馬鈴薯松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

史滟滪++楊靜慧++劉婷++梁發(fā)輝++劉艷軍

摘 要：為了建立馬鈴薯松散型胚性愈傷組織體系，用于脫毒繁殖和誘變育種，試驗采用馬鈴薯塊莖為外植體，在含有不同濃度2，4-D，BA和MS的培養(yǎng)基上進(jìn)行松軟型、松散型和胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。結(jié)果顯示，在1/4 MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+15 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上可以誘導(dǎo)出松軟型馬鈴薯愈傷組織；在MS+0.5 mg·L-1 BA+0.25 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，繼代3～5次，即可獲得松散型愈傷組織；在MS+1.0 mg·L-1 BA+1.0 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，繼代5～8次，即可獲得松散型胚性愈傷組織。而且上述類型的愈傷組織生長迅速，結(jié)構(gòu)特點突出。

關(guān)鍵詞：激素；培養(yǎng)基；繼代；脫毒培養(yǎng)

中圖分類號：S532 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.12.005

馬鈴薯是一種在我國具有高產(chǎn)量、高效益的適合廣大農(nóng)作物地區(qū)耕作的糧食和經(jīng)濟(jì)作物。近年來，我國廣大地區(qū)對馬鈴薯的栽培與育種方面的研究已取得了較多的突破，尤其是在馬鈴薯的組織培養(yǎng)方面取得了突出的成績[1-4]。馬鈴薯的脫毒培養(yǎng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于馬鈴薯的種薯生產(chǎn)中，使用馬鈴薯脫毒種薯比沒脫毒的一般可增產(chǎn)30%～50%[5-10]。

目前，馬鈴薯脫毒培養(yǎng)主要依賴于莖尖脫毒技術(shù)，而采用松散型胚性愈傷組織進(jìn)行組織脫毒的報道極少。用松散型胚性愈傷組織進(jìn)行脫毒培養(yǎng)的方法可以獲得高效、優(yōu)質(zhì)的無毒材料。

本研究旨在采用這一脫毒新途徑建立馬鈴薯無毒苗培養(yǎng)體系，為生產(chǎn)上獲得優(yōu)質(zhì)無毒的馬鈴薯種源；本研究獲得的松散型胚性愈傷組織還可以用于體細(xì)胞誘變育種研究，可為馬鈴薯的育種拓寬途徑、奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究使用的馬鈴薯是購自天津市蔬菜市場的菜用馬鈴薯品種。

1.2 試驗方法

松軟型愈傷組織的培養(yǎng)方法：將馬鈴薯塊莖外植體接種到1/2，1/4 MS培養(yǎng)基中，其中分別加入0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1的2，4-D，在接種10 d后在外植體傷口部位開始長出愈傷組織，經(jīng)過大約40 d培養(yǎng)選擇生長迅速的、結(jié)構(gòu)松軟的愈傷組織進(jìn)行下一步培養(yǎng)。

松散型愈傷組織的培養(yǎng)方法：將所獲得的馬鈴薯松軟型愈傷組織，轉(zhuǎn)移到含有不同激素的松散型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中分別加入0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1的生長素2，4-D和0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1的細(xì)胞分裂素BA。經(jīng)過3～5次繼代培養(yǎng)后（每10 d繼代一次），選擇結(jié)構(gòu)松散的、生長迅速的愈傷組織進(jìn)行下一步培養(yǎng)。

松散型胚性愈傷組織的培養(yǎng)方法：將上述獲得的松散型愈傷放入超凈臺中，再用解剖刀切成直徑3 mm的小塊，轉(zhuǎn)移到松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。其中含有0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1的生長素2，4-D和0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1BA，或僅含有1.0，2.0 mg·L-1 BA及僅含有1.0 mg·L-1 2，4-D。經(jīng)過5～8次繼代培養(yǎng)后（每20 d繼代一次），愈傷組織從外觀上出現(xiàn)了較大的變化，其中一些愈傷組織表面出現(xiàn)瘤狀顆粒，結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地緊密，在顯微鏡下可以看到愈傷組織細(xì)胞個體較小、細(xì)胞質(zhì)濃度增大、細(xì)胞核較大，細(xì)胞處于旺盛的分裂狀態(tài)，即為松散型胚性愈傷組織。

以上處理均為每個處理6個重復(fù)，每處理放置8塊外植體，培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，添加7.0 g·L-1瓊脂粉和30 g·L-1蔗糖，pH值調(diào)到5.8。1/2 MS培養(yǎng)基為無機(jī)鹽采用1/2，蔗糖15 g·L-1，瓊脂粉7 g·L-1，pH值為5.8；1/4 MS培養(yǎng)基為無機(jī)鹽采用1/4，其余同1/2 MS的用量。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長素和MS倍數(shù)對馬鈴薯塊莖松軟型愈傷組織形成的影響

