MUC5AC在Barrett食管及食管腺癌中的表達及調(diào)控

索文昊 莊嚴陣 張海萍

MUC5AC在Barrett食管及食管腺癌中的表達及調(diào)控

索文昊 莊嚴陣 張海萍

目的 Barrett食管是正常食管向食管腺癌進展的重要中間階段，本研究將分析MUC5AC在Barrett食管向食管腺癌進展過程中的作用，及其調(diào)控機制。方法 通過分析對比GEO數(shù)據(jù)庫中Barrett食管和食管腺癌基因芯片，尋找差異基因，通過Western Blot，RealtimePCR等方法檢測MUC5AC的表達及P38-MAPK通路對MUC5AC的調(diào)控機制。結(jié)果 食管腺癌MUC5AC mRNA水平相對Barrett食管中的mNRA水平下降86倍，而MUC5AC的表達受到P38-MAPK通路的調(diào)控，食管腺癌中GRS-1相對Barrett食管相對升高17倍，該蛋白抑制了P38活性，下調(diào)了MUC5AC的表達。結(jié)論 MUC5AC表達下降是食管腺癌發(fā)生的重要因素，其機制可能是GRS1抑制P-38活性，通過MAPK通路下調(diào)MUC5AC表達，促進了Barrett食管向食管腺癌進展。

Barrett食管；食管腺癌；MUC5AC；GRS-1；P38；MAPK

Barrett食管（Barrett’s Esophagus，BE）是由于慢性胃食管反流引起食管的腸上皮化生，導致食管下段復層鱗狀上皮被柱狀上皮代替的病理現(xiàn)象［1］，近年食管腺癌（Esophagus Adenocarcinoma，EA）發(fā)病率逐漸升高，其發(fā)生與Barrett食管關系密切［2］，Barrett食管成為公認的食管腺癌的癌前病變［3］。黏蛋白（Mucin）是覆蓋在上皮組織表面的黏液的主要成分，目前發(fā)現(xiàn)的粘蛋白有20余種，在腫瘤發(fā)生過程中，黏蛋白可影響腫瘤細胞的黏附力、免疫識別、轉(zhuǎn)移和預后［4-5］。正常食管粘膜鱗狀上皮表達MUC1和MUC4，Barrett食管表層柱狀上皮強烈表達MUC5AC［6］，我們發(fā)現(xiàn)Barrett食管伴有重度異型增生及食管腺癌的上皮中MUC5AC的表達下調(diào)，但MUC5AC調(diào)控機制尚不清楚，我們因此推測由于MUC5AC表達下調(diào)，Barrett食管無法獲得保護，受到長期刺激后更容易進展為食管腺癌。Barrett食管是正常食管向食管腺癌進展的重要中間階段，探討其發(fā)生發(fā)展的具體機制對臨床防治Barrett食管及阻止其向食管腺癌方向進展具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)分析

在GEO數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中檢索Barrett食管及食管腺癌，選擇GSE26886［7］進行數(shù)據(jù)分析，該芯片包含正常食管粘膜，Barrett食管及食管腺癌患者的冰凍組織，應用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array進行全基因組表達譜檢測，我們選取樣本GSM661731，GSM661732，GSM661733，GSM661734，GSM661737，GSM661739為 BE組，選取GSM661743，GSM661745，GSM661749，GSM661752，GSM661753，GSM661756，GSM661758，GSM661761為EA組，利用https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/及http://www.kegg.jp/在線工具進行進一步分析。

1.2 細胞培養(yǎng)

Barrett食管細胞系：CP-B細胞，食管腺癌細胞BIC-1均購自ATCC（American Type Culture Collection），上述細胞置于含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Western Blot檢測蛋白表達

裂解細胞后，提取蛋白質(zhì)并定量，制備10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，用P38，P-P38，β-Tublin一抗工作夜（1：1 000稀釋）、HRP標記的二抗工作液（1：5 000稀釋）孵育，用增強型化學發(fā)光試劑（EC L）顯影并拍照。

1.4 RGS1的干擾與檢測

針對RGS1的siRNA干擾序列（見表1）及陰性對照Scramble序列由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。將BIC-1細胞分為對照組和RGS1干擾組，分別轉(zhuǎn)染Scramble siRNA及干擾siRNA。48 h后提取mRNA，用Realtime PCR檢測RGS1基因表達，PCR引物（見表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 RGS1基因的干擾序列和檢測引物

1.5 統(tǒng)計學方法

用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）及LSD檢驗。P＜0.05，表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GEO數(shù)據(jù)庫分析，MUC5AC mRNA在食管腺癌中表達顯著降低

我們對GSE26886［7］進行分析，對比EA和BE組mRNA，二者存在差異基因9 670個（見圖1），其中最為差異最為顯著的10個基因為見表2，其中MUC5AC mRNA 在食管腺癌組織中相對于Barrett食管mRNA低86倍。

2.2 MAPK通路在Barrett食管和食管腺癌中發(fā)揮了關鍵作用

通過分析基于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫中信號通路的上下游關系，構(gòu)建了相關信號通路之間的相互作用關系網(wǎng)絡圖，我們發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路是BARRETT食管和食管腺癌中最為核心的信號通路（見圖2）。

2.3 MUC5AC蛋白受到P38-MAPK信號通路調(diào)控

CP-B和BIC-1分別分為對照組和實驗組，對照組加入DMSO，而實驗組加入P38抑制劑SB203580（25 μmol/L），通過Western blot檢測，我們發(fā)現(xiàn)CP-B細胞和BIC-1細胞中P38、 P-P38的表達受到SB203580的抑制，而MUC5AC的表達也下降（見圖3），說明MUC5AC的下調(diào)受到了P38-MAPK信號通路調(diào)控。

