羅非魚(yú)頭磷脂組成及其化學(xué)特性

田 宏，張春華，陳山喬，吳文惠，張朝燕，包 斌

（1.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；3.上海水產(chǎn)品加工與貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；4.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)研究院，上海 201306）

羅非魚(yú)頭磷脂組成及其化學(xué)特性

田 宏1，張春華2，陳山喬2，吳文惠3，4，張朝燕2，包 斌2

（1.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；3.上海水產(chǎn)品加工與貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；4.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)研究院，上海 201306）

基于對(duì)羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)加工中很少被回收利用的羅非魚(yú)頭進(jìn)行高值化綜合利用的需求，本文探討了從羅非魚(yú)頭中提取磷脂的潛在價(jià)值.首先對(duì)羅非魚(yú)頭磷脂進(jìn)行了提取氯仿-甲醇體系溶劑提取，并對(duì)粗磷脂進(jìn)行硅膠柱常壓色譜純化.經(jīng)測(cè)定，羅非魚(yú)頭中總磷脂含量高達(dá)26.3mg/100g.基于薄層色譜，傅里葉變換紅外光譜和電噴霧質(zhì)譜的分析后可見(jiàn)，羅非魚(yú)頭中磷脂的主要種類(lèi)為磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿，并且羅非魚(yú)頭磷脂中的脂肪酸組成具有多樣性，每個(gè)種類(lèi)的磷脂中至少發(fā)現(xiàn)5種不同的脂肪酸.本文的研究結(jié)果表明羅非魚(yú)頭是一種優(yōu)良的磷脂提取原料.

磷脂；羅非魚(yú)；生物資源綜合利用；TLC；FTIR；ESI-MS

我國(guó)現(xiàn)在是羅非魚(yú) (Oreochromis niloticus)養(yǎng)殖和加工的大國(guó)，出現(xiàn)養(yǎng)殖業(yè)和加工業(yè)繁榮的同時(shí)也產(chǎn)生了大量加工副產(chǎn)物而給環(huán)境造成了巨大壓力等問(wèn)題，所以關(guān)于其副產(chǎn)物的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究漸漸成為熱點(diǎn)，針對(duì)內(nèi)臟[1]、魚(yú)皮[2]、魚(yú)鱗[3]和魚(yú)骨[4]正在開(kāi)展深入研究，而對(duì)魚(yú)頭的研究卻相對(duì)薄弱，基于羅非魚(yú)頭油富含的磷脂的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理功效，本文以羅非魚(yú)頭為對(duì)象，從磷脂的組成，化學(xué)特性為主題，進(jìn)行研究，以期為羅非魚(yú)頭的高值化利用提供理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)解決羅非魚(yú)加工副產(chǎn)物帶來(lái)的資源和環(huán)境問(wèn)題也具有應(yīng)用價(jià)值.

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

羅非魚(yú)頭由云南新海豐水產(chǎn)有限公司提供.

磷脂標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司；硝酸、高氯酸、石油醚、氯仿、甲醇、丙酮、磷酸二氫鉀、鉬酸銨、抗壞血酸、硅膠等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 羅非魚(yú)頭基本成分的測(cè)定

水分含量的測(cè)定依照GB/T 9695.15進(jìn)行，總蛋白含量的測(cè)定依照GB 5009.5-2010進(jìn)行，總脂肪含量的測(cè)定依照GB/T 9695.7進(jìn)行，灰分含量的測(cè)定依照GB/T 9695.18進(jìn)行.

1.3 羅非魚(yú)頭粗磷脂的提取純化

稱(chēng)取一定質(zhì)量解凍后的羅非魚(yú)頭，按照料液比（W/V）2:1的比例加入氯仿-甲醇（1:1），用高速組織搗碎機(jī)14000r/min將其勻漿，在400w，35℃的條件下超聲輔助萃取30min，后以14000r/min，15min離心3次，收集提取液，抽濾后，收集提取液，經(jīng)40℃真空濃縮，再加入冷丙酮沉淀，離心（14000 r/min，15min離心3次），收集沉淀，氮?dú)獯蹈?，?℃保存，即為粗磷脂成品.

