黏膜衰老的鼠模型，所涉及的以上衰老模型也未涵蓋口腔黏膜方面的評(píng)價(jià)指標(biāo)，將來(lái)研究者可以向這一未知領(lǐng)域進(jìn)行探索。

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A review of methods for ageing mouse models

SUN KAI,JIANG Wei-wen
(Department of Oral Mucosal Diseases,Shanghai Ninth People’s Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine·Shanghai Key Laboratory of Stomotology,Shanghai 200011,China)

The aging mouse models could be divided into two categories:natural aging models and artificial aging models. This paper reviewed the aging mouse models established by nature,D-galactose,β-amyloid protein injection,accelerated senescence,γ ray irradiation,ozone,thymectomy and transgene.The principles,methods,indicatorsofevaluation,advantages and disadvantages of each method were elaborated to provide reference for researches w ith different purposes,including the establishment of oral mucosal aging model

Ageing mouse model;indicator of evaluation;advantage and disadvantage

R787

A

1672-2973(2017)03-0181-04

2016-12-01)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(項(xiàng)目編號(hào)：81671036)上海市自然科學(xué)基金資助課題(項(xiàng)目編號(hào)：15ZR1424700)

孫 凱 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔黏膜科·上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 碩士 住院醫(yī)師上海 200011

蔣偉文 通訊作者 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔黏膜科·上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 博士主任醫(yī)師 副研究員 上海 200011