通過不同濃度的生長素和MS總濃度的改變，比較愈傷組織的誘導(dǎo)率和生長速度以及質(zhì)地的變化，結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，所有處理都能誘導(dǎo)出愈傷組織，說明馬鈴薯是一種容易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的植物，但從愈傷組織生長及質(zhì)地情況來看，不同培養(yǎng)基差異較大。其中，MS的倍數(shù)對愈傷組織質(zhì)地影響較大，當(dāng)用1/4 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)時，愈傷組織為軟愈傷；而用1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)時，愈傷組織都為較硬的愈傷；不同2，4-D激素濃度也影響著愈傷組織的生長速度，在1/2 MS處理組中，增加2，4-D質(zhì)量濃度0.25 ～2.0 mg·L-1時，愈傷組織生長速度會逐漸增加；但在1/4 MS處理組中，當(dāng)其濃度超過1.0 mg·L-1時，愈傷組織生長速度出現(xiàn)下降。所以，在本試驗中，當(dāng)2，4-D的濃度為1.0 mg·L-1時，培養(yǎng)的愈傷組織是松軟型愈傷組織，且生長速度較快。因此，馬鈴薯誘導(dǎo)松軟型愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方為：1/4 MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+15 g·L-1蔗糖。

2.2 激素對馬鈴薯塊莖松散型愈傷組織形成的影響

通過不同濃度的BA和2，4-D激素組合，比較愈傷組織的質(zhì)地、顏色和生長速度以及結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，在不同處理中，誘導(dǎo)出的愈傷組織多數(shù)為緊密型，其中，采用較低的2，4-D濃度培養(yǎng)時（0.25 mg·L-1），隨著BA濃度的增加，愈傷組織的質(zhì)地逐漸變硬，愈傷組織結(jié)構(gòu)也從松軟變得松散，但進(jìn)而變得緊密，說明BA使用濃度不宜過大，否則會導(dǎo)致愈傷組織致密、硬化；當(dāng)BA濃度為0.5 mg·L-1時，愈傷組織基本為松散型愈傷。在BA濃度不變時，增加2，4-D的用量，愈傷組織結(jié)構(gòu)基本為緊密型，雖然愈傷組織質(zhì)地從軟變硬，但基本都是一些生長速度較快的細(xì)胞緊密結(jié)合在一起，造成愈傷組織團(tuán)結(jié)構(gòu)緊密。因此，適當(dāng)選擇2，4-D的濃度是獲得松散型愈傷組織的關(guān)鍵。

本試驗還發(fā)現(xiàn)，隨著2，4-D濃度的增加，愈傷組織生長速度加快，雖然愈傷組織生長速度對于愈傷組織誘導(dǎo)有利，但過快則不能獲得理想的愈傷組織結(jié)構(gòu)。綜上原因，對于誘導(dǎo)馬鈴薯松散型愈傷組織最理想的培養(yǎng)基為：MS+0.5 mg·L-1 BA+0.25 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖。雖然培養(yǎng)基對于誘導(dǎo)馬鈴薯松散型愈傷組織十分必要，但繼代次數(shù)與繼代時間也很重要，在繼代轉(zhuǎn)移時將質(zhì)地較硬的愈傷組織選擇下來也非常重要。

2.3 激素對馬鈴薯松散型胚性愈傷組織形成的影響

通過不同濃度的BA和2，4-D激素組合，比較愈傷組織的胚性、生長速度及其結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，只加入BA或2，4-D激素時愈傷組織不能胚性化，單獨(dú)使用BA只能使得愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，而單獨(dú)使用2，4-D只能使愈傷組織結(jié)構(gòu)為松散型；當(dāng)使用BA或2，4-D激素濃度為1.0 mg·L-1時，生長速度較快，而當(dāng)激素濃度為2.0 mg·L-1時，生長速度有所下降。當(dāng)加入一定濃度的BA和2，4-D激素組合時，愈傷組織部分或全部胚性化，愈傷組織結(jié)構(gòu)松散型，生長速度隨激素濃度的增加而增加；但當(dāng)2種激素組合的濃度達(dá)到2.0 mg·L-1時，愈傷組織結(jié)構(gòu)變?yōu)榫o密型，生長速度及胚性都有所降低。

3 討 論

2，4-D在愈傷組織誘導(dǎo)過程中起決定性作用，其在一定濃度范圍內(nèi)，濃度的增加有利于胚性愈傷組織的誘導(dǎo) [11-14]，但過高或過低的2， 4-D 濃度均不利于胚性愈傷組織的形成和分化再生 [15-18]?？偟膩砜?，誘導(dǎo)效果最好的是使用2，4-D或配合其他分裂素一起誘導(dǎo)，關(guān)于2，4-D的使用濃度主要根據(jù)植物的特性而定。另外，外植體的種類與生長勢、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的滲透壓以及附加其他生長素等都會影響2，4-D的使用濃度。