1.4 羅非魚(yú)頭總磷脂含量及磷脂理化指標(biāo)的測(cè)定

使用鉬藍(lán)比色法測(cè)定羅非魚(yú)頭中總磷含量，以磷酸二氫鉀作標(biāo)準(zhǔn)曲線.按照18%硫酸溶液:2.5%鉬酸銨溶液:10%抗壞血酸:水（體積比1:1:1:2）配制鉬藍(lán)顯色劑.稱(chēng)取粗磷脂樣品，按照順序依次加入硝酸，蒸餾水，高氯酸，過(guò)氧化氫（體積比為5：5：3.5：2.5），煮沸消化，待溶液顏色漸漸由淺黃變至無(wú)色，冷卻.吸取消化液加顯色劑，水浴（50℃,30min），660nm測(cè)定吸光值（Abs）.按照以下公式計(jì)算磷脂含量：

水分及揮發(fā)物含量的測(cè)定依GB/T 5528-2008進(jìn)行，磷脂丙酮不溶物含量測(cè)定依SN/T 0802.2-1999，乙醚不溶物含量測(cè)定依SN/T0802.1-1999進(jìn)行，酸值的測(cè)定依GB/T 5530-2005進(jìn)行，過(guò)氧化值的測(cè)定依GB/T 5538-2005進(jìn)行.

1.5 羅非魚(yú)頭粗磷脂的柱色譜純化

用甲醇濕法對(duì)硅膠柱進(jìn)行濕法裝柱，干法上樣.洗脫劑由氯仿甲醇構(gòu)成二元梯度，并添加1%乙酸，梯度中的氯仿含量從100%以10%逐級(jí)減少至0%.收集經(jīng)硅膠柱分離后的溶液，以TLC檢測(cè)后，將對(duì)應(yīng)的洗脫液真空濃縮后，既為精制磷脂.

1.6 羅非魚(yú)頭磷脂的薄層色譜分析

展開(kāi)劑為氯仿：甲醇=3:1（含1%乙酸）的溶液，將展開(kāi)后的硅膠板置于充滿(mǎn)碘蒸汽的染缸內(nèi)染色，測(cè)定各個(gè)斑點(diǎn)的Rf值.再將用硫酸-乙醇顯色，再次測(cè)定各個(gè)斑點(diǎn)的Rf值（Rf值為樣品各組分在硅膠板上移動(dòng)的距離與展開(kāi)劑前沿移動(dòng)的距離比值）.將硅膠板上各磷脂組分進(jìn)行小心刮取，收集，溶于氯仿中，為下一步磷脂的化學(xué)特性分析做準(zhǔn)備.

1.7 羅非魚(yú)頭磷脂的紅外光譜分析

對(duì)磷脂樣品使用溴化鉀壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)其進(jìn)行紅外譜圖的測(cè)定.室溫保持在25℃，光譜范圍在400cm-1～4000cm-1.

1.8 羅非魚(yú)頭磷脂的質(zhì)譜分析

使用質(zhì)譜直接進(jìn)樣，ESI離子源溫度350℃，氮?dú)鉃殪F化氣，噴霧電壓 3.5kV，掃描范圍：m/z200～1100.

2 結(jié)果與討論

2.1 羅非魚(yú)頭的基本成分

羅非魚(yú)頭的基本組分測(cè)定結(jié)果如表1所示.

表1 羅非魚(yú)頭基本成分

表1顯示羅非魚(yú)頭的水分含量超過(guò)70%達(dá)到73.28%±2.31%，蛋白質(zhì)含量占干重的56.61%，是羅非魚(yú)頭的主要干物質(zhì).脂肪達(dá)到26.07%，是羅非魚(yú)頭的中藥成分.

2.2 羅非魚(yú)頭總磷脂含量測(cè)定

經(jīng)鉬藍(lán)比色法測(cè)定的羅非魚(yú)頭總磷脂含量26.3mg/100g，相當(dāng)于濕重的2.6%，有報(bào)道顯示，鰹魚(yú)腦中的磷脂含量為2.3%，扇貝卵巢中磷脂含量為1.0%，鱈魚(yú)卵磷脂含量為2.2%[5].相比這幾種水產(chǎn)動(dòng)物而言，羅非魚(yú)頭中的磷脂含量是比較高的.此外，大豆中磷脂含量約為1.6%～2.5%[6]，跟大豆比較而言，羅非魚(yú)頭中的磷脂含量也是相對(duì)較高的，這為研究開(kāi)發(fā)羅非魚(yú)頭磷脂提供了一定的理論支持.

