RNA干擾技術(shù)在哮喘治療的研究進(jìn)展

楊宏寬 潘俊杰 張佳穎 王佳君 王芳 陳芳?

·綜述·

RNA干擾技術(shù)在哮喘治療的研究進(jìn)展

楊宏寬 潘俊杰 張佳穎 王佳君 王芳 陳芳?

哮喘是一種常見的、慢性的多因素呼吸系統(tǒng)疾病，常以慢性氣道炎癥為特征。世界衛(wèi)生組織預(yù)計全世界現(xiàn)有3億哮喘患者，如此高的患病率造成社會經(jīng)濟(jì)和衛(wèi)生保健系統(tǒng)面臨嚴(yán)重負(fù)擔(dān)［1］。盡管吸入型糖皮質(zhì)激素在輕中度哮喘治療中能有效改善癥狀及減少急性發(fā)作的次數(shù)，其在重度及難治性哮喘治療中的效果難以令人滿意。因此，在哮喘治療中需要尋找新的治療干預(yù)手段。

1 RNA干擾概述

RNA干擾（RNAi）是20世紀(jì)90年代在矮牽牛屬植物及線蟲中發(fā)現(xiàn)的由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，Dicer酶將其特異性識別并裂解成 21 ～23個核苷酸小干擾RNA（samll interfering RNA，siRNA）。雙鏈siRNA與Dicer酶的雙鏈RNA結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA induced silencing complex，RISC）。RISC被激活后將siRNA中的雙鏈分開，并催化siRNA的反義鏈去尋找互補的靶基因 mRNA 鏈并與之相互結(jié)合，隨后目的基因mRNA在特異的位點被切割從而導(dǎo)致目的基因降解［2］。目前RNA干擾技術(shù)主要包括直接化學(xué)合成siRNA及構(gòu)建短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）的表達(dá)載體兩種途徑。直接化學(xué)合成siRNA具有合成方便，但轉(zhuǎn)染效率不確定，且基因沉默持續(xù)時間較短。短發(fā)夾RNA由兩個短反向重復(fù)序列及中間一莖環(huán)（loop）序列鏈接組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。將siRNA序列設(shè)計作為shRNA克隆進(jìn)載體中，當(dāng)其轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)時，該發(fā)夾序列被表達(dá)出來，形成shRNA，隨即被Dicer酶分解莖環(huán)產(chǎn)生siRNA，進(jìn)而由上述RNAi通道產(chǎn)生靶基因的沉默。短發(fā)夾RNA表達(dá)載體具有基因沉默持續(xù)時間長，可構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)siRNA的細(xì)胞株等優(yōu)點，但費用較高［3］。

2 RNA干擾技術(shù)在哮喘治療中的應(yīng)用

自RNA干擾技術(shù)產(chǎn)生以來，因其對靶基因的良好沉默效果使其迅速成為各個領(lǐng)域的研究熱點，其中在哮喘的治療研究中展現(xiàn)出令人興奮的進(jìn)展。目前相關(guān)研究主要包括以下五大靶點。

2.1 細(xì)胞因子 輕中度過敏性哮喘常以氣道慢性炎癥的急性加重為特征，表現(xiàn)為2型輔助性CD4+T淋巴細(xì)胞（Type 2 T helper cells，Th2）的激活及嗜酸性粒細(xì)胞的滲出，并且與IgE的產(chǎn)生，黏液分泌細(xì)胞的增生和化生，氣管壁的重塑及氣道的高反應(yīng)性相關(guān)。Th2細(xì)胞分泌的一系列細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）-5，9，13分別在嗜酸性細(xì)胞增多癥，肥大細(xì)胞增多癥，氣道黏液過度分泌中起著調(diào)控作用。肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、桿狀細(xì)胞通過滲出、激活并分泌各自產(chǎn)生的介質(zhì)，促進(jìn)氣道慢性過敏性炎癥的發(fā)生［4］。因此較多研究將各種Th2細(xì)胞因子為研究靶點，嘗試通過RNA干擾技術(shù)抑制其表達(dá)從而達(dá)到治療哮喘的目標(biāo)。Lee等［5］通過氣道滴入以慢病毒為載體的IL-4特異性shRNA及IL-13特異性shRNA，發(fā)現(xiàn)抑制哮喘模型小鼠的氣道嗜酸性粒細(xì)胞性炎癥，減輕氣道高反應(yīng)性及減少IL-4，5，13等Th2細(xì)胞因子的釋放。Huang等［6］通過氣管注射表達(dá)IL-5 siRNA的慢病毒后，顯著改善哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性和嗜酸粒細(xì)胞浸潤，從而使哮喘得到控制。Li 等［7］通過對哮喘模型小鼠氣道吸入表達(dá)IL-23的shRNA，顯著減弱IL-23的表達(dá)，同時減弱肺部嗜酸性細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的滲出，同時減少血清中IgE，IL-4，IL-17等的表達(dá)，起到抗炎作用。