圖1 Barrett食管和食管腺癌mRNA表達差異基因（Q＜0．05，P＜0．02，倍數(shù)＞1．2）

圖2 基因信號通路網(wǎng)絡圖，B為A局部放大圖，MAPK信號通路是核心信號通路

圖3 用DMSO和SB203580分別處理CP-B細胞和BIC-1細胞

2.4 RGS1抑制P38-MAPK通路

Barrett食管的發(fā)生通常與反流性食管炎相關［8］，炎癥刺激會激活MAPK通路，促進激活黏蛋白分泌粘液，但是在食管腺癌發(fā)生過程中這一過程被抑制，而調(diào)控機制尚不清楚，進一步分析，我們發(fā)現(xiàn)RGS1參與了該過程（見表2），食管腺癌組織中RGS1較Barrett食管組升高，我們合成了針對RGS1基因的干擾序列和PCR引物（見表1），將RGS1 siRNA及對照siRNA（NC）轉(zhuǎn)染BIC-1細胞，通過Realtime PCR方法檢測，RGS1 RNA表達下降（見圖4）。

食管腺癌細胞BIC-1分為3組，分別是WT、NC和siRGS1組，NC組轉(zhuǎn)染Scramble序列，siRGS1轉(zhuǎn)染針對RGS1的siRNA，轉(zhuǎn)染48 h后提取總蛋白，通過Western Blot檢測，發(fā)現(xiàn)siRGS1組P38，P-P38，MUC5AC蛋白相對對照組升高（見圖5）。

表2 Barrett食管和食管腺癌mRNA表達差異基因

圖4 食管腺癌細胞BIC-1轉(zhuǎn)染siRNA，RGS1基因表達下降注：*表示P＜0．05

3 討論

黏蛋白（Mucin）是覆蓋在上皮組織表面的黏液的主要成分，在腫瘤發(fā)生過程中，黏蛋白可影響腫瘤細胞的黏附力、免疫識別、轉(zhuǎn)移和預后［9］。正常食管黏膜鱗狀上皮表達MUC1和MUC4，而BARRETT食管表層柱狀上皮強烈表達MUC5AC，腺體表達MUC6［6］，我們的研究表明BARRETT食管伴有重度異性增生及食管腺癌的上皮中MUC5AC的表達下調(diào)，正是這一改變可能使正常的保護、調(diào)節(jié)黏膜分化的功能受到影響，從而導致腫瘤的發(fā)生。

我們的研究發(fā)現(xiàn)P38-MAPK通路是參與MUC5AC調(diào)控的重要信號通路，P38-MAPK信號途徑是MAPKs家族中的重要組成部分，是細胞間信號傳導通路的作用途徑之一［10］，它在外界各種刺激條件的作用下，活化為磷酸化P38（P-P38）參與細胞內(nèi)凋亡、分化、炎癥、應激［11-12］等，我們發(fā)現(xiàn)在Barrett食管及食管腺癌細胞中抑制P38的表達，MUC5AC表達水平下降，說明MUC5AC受到P38-MAPK通路調(diào)控。Barrett食管的發(fā)生通常與膽汁反流相關，炎癥刺激常常會激活MAPK通路，可以通過激活黏蛋白促進細胞分泌粘液，從而保護黏膜組織，但是在食管腺癌發(fā)生過程中這一過程卻被抑制，通過分析，我們發(fā)現(xiàn)在食管腺癌中RGS1表達明顯上調(diào)，該蛋白通過抑制p38-MAPK通路降低了MUC5AC的表達，從而使得食管粘膜無法獲得保護，在長期刺激下導致腫瘤的發(fā)生。

圖5 BIC-1轉(zhuǎn)染針對RGS1的siRNA

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Expression and Regulation of MUC5AC in Barrett’s Esophagus and Esophagus Adenocarcinoma

SUO Wenhao ZHUANG Yanzhen ZHANG Haiping
Department of Pathology，The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen Fujian 361003，China

Objective Barrett's esophagus is an important intermediate stage in the development of esophageal adenocarcinoma． In this study，the role of MUC5AC in esophageal adenocarcinoma was analyzed and regulation mechanism of MUC5AC was studied． Methods The differentially expressed genes of Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma were performed by analyze microarray in GEO datasets． The expression of MUC5AC expression and the regulation of MUC5AC through P38-MAPK pathway were detected by Western Blot and RealtimePCR． Results The expression of MUC5AC mRNA in esophageal adenocarcinoma was 86-fold lower than that in Barrett's esophagus． The expression of MUC5AC in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma cells was regulated by P38-MAPK pathway． The expression of GRS-1 in esophageal adenocarcinoma was 17 times higher than that in Barrett's esophagus，the protein inhibited the P38 activity，and down-regulated the expression of MUC5AC． Conclusion The down-regulation of MUC5AC expression is an important factor in the occurrence of esophageal adenocarcinoma． The mechanism may be that GRS1 inhibits P38 activity and down-regulates MUC5AC expression through MAPK pathway，which promotes the progression of Barrett's esophagus to esophageal adenocarcinoma．

Barrett’s esophagus，Esophagus adenocarcinoma，MUC5AC，GRS-1，P38，MAPk pathway

R361

A

1674-9316（2016）23-0165-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2016．23．091

福建省衛(wèi)生計生委青年科研課題（編號：2014-2-64）

基金項目：福建省自然科學基金項目（編號：2015J01562）

廈門大學附屬第一醫(yī)院病理科，福建 廈門 361003

▲ 通訊作者：張海萍，E-mail：zhp3398@163．com