2.3 羅非魚(yú)頭磷脂的理化指標(biāo)

對(duì)提取的羅非魚(yú)頭磷脂進(jìn)行感官評(píng)定及理化指標(biāo)測(cè)定，色澤為淺黃色，質(zhì)地均勻，無(wú)霉變，有磷脂固有的味道，有淡魚(yú)腥味，其他理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果如下表2所示.

由表2可知，經(jīng)氯仿-甲醇法提取再經(jīng)丙酮沉淀后得到的羅非魚(yú)頭磷脂的水分及揮發(fā)物的含量為1.5%，丙酮不溶物的含量約98.7%，乙醚不溶物的含量約0.6%，酸值18.3mg/kg，過(guò)氧化值的含量19.7mmol/kg.其中，水分及揮發(fā)物、丙酮不溶物、酸值都達(dá)到了粉末磷脂一級(jí)標(biāo)準(zhǔn).乙醚不溶物的含量為0.6%介于0.5%～2.0%之間，達(dá)到了粉末磷脂二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，尚未達(dá)到粉末磷脂一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7].

2.4 羅非魚(yú)頭磷脂的薄層層析（TLC）

磷脂標(biāo)準(zhǔn)品和磷脂各分離組分的TLC分析結(jié)果如圖1與圖2所示.

表2 羅非魚(yú)頭磷脂理化指標(biāo)

圖1 磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的薄層色譜圖

圖2 羅非魚(yú)頭磷脂的薄層色譜圖

圖1為磷脂標(biāo)準(zhǔn)品TLC譜圖，主要以PC、PE、PS和PI為參照.圖2為對(duì)經(jīng)過(guò)硅膠柱層析分離后的四個(gè)磷脂組分做的TLC譜圖，左邊為用碘染色的TLC結(jié)果，右邊為經(jīng)過(guò)硫酸-乙醇染色的TLC結(jié)果.經(jīng)過(guò)硅膠柱層析、薄層層析并結(jié)合比色法，主要在四個(gè)樣品中得到了幾種磷脂組分，從圖中可以看出，羅非魚(yú)頭磷脂構(gòu)成主要有PE、PS、PI和PC四種，而且以PE的含量最高（表3）.

表3是羅非魚(yú)頭的磷脂各組分的相對(duì)含量，由表可知，羅非魚(yú)頭磷脂中PE、PS、PC和PI的相對(duì)含量分別為38.7%，9.2%，36.5%和5.7%，其中以PE的含量最高，并且比多數(shù)魚(yú)類(lèi)高，如鱸魚(yú)肌肉、鱈魚(yú)的PE相對(duì)含量分別為13.1%和11.5%，同時(shí)也比陸地動(dòng)物的高，如兔、羊、豬肝臟中PE相對(duì)含量分別為28.7%、23.1%和25.9%.另外，羅非魚(yú)頭中PC的含量比其他魚(yú)類(lèi)的低，如鱸魚(yú)肌肉、真鯛、鱈魚(yú)中分別為68.3%、66.0%和71.3%，相比于陸生動(dòng)物的也要低，如兔、羊、豬、肝臟中分別為53.1%、57.2%和55.6%[8-10].PE可以保護(hù)心肌纖膜的正常生理功能，并且與某些神經(jīng)信號(hào)的傳遞有關(guān)系.PS有抗癌、抗衰老以及增強(qiáng)免疫力的功能[11]，而羅非魚(yú)頭中PS含量占總磷脂的比例約為9.2%，綜上所述，也可以考慮把羅非魚(yú)頭作為PE和PS的開(kāi)發(fā)來(lái)源.

表3 羅非魚(yú)頭的磷脂各組分相對(duì)含量

2.5 羅非魚(yú)頭磷脂的紅外光譜特征

磷脂中有-OH、-CH2、-CH、C=O（脂）、P-O-C、苯環(huán)和P=O等官能團(tuán)[12]，羅非魚(yú)頭磷脂的紅外光譜圖顯示，以上官能團(tuán)在圖中對(duì)應(yīng)的吸收峰分別為3292.49cm-1、2924.83cm-1、2853.78cm-1、1746.09cm-1、1050.43 cm-1、1626.39 cm-1和1229.67 cm-1.在PE、PS、PI和PC這四種磷脂中均有-CH2、C=O（脂）、P-O-C和P=O官能團(tuán)，此外，PI中還含-OH和苯環(huán).所以通過(guò)紅外光譜的分析結(jié)果，對(duì)羅非魚(yú)頭中的磷脂可以進(jìn)行初步的定性.