2.2 趨化因子 在哮喘等慢性氣道炎癥疾病中，招募白細(xì)胞進(jìn)入氣道的趨化因子是產(chǎn)生炎癥的重要環(huán)節(jié)。其中，嗜酸性細(xì)胞選擇性趨化因子如CCL11、CCL24、CCL26等通過結(jié)合CCR3受體在招募嗜酸性細(xì)胞的聚集與滲出起著重要作用。Errahali 等［8］通過CCL26-siRNA轉(zhuǎn)染至人類II型肺泡上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)顯著抑制CCL-5，8，13，15，26等一系列趨化因子的表達(dá)，并顯著抑制嗜酸性細(xì)胞的遷徙與激活，為進(jìn)一步在人體哮喘治療提供了新思路。

2.3 酪氨酸激酶 在哮喘的發(fā)病機制中，Th2細(xì)胞的激活與其分泌的一系列細(xì)胞因子起著重要作用。目前已有一系列旨在阻斷Th2細(xì)胞過度分化，糾正Th1/Th2失衡的研究，其中包括抑制酪氨酸激酶，如淋巴細(xì)胞特異性酪氨酸激酶（lymphocyte specific tyrosine kinase，LCK）和脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）。Lck是T細(xì)胞分化中起調(diào)控作用的酶?？乖f呈細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞）將抗原攝取、加工后，由主要組織相容性復(fù)合物II（MHC II）攜帶抗原肽至細(xì)胞膜上，并被初始T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體（TCR）識別，后者在Lck的作用下啟動一系列信號傳導(dǎo)，使Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞方向分化，并釋放一系列Th2細(xì)胞因子，導(dǎo)致哮喘的急性變態(tài)反應(yīng)［9］。Zhang 等［10］通過向哮喘模型小鼠尾靜脈注射lck特異性siRNA，減少肺組織嗜酸性粒細(xì)胞的滲出及減少肺部和血清中IgE，IL-4的表達(dá)，從而減輕肺部炎癥。Syk是樹突狀細(xì)胞（DC）的抗原遞呈過程和FceR介導(dǎo)肥大細(xì)胞激活所必需的激酶，在Th2細(xì)胞和B細(xì)胞活化，以及細(xì)胞因子受體所介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路中起重要作用。Huang 等［11］將Syk特異性siRNA經(jīng)鼻部滴入哮喘模型小鼠中，發(fā)現(xiàn)顯著減少肺部炎癥細(xì)胞的浸潤。