松散型愈傷組織在繼代培養(yǎng)時進(jìn)行正確的選擇是很關(guān)鍵的。在進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)過程中，除了要考慮培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件，對不同愈傷組織的取舍也非常關(guān)鍵。在誘導(dǎo)初期選擇較為堅硬的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，然后對生長較快的愈傷組織進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，還應(yīng)及早篩除一些質(zhì)地很硬但并不松散的愈傷組織，否則會影響對松散型愈傷組織的正確選擇。

影響愈傷組織胚性化的因素既有內(nèi)因，也有外因。內(nèi)因主要是遺傳問題，不能改變，而外因則是可以選擇的。因此，要想獲得愈傷組織的胚性化就必須找到適合的培養(yǎng)條件，在這些因素中，激素是很重要的影響因子，分裂素對愈傷組織胚性化作用較大。此外，培養(yǎng)溫度、營養(yǎng)、滲透壓、濕度等逆境條件也會對愈傷組織胚性產(chǎn)生一定的影響?？傊?，在進(jìn)行愈傷組織胚性化誘導(dǎo)中，正確選擇培養(yǎng)條件是試驗成功的關(guān)鍵。

4 結(jié) 論

通過對馬鈴薯松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程中試驗，得到了一套完整的誘導(dǎo)方法：采用馬鈴薯塊莖為外植體，在1/4 MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+15 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出松軟型愈傷組織；移入MS+0.5 mg·L-1 BA+0.25 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，繼代3～5次，獲得松散型愈傷組織；再移入MS+1.0 mg·L-1 BA+1.0 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，繼代5～8次后，即可獲得馬鈴薯松散型胚性愈傷組織。

參考文獻(xiàn)：

[1]董穎蘋， 黃萍， 顏謙， 等. 幾個馬鈴薯栽培種的莖段愈傷組織誘導(dǎo)[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2005（5）： 24-26.

[2]李云，盧其能，趙昶靈.影響馬鈴薯再生體系建立的主要因素[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（28）：15487-15489， 15494.

[3]彭昕琴.馬鈴薯愈傷組織離體保存及其再生的研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[4]柴瑞娟， 殷紅飛. 激素質(zhì)量濃度及不同培養(yǎng)方式對馬鈴薯愈傷組織的誘導(dǎo)[J]. 安徽工程大學(xué)學(xué)報， 2011（4）： 1-4.

[5]張輔達(dá)， 孫憲昀. 馬鈴薯莖尖培養(yǎng)脫毒研究進(jìn)展[J]. 中國馬鈴薯， 2004（1）： 35-38.

[6]林蓉，謝春梅，謝世清. 馬鈴薯莖尖脫毒培養(yǎng)關(guān)鍵因子分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2005（7）：338-340.

[7]劉江娜， 李東方， 張愛萍， 等. 不同品種馬鈴薯莖尖脫毒培養(yǎng)方法優(yōu)化技術(shù)研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014（2）： 284-290.

[8]李潤， 曾莉， 郭蓓蓓， 等. 馬鈴薯莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊， 2012（9）： 13-16.

[9]黃雪麗.馬鈴薯莖尖脫毒，愈傷組織誘導(dǎo)及分化技術(shù)優(yōu)化研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[10]張春強(qiáng).馬鈴薯脫毒快繁技術(shù)研究與應(yīng)用[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2006.

[11] WANG D， VASIL I K. Somatic embryogenesis and plant regeneration from inflorescence segments of Pennisetum Schum（Napier or elephant grass）[J]. Plant sci lett， 1982， 25：147-154.

[12] ZHANG S， CHO M J， KOPREK T， YUN R， et al. Genetic transformation of commercialcultivars of oat（Avena sativa L ）and barley （Hordeum vulgare L.） using in vitro shoot meristematic cultures derived from germinated seedlings[J]. Plant cell rep，1999， 18： 959-966.

[13]田文忠.提高秈稻愈傷組織再生頻率的研究[J].遺傳學(xué)報，1994，21（1）：215-221.

[14]袁雪，鐘雄輝，李曉昕，等.鐵炮百合的胚性愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生[J].核農(nóng)學(xué)報，2012，26（3）：454-460， 477.

[15]苗博瑛，劉艷軍，楊靜慧.黑莓松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（3）：209-212.

[16] LINACERO R， VAZQUEZ A M. Somatic enbryogenesis from immature inflorescences of rye [J]. Plant sci， 1990， 72： 253 -258.

[17]武羿君，徐慶國.2，4-D和6-BA對高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].作物研究，2012，26（7）：21-24.

[18]周厚成，羅靜，趙霞，等.甲基磺酸乙酯對草莓愈傷組織的生理效應(yīng)[J].華北農(nóng)學(xué)報，2008（3）：138-142.