表4 羅非魚(yú)頭磷脂分子構(gòu)成特征

2.6 羅非魚(yú)頭磷脂的質(zhì)譜特征

磷脂標(biāo)準(zhǔn)品為參照，分析了磷脂分離組分的質(zhì)譜特征（質(zhì)譜圖未顯示），結(jié)果列入表4.

表4是羅非魚(yú)頭粗磷脂和各磷脂分離組分中磷脂分子類(lèi)型的分析結(jié)果.根據(jù)質(zhì)譜圖信息，利用Chemstation工作站對(duì)其中的分子和離子碎片進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅非魚(yú)頭磷脂中主要有四種磷脂組分，分別為PE、PS、PC和PI，通過(guò)表4可知，其中連接在各磷脂分子兩端的脂肪酸分子類(lèi)型結(jié)果為：PE分子上主要有C14:0，C18:0，C19:0，C22:0，C23: 0，C15:3，C16:4，C18:2，C18:3，C18:4，C19:1，C20:1，C20:5和C22:6.PS分子上主要有C12:0，C18:0，C22: 0，C20:5和C22:6.PC分子上主要有C12:0，C14:0，C19:1，C20:5和C22:6.PI分子上主要有C12:0，C15: 1，C20:4，C20:5和C22:6.相比鰹魚(yú)腦主要以C16:0，C18:0，C18:1和C22:6為主[13]，羅非魚(yú)頭磷脂中具有更豐富的脂肪酸種類(lèi).

3 結(jié)論

經(jīng)氯仿-甲醇提取，丙酮沉淀，硅膠柱分離后得羅非魚(yú)頭中磷脂，對(duì)總磷脂含量的測(cè)定結(jié)果為26.3mg/100g，相當(dāng)于濕重的2.6%，與其他海產(chǎn)品和大豆相比，羅非魚(yú)頭中的磷脂含量相對(duì)較高.對(duì)其理化指標(biāo)的分析結(jié)果顯示，除了乙醚不溶物含量達(dá)到粉末磷脂二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)以外，其他理化指標(biāo)均達(dá)到了粉末磷脂一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明了提取的羅非魚(yú)頭磷脂具有較好的品質(zhì).

實(shí)驗(yàn)采用紅外光譜法對(duì)羅非魚(yú)頭磷脂進(jìn)行了初步定性，通過(guò)薄層層析法將羅非魚(yú)頭粗磷脂進(jìn)行展開(kāi)、定性，并結(jié)合鉬藍(lán)比色法進(jìn)一步測(cè)得羅非魚(yú)頭磷脂各分離組分的含量，發(fā)現(xiàn)羅非魚(yú)頭磷脂中主要以PE、PS、PC和PI為主，其占總磷脂的含量分別為38.7%、9.2%、36.5%和5.7%，其中含量最高的是PE，并比其他海產(chǎn)品（如鱈魚(yú)）和陸生動(dòng)物（如豬內(nèi)臟）的高，PS含量較低，但相比于其他海產(chǎn)品和陸生動(dòng)物卻是比較高的，可以考慮將羅非魚(yú)頭作為PE和PS的開(kāi)發(fā)來(lái)源.實(shí)驗(yàn)還采用質(zhì)譜法對(duì)羅非魚(yú)頭中磷脂的分子類(lèi)型進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在羅非魚(yú)頭中存在著PE、PC、PI和PS四種磷脂，經(jīng)過(guò)解譜，發(fā)現(xiàn)PE分子上連接的脂肪酸分子主要有C14:0，C18: 0，C19:0，C22:0，C23:0，C15:3，C16:4，C18:2，C18:3，C18: 4，C19:1，C20:1，C20:5和C22:6.PS分子上連接的脂肪酸分子主要有C12:0，C18:0，C22:0，C20:5和C22:6.PC分子上連接的脂肪酸分子主要有C12:0，C14:0，C19:1，C20:5和C22:6.PI分子上連接的脂肪酸分子主要有C12:0，C15:1，C20:4，C20:5和C22:6.由此可知，PE分子上連接著種類(lèi)最豐富的不飽和脂肪酸，PS分子上則主要以飽和脂肪酸為主，總之，羅非魚(yú)頭富含磷脂，具有巨大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值.

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A

1673-260X（2016）12-0011-04

2016-09-02