2.4 表面分子 CD40屬于TNF受體超家族的一員，在抗原提呈細(xì)胞（APC）的成熟中起重要作用。APC上的CD40與T細(xì)胞上的CD154相互作用進(jìn)而激活T細(xì)胞，增加Th2細(xì)胞因子的表達(dá)及促進(jìn)T細(xì)胞的增殖。Suziki 等［12］構(gòu)建的以CD40為靶向的siRNA減少哮喘模型小鼠的鼻部癥狀及嗜酸性粒細(xì)胞血癥。共刺激分子CD80/ CD86是樹突狀細(xì)胞的表面抗原，通過CD80 /CD86- CD28通路在啟動Th活化，促使Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞方向分化的過程中起重要作用。Li 等［13］通過將CD80和 CD86特異性 siRNA共同轉(zhuǎn)染至哮喘模型小鼠骨髓來源的成熟樹突狀細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)降低IL-4等Th2細(xì)胞因子及提高INF-γ等Th1細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制Th細(xì)胞向Th2細(xì)胞的分化，糾正Th1/Th2失衡。Asai-Tajiri 等［14］通過氣道滴入CD86特異性siRNA，改善哮喘模型小鼠的嗜酸性粒細(xì)胞增多及氣道高反應(yīng)性，降低IL-5，IL-13等Th2細(xì)胞因子的釋放。

2.5 轉(zhuǎn)錄因子 在抑制T細(xì)胞向Th2細(xì)胞過度分化這一治療策略的研究中，除上述靶向針對激酶，細(xì)胞表面分子等外，靶向抑制轉(zhuǎn)錄因子也是一大研究熱門。包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）STAT1、STAT5、STAT6、 GATA結(jié)合蛋白和NF -κB等。STAT1 是連接多種細(xì)胞膜受體與選擇性效應(yīng)器間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要蛋白質(zhì)，在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用。劉春鳳等［15］通過siRNA沉默STAT1的表達(dá)抑制嗜酸性細(xì)胞的增殖及減少Th1/Th2細(xì)胞比例失衡，減輕氣道炎癥。JAK-STAT5信號通路是T細(xì)胞增殖過程中極為重要的信號傳導(dǎo)途徑。當(dāng)STAT5受到TCR相關(guān)信號刺激時活化，能引起下游靶基因如cyclin D1、c-myc和bcl-2等抑凋亡基因過表達(dá)，從而抑制T細(xì)胞凋亡。邱晨等［16］通過構(gòu)建siRNA抑制哮喘模型小鼠的脾臟T細(xì)胞STAT5的表達(dá)，抑制T細(xì)胞的增殖及促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡，從而減輕肺部炎癥。GATA3是T細(xì)胞中表達(dá)多向性的轉(zhuǎn)錄因子，其通過正反饋機制維持Th2分化狀態(tài)，是Th2功能分化及Thl/Th2平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Lee 等［17］通過局部應(yīng)用以慢病毒為載體的GATA3特異性shRNA，減輕哮喘模型小鼠的氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性。

3 待解決問題

盡管眾多應(yīng)用RNA干擾技術(shù)針對哮喘發(fā)病機制中不同靶點的實驗研究取得富有前景的進(jìn)展，但要真正將其應(yīng)用至臨床實踐中，仍有一些問題亟待解決。

3.1 脫靶效應(yīng) 脫靶效應(yīng)指siRNA對非靶mRNA的敲除作用。關(guān)于脫靶效應(yīng)的機制尚不十分明確，目前普遍認(rèn)為siRNA上的種子區(qū)域包括miRNA上的引導(dǎo)鏈上的第2至第8個核苷酸，能被miRNA所識別，進(jìn)而siRNA可通過種子區(qū)域的雜交啟動類似miRNA途徑的抑制基因表達(dá)的作用。目前一些化學(xué)修飾及改變siRNA設(shè)計的措施可減少脫靶效應(yīng)的風(fēng)險，但會一定程度上降低siRNA的效能，故如何更深入的了解脫靶效應(yīng)及避免其發(fā)生仍需進(jìn)一步探究［18-19］。

3.2 固有免疫系統(tǒng)的激活 SiRNA中特異的序列如5'-GUCCUUCAA-3'，可被Toll樣受體識別進(jìn)而誘導(dǎo)機體激活固有免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生干擾素及促進(jìn)一系列炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生［20］。鑒于哮喘是氣道慢性炎癥性疾病，siRNA導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)的激活有可能加重炎癥的進(jìn)展，誘發(fā)哮喘的發(fā)作，故需要進(jìn)一步探討解決方案。

3.3 給藥方式 鑒于全身給藥會讓siRNA易被血清中的核酸酶降解并經(jīng)腎臟排泄，同時也會通過TOLL樣受體（TLR）激活固有免疫，導(dǎo)致炎癥因子的增加，故局部用藥在哮喘治療研究的給藥方式中十分重要。目前動物實驗的主要給藥方式有鼻內(nèi)滴入或噴灑給藥，經(jīng)氣管切開插管給藥，經(jīng)口氣道內(nèi)噴曬給藥，以及吸入給藥等。鼻內(nèi)給藥因藥物難以到達(dá)下呼吸道以及肺內(nèi)的分布不均勻，目前較少應(yīng)用于哮喘研究。氣管切開插管給藥雖然效果好，但由于其有創(chuàng)性，可能難以令患者接受。經(jīng)口氣道內(nèi)噴曬給藥在動物實驗中多是自制的簡易裝置，優(yōu)點是無創(chuàng)、可靠，但應(yīng)用于人類呼吸道需要開發(fā)更舒適、更符合人解剖生理的裝置。吸入給藥分為計量劑量吸入（MDIs）及干粉吸入（DPIs），是肺內(nèi)給藥的重要方式。但由于目前吸入型的siRNA較少，及需要尋找合適載體在干燥過程中保護(hù)核酸免受因側(cè)切力和溫度導(dǎo)致的降解，吸入給藥仍需改進(jìn)和研究［21-22］。

3.4 合適載體 SiRNA的負(fù)電荷屬性及化學(xué)易降解性要求在基因干擾治療中加入載體以增加其穩(wěn)定性，以及促進(jìn)其對靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。目前有病毒載體及包括脂質(zhì)、多聚體等非病毒載體。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒等，具有轉(zhuǎn)染成功率高的特點，但其有可能激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生各種并發(fā)癥，且一些病毒載體會將其基因隨機插入宿主的染色體中，以上這些限制病毒載體的應(yīng)用。與之相比，脂質(zhì)載體及多聚體載體具有低毒性的特點［23］。尋找安全可靠又富有效率的載體仍是一個挑戰(zhàn)。

4 展望

相對于利用小分子，蛋白，單克隆抗體為形式的傳統(tǒng)藥物，RNA干擾治療擁有幾個優(yōu)勢。與傳統(tǒng)藥物不同的是，基于RNA干擾的治療方法幾乎可以高選擇性、高效抑制各個層次的基因目標(biāo)的表達(dá)，可以根據(jù)患者的情況開展個體化的治療，輕易合成，通過主要部位的鑒別與優(yōu)化等幾個快速的步驟實現(xiàn)引導(dǎo)。如今已有正處于臨床試驗階段的治療哮喘的siRNA藥物，如ExcellairTM（ZaBeCor，Bala Cynwyd，PA，USA），一個吸入型靶向抑制Syk激酶的siRNA藥物，正處于II期臨床試驗中，顯示出良好的耐受性和一定的療效［24］。相比于現(xiàn)有的TNF-α抑制劑、白三烯抑制劑等僅作用于一種炎癥因子的藥物，作用于Syk激酶的siRNA通過作用于炎癥發(fā)生的初始步驟（B細(xì)胞的激活）從而抑制多種炎癥因子的釋放，因此具有更好的抗炎效果。但哮喘的發(fā)病機制涉及諸多通路和分子，仍需進(jìn)一步研究。RNA干擾技術(shù)作為一門新的技術(shù)，相信隨著化學(xué)修飾技術(shù)的進(jìn)步，對脫靶效應(yīng)研究的深入，及對分子水平及基因水平上的哮喘發(fā)病機制的更深入了解，RNA干擾技術(shù)可以成為人類控制哮喘新的手段。

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國家自然科學(xué)基金青年項目（81302934）；浙江省科技廳錢江人才計劃（2012 R10063）；浙江省博士后科研資助項目（BSH1402070）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（楊宏寬 潘俊杰 張佳穎 王佳君 王芳）

310006 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院（陳芳）

*